楊雨薇，王琳,盧俊峰，任翔，徐鑫，劉大林

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院(國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室)，江蘇 揚(yáng)州 225009)

隨著全球氣候變暖的不斷加劇，植物正面臨著高溫脅迫的危害。高溫脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)造成的直接傷害表現(xiàn)為植物光合速率降低后葉片出現(xiàn)萎蔫、失綠的現(xiàn)象，與此同時(shí)，植物呼吸速率下降，體內(nèi)的部分有害物質(zhì)無法被清除或降解。部分植物的根部在高溫逆境下會(huì)出現(xiàn)褐變，根系生物量的積累受到抑制從而加速植物的死亡。植物細(xì)胞膜是抵抗高熱脅迫的重要組織，高溫脅迫下植物體內(nèi)的活性氧分子發(fā)生氧化反應(yīng)形成丙二醛，并在植物體內(nèi)積累對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜造成損傷。此外，植物在受到高溫脅迫后蛋白質(zhì)合成受阻，酶活性下降，造成植物體內(nèi)代謝失調(diào)。

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為一種常見的多年生豆科牧草，在我國(guó)北方地區(qū)草地面積較大的區(qū)域種植。除此之外，在南方紫花苜蓿的種植已經(jīng)有了一定的規(guī)模并且發(fā)展前景良好，但其適宜生長(zhǎng)的日平均氣溫為15～21℃，對(duì)高溫極其敏感[1]。我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)常年高溫，夏季最高溫度可達(dá)40℃，對(duì)農(nóng)作物的生產(chǎn)造成諸多不利的影響。紫花苜蓿在南方地區(qū)種植還會(huì)面臨高溫多濕帶來的病蟲害問題。因此高溫脅迫是限制南方地區(qū)紫花苜蓿生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。張鶴山等[2]測(cè)量了19個(gè)紫花苜蓿品種的耐熱性，發(fā)現(xiàn)WL系列品種的耐熱性較強(qiáng)，劉大林等[3]對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿的部分生理生化指標(biāo)做了分析，李德峰[4]分析了夏季苜蓿減產(chǎn)的原因，任翔等[5]通過施加硅酸鉀緩解了紫花苜蓿對(duì)高溫環(huán)境的不良應(yīng)答反應(yīng)。雖然國(guó)內(nèi)眾多學(xué)者對(duì)紫花苜蓿的耐高溫能力進(jìn)行了生長(zhǎng)和生理方面指標(biāo)測(cè)定，但是使用不同指標(biāo)對(duì)紫花苜蓿耐熱性進(jìn)行隸屬函數(shù)綜合分析較少。本研究以10個(gè)紫花苜蓿品種作為試驗(yàn)材料，通過人工氣候培養(yǎng)箱模擬高溫環(huán)境，探究高溫脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗生長(zhǎng)和生理的影響，并對(duì)10個(gè)紫花苜蓿品種的耐高溫能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為我國(guó)多高溫天氣的地區(qū)或夏季持續(xù)高溫地區(qū)紫花苜蓿的種植提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院草業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)室中的10個(gè)紫花苜蓿品種作為試驗(yàn)材料，其特性及編號(hào)見表1。

表1 紫花苜蓿材料特征及編號(hào)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽法進(jìn)行栽培試驗(yàn)，花盆直徑為30 cm，高35 cm，每盆裝過篩(孔徑0.5 mm)風(fēng)干土900 g。選取籽粒飽滿、大小一致的10個(gè)紫花苜蓿品種種子，于5%次氯酸鈉溶液中浸種消毒15 min。每個(gè)品種10盆，每盆播種40粒，播深2 cm。播種21 d后，分別挑選每個(gè)品種長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的6盆植株作為處理材料，其中3盆室溫下放置為對(duì)照組，其余3盆放入人工氣候培養(yǎng)箱中，在38℃光照處理14 h，35℃黑暗處理10 h的模式下進(jìn)行高溫脅迫處理。每個(gè)處理均3次重復(fù)。高溫脅迫處理14 d后對(duì)所有材料進(jìn)行采樣，分別測(cè)其各項(xiàng)生長(zhǎng)和生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)量指標(biāo)與方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 將經(jīng)過14 d處理后的紫花苜蓿植株放入蒸餾水中，將根部清洗干凈，用吸水紙吸干水分，每盆隨機(jī)取10株紫花苜蓿，用剪刀迅速將紫花苜蓿的根、莖、葉分開，用直尺(精度0.1 cm)分別測(cè)其地上和地下部分絕對(duì)長(zhǎng)度，并取平均值；稱量其各部位鮮重，在105℃殺青烘干之后，分別測(cè)量根、莖、葉的干重。

1.3.2 葉綠素含量的測(cè)定 參考施海濤[6]葉綠素測(cè)定方法測(cè)定葉綠素含量，稍有改動(dòng)。在高溫脅迫處理下生長(zhǎng)14 d后，稱取紫花苜蓿的新鮮葉片0.1 g，記為m，將稱取的新鮮葉片放入10 mL的離心管中，隨后在離心管中加入5 mL 95%的乙醇，用錫箔紙包嚴(yán)后黑暗條件下浸提48 h，然后以95%的乙醇作為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)665和649 nm下的吸光度。然后根據(jù)下列方程式計(jì)算葉綠素a含量、葉綠b含量和葉綠素總含量。

Chla(mg/g FW)=(13.95×D665 nm-6.88×D649 nm)×0.005/m

Chlb(mg/g FW)=(24.96×D649 nm-7.32×D665 nm)×0.005/m

Chl(mg/g FW)=Chla+Chlb=(18.08×D649 nm+6.63×D665 nm)×0.005/m

式中：Chla為葉綠素a的含量，Chlb為葉綠素b的含量，Chl為葉綠素的總含量。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量 MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)量[6]。

1.3.4 可溶性糖含量的測(cè)定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[6]。

1.4 抑制率分析

本研究在綜合評(píng)價(jià)時(shí)根據(jù)對(duì)照處理和高溫處理下10個(gè)紫花苜蓿品種各單項(xiàng)指標(biāo)均值，計(jì)算高溫脅迫下10個(gè)紫花苜蓿品種的各單項(xiàng)指標(biāo)的抑制率。 計(jì)算公式為：

a% = (1-W/CK)×100%

式中：a% 表示單項(xiàng)指標(biāo)的抑制率，CK表示對(duì)照處理下該單項(xiàng)指標(biāo)的均值，W表示高溫處理下該單項(xiàng)指標(biāo)的均值。

1.5 耐高溫性綜合評(píng)價(jià)

用隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)方法[7-8]，對(duì)各紫花苜蓿品種的耐熱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。計(jì)算公式如下：

F1(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

F2(Xi)= 1 -(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中：X表示第i個(gè)指標(biāo)值，Xmin表示第i個(gè)指標(biāo)的最小值，Xmax表示第i個(gè)指標(biāo)的最大值。若該指標(biāo)與紫花苜蓿的耐高溫能力呈相反關(guān)系，則采用用反隸屬函數(shù)公式F2計(jì)算其隸屬函數(shù)值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。在0.05置信水平上用Duncan法進(jìn)行多重比較，用Excel 2010作圖，SPSS 19.0 進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗生長(zhǎng)的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個(gè)紫花苜蓿品種的株高、根長(zhǎng)、總生物量、根干重、莖干重和葉干重均低于對(duì)照處理(表2)，表明紫花苜蓿對(duì)于高溫較為敏感并且紫花苜蓿的生長(zhǎng)在高溫條件下受到了脅迫。高溫脅迫下，其葉片鮮重顯著低于對(duì)照(P<0.05)，表明高溫脅迫對(duì)紫花苜蓿葉片生長(zhǎng)有抑制作用。MS10品種的莖鮮重在處理組與對(duì)照組也有顯著性差異(P<0.05)，表明高溫脅迫對(duì)植物莖的生長(zhǎng)也有影響。

表2 高溫脅迫下紫花苜蓿的生長(zhǎng)特性

2.2 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗葉綠素含量的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個(gè)紫花苜蓿品種葉片中的葉綠素a含量均低于對(duì)照組，除MS3、MS8和MS9 3個(gè)品種在高溫脅迫下與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，其余7個(gè)紫花苜蓿品種在高溫脅迫下的葉綠素含量與對(duì)照組的葉綠素含量均有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。此外，高溫脅迫下紫花苜蓿的葉綠素b含量也均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，MS1-MS10分別下降58.90%、42.30%、25.50%、11.90%、35.80%、30.50%、82.60%、28.10%、6.10%和5.80%。與對(duì)照組相比，MS1-MS10高溫脅迫下葉綠素總含量分別下降24.40%、32.60%、10.00%、15.80%、17.80%、10.40%、24.90%、8.70%、3.50%和5.00%。除了MS9和MS10與對(duì)照組無顯著差異，其他品種的葉綠素總量均顯著低于對(duì)照(P<0.05)。

圖1 不同處理下紫花苜蓿葉片中的葉綠素含量Fig.1 Impact of different treatments on chlorophyll content of alfalfa leaves注：不同小寫字母表示同一紫花苜蓿品種在不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.3 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗MDA含量的影響

高溫脅迫處理14 d后，10個(gè)紫花苜蓿品種葉片中的MDA含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，MS1-MS10較對(duì)照組分別上升4.50%、39.20%、5.50%、16.40%、24.60%、18.80%、34.30%、33.10%、7.50%和62.90%，MS10和MS2品種上升幅度較大(圖2)。

圖2 不同處理下紫花苜蓿葉片中的MDA含量Fig.2 Effect of different treatments on MDA content of alfalfa leaves

2.4 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗可溶性糖含量的影響

高溫脅迫下，10個(gè)紫花苜蓿品種幼苗葉片中的可溶性糖含量均高于對(duì)照組。高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中可溶性糖含量與對(duì)照組具有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。高溫脅迫下，MS1-MS10可溶性糖含量較對(duì)照組分別上升72.50%、10.70%、4.90%、19.20%、12.40%、7.50%、27.75%、13.20%、28.00%和19.90%。

圖3 不同處理下紫花苜蓿葉片中的可溶性糖含量Fig.3 Effects of temperature treatments on the content of soluble sugar in alfalfa leaves

2.5 高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種抑制率的影響

2.5.1 高溫脅迫下紫花苜蓿各單項(xiàng)指標(biāo)的抑制率 高溫脅迫下紫花苜蓿各單項(xiàng)指標(biāo)的抑制率如表3所示。

表3 高溫脅迫下10個(gè)紫花苜蓿品種各項(xiàng)指標(biāo)的抑制率

2.5.2 各項(xiàng)指標(biāo)抑制率間的Pearson相關(guān)性分析 株高與莖鮮重呈顯著正相關(guān)，與葉綠素b含量極顯著負(fù)相關(guān)(表4)。根長(zhǎng)與MDA含量呈顯著負(fù)相關(guān)。根鮮重與葉鮮重呈顯著正相關(guān)。葉鮮重與可溶性糖含量

表4 高溫脅迫下紫花苜蓿各項(xiàng)指標(biāo)抑制率間的Pearson相關(guān)性分析

顯著負(fù)相關(guān)。葉綠素b含量與葉綠素總含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。

2.5.3 紫花苜蓿耐熱性評(píng)價(jià) 在利用隸屬函數(shù)對(duì)10個(gè)紫花苜蓿品種的耐熱性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，根據(jù)葉綠素的抑制率與紫花苜蓿的耐高溫能力呈反比例關(guān)系采用反隸屬函數(shù)公式計(jì)算葉綠素含量的隸屬函數(shù)值；可溶性糖含量和MDA含量與紫花苜蓿的高溫敏感性呈正比例關(guān)系，所以用隸屬函數(shù)公式計(jì)算其隸屬函數(shù)值。結(jié)果表明，MS3品種的隸屬函數(shù)值最高，均值為0.84，MS8和MS6次之，均值分別為0.64、0.57。MS10的隸屬函數(shù)值均值僅為0.36，為各品種中最低；MS1和MS2的隸屬函數(shù)值也僅為0.41和0.38，處于較低的水平(表5)。高溫脅迫下紫花苜蓿MS3、MS6和MS8屬于對(duì)高溫耐受力較強(qiáng)的材料，而紫花苜蓿MS1、MS2和MS10則是對(duì)高溫相對(duì)較敏感型材料。

表5 高溫脅迫下10個(gè)品種紫花苜蓿隸屬函數(shù)分析

3 討論

對(duì)不同紫花苜蓿品種進(jìn)行耐熱性評(píng)價(jià)有助于進(jìn)一步探究高溫對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)和生理的影響和培育耐高溫的紫花苜蓿品種。由于長(zhǎng)江中下游地區(qū)夏季高溫天氣溫度維持在38℃左右，所以本研究采用培養(yǎng)箱模擬38℃高溫環(huán)境，探究了高溫脅迫對(duì)10個(gè)紫花苜蓿品種生長(zhǎng)和生理特性的影響，通過隸屬函數(shù)分析進(jìn)行耐熱性綜合評(píng)價(jià)。

根系是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中獲取水分和養(yǎng)分關(guān)鍵的部位，根系的健康狀況對(duì)植物水分和養(yǎng)分的吸收具有重要影響[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下10個(gè)紫花苜蓿品種的根長(zhǎng)和根重均低于對(duì)照組(表2)。據(jù)報(bào)道，在高溫下植株的生長(zhǎng)狀態(tài)普遍表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、枯萎甚至在較高的溫度下部分植株也會(huì)發(fā)生死亡的現(xiàn)象[3]。在夏季最高溫度超過35℃的地區(qū)，紫花苜蓿越夏時(shí)有死亡現(xiàn)象，研究表明溫度越高、脅迫時(shí)間越長(zhǎng)植物生長(zhǎng)狀態(tài)越差[10-11]，且高溫后恢復(fù)生長(zhǎng)的時(shí)間較為緩慢[12-13]，本研究結(jié)果與之一致。此外，本研究中紫花苜蓿植株不同部位的生物量對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)存在差異。本研究認(rèn)為根系的健康狀況將直接影響莖和葉部的水分、養(yǎng)分吸收，根系越健康則植株也越健康，抵抗逆境的能力也就越強(qiáng)。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素。本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫下紫花苜蓿的葉綠素含量均低于對(duì)照組(圖1)。楊秋珍等[14]發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下的甜瓜葉片葉綠素含量呈下降的趨勢(shì)，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)下降的幅度增大，本實(shí)驗(yàn)與其結(jié)果相一致，宰學(xué)明等[15]研究表明在高溫42℃處理過程中，花生幼苗的葉綠素含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，表現(xiàn)為初期下降幅度平緩，后期變化明顯。任翔等[5]研究表明高溫可引起葉綠素分解，導(dǎo)致葉片衰老，高溫使得紫花苜蓿發(fā)生明顯的光抑制作用。其原因可能是高溫脅迫促使ROS形成[16]，破壞ROS和抗氧化體系代謝之間的動(dòng)態(tài)平衡，而葉綠體作為ROS的主要生成位點(diǎn)容易被氧化劑攻擊[17-18]。葉綠素合成受限和自由基對(duì)葉綠素的誘導(dǎo)使高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中的葉綠素含量降低[18-19]。

生理響應(yīng)是植物對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的重要內(nèi)在體現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫處理14 d后10個(gè)紫花苜蓿品種葉片中的MDA含量顯著高于對(duì)照(圖2)，該結(jié)果與劉大林等[3]對(duì)高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中MDA含量變化的規(guī)律一樣。其原因可能是長(zhǎng)期高溫情況下脂類形成了囊泡，從而破壞了膜結(jié)構(gòu)，使膜失去了選擇透性和主動(dòng)吸收能力。此外，高溫破壞了細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡，使得氧化物在細(xì)胞膜內(nèi)大量積累。MDA含量是衡量脂膜過氧化程度的重要指標(biāo)，紫花苜蓿葉片的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞的半透性失效使得細(xì)胞膜中物質(zhì)滲透出來。在高溫脅迫下，MDA在植物體內(nèi)的積累導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)和聚合，影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而對(duì)植物的正常生長(zhǎng)造成直接傷害[20-21]。

可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),當(dāng)植物受到非生物因子脅迫時(shí),滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量會(huì)增加以提高細(xì)胞液的滲透壓,提高細(xì)胞保水能力及從外環(huán)境的吸水能力,從而防止植物脫水,緩解脅迫對(duì)膜系統(tǒng)的損害,保護(hù)和調(diào)節(jié)植物正常生長(zhǎng)[22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下紫花苜蓿葉片中可溶性糖含量均高于對(duì)照組(圖3)，結(jié)果與劉大林等[3]的研究相一致。趙壯軍等[23]通過對(duì)高羊茅初級(jí)代謝產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，根系中的有機(jī)酸和脂肪酸含量較多，而氨基酸、糖類以糖醇普遍積累在植株葉片中。紫花苜蓿可能通過利用糖醇和肌醇的抗氧化能力來更好地適應(yīng)高溫逆境。紫花苜蓿可以將淀粉轉(zhuǎn)化為可溶性糖或通過光合作用直接合成高濃度的可溶性糖來維持紫花苜蓿的呼吸作用[24-25]，從而出現(xiàn)可溶性糖升高的結(jié)果。

本研究中株高、根長(zhǎng)、根莖葉干鮮重、葉綠素含量、MDA含量、可溶性糖含量等生長(zhǎng)、生理指標(biāo)在高溫脅迫前后的變化特征表明，紫花苜蓿不同品種之間不能通過單一的指標(biāo)來準(zhǔn)確判斷其耐熱性的強(qiáng)弱，必須對(duì)多個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合分析與評(píng)價(jià)。近年來，隸屬函數(shù)值法被廣泛應(yīng)用于植物的抗逆性評(píng)價(jià)[26]，該方法已在黃瓜[27]，香菇[28]，大白菜[29]，杜鵑[30]等作物上應(yīng)用，效果良好。隸屬函數(shù)法作為耐熱性評(píng)價(jià)的常用方法，所用的指標(biāo)可分為3種：1)用發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、抗旱指數(shù)等來評(píng)價(jià)；2)用各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值累加求平均來評(píng)價(jià)；3)用各指標(biāo)的相對(duì)值來評(píng)價(jià)[27-29]。在10個(gè)品種中，WL-712系列雖然其秋眠級(jí)較高，但是通過隸屬函數(shù)值分析其耐熱性較差，說明秋眠級(jí)高低與耐熱性強(qiáng)弱并無必然聯(lián)系。本研究采用生長(zhǎng)、生理等13個(gè)指標(biāo)，計(jì)算各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值并累加求平均值來評(píng)價(jià)10個(gè)紫花苜蓿品種的耐熱性，其耐熱性強(qiáng)弱依次為：WL-319HQ>WL65HQ>WL-354>WL-903>WL-168>愛菲>WL-363>三德利>維多利亞>WL-712。

4 結(jié)論

高溫脅迫對(duì)不同紫花苜蓿品種幼苗生長(zhǎng)和生理特性具有一定的影響。具體表現(xiàn)為，高溫處理14 d后的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均低于對(duì)照組；葉綠素含量降低；細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著上升；可溶性糖含量上升。耐熱性綜合評(píng)價(jià)表明，紫花苜蓿WL-319HQ，WL-656HQ和WL-354是高溫耐受型品種， WL-712,三德利和維多利亞是高溫敏感型品種。