閻 華，雷 婷，湯尚文，于 博*，黃升謀，李云捷，吳進菊，李玉奇

(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽 441053；2.湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053)

【研究意義】甲氰菊酯屬于擬除蟲菊酯類殺蟲劑和殺螨劑，具有中等毒性，可以產(chǎn)生觸殺、胃毒和驅(qū)避作用。甲氰菊酯屬于神經(jīng)毒劑，可以作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)昆蟲過度興奮和麻痹后死亡。甲氰菊酯殺蟲譜廣，殺蟲效果快，持效期也較長。最大優(yōu)點是對許多害蟲和螨蟲產(chǎn)生合并防治效果，適合于害蟲和螨蟲并發(fā)環(huán)境。甲氰菊酯適用作物相當(dāng)廣泛，可以應(yīng)用于蘋果、柑橘、荔枝、桃樹、栗樹等，也可以應(yīng)用于棉花、茶樹、十字花科蔬菜、瓜果類蔬菜、花卉等。甲氰菊酯移動速率很低，對環(huán)境影響相對較小，但是該農(nóng)藥殘效期較長，容易通過食物鏈富集作用進入人體，長期危害人體組織。目前，甲氰菊酯農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于茶園中，殘留在茶園土壤中引起環(huán)境污染和茶葉污染，對人體造成急慢性危害。生物原位修復(fù)技術(shù)目前是清除殘留農(nóng)藥的較為有效的方法，逐漸引起研究人員的重視[1]?！厩叭搜芯窟M展】史延華等[2]研究了甲基對硫磷的降解菌特點和特性，并分析了降解產(chǎn)物。甲基對硫磷的降解菌YC-YH1能夠高效降解甲基對硫磷，其含有甲基對硫磷水解酶基因mpd和有機磷水解酶基因oph C2，該細(xì)菌能夠?qū)⒓谆鶎α蛄姿鉃閷ο趸椒雍投谆虼蛩狨?。秦坤等[3]研究了氯氰菊酯降解真菌中農(nóng)藥降解酶的作用特點。真菌中農(nóng)藥降解酶對氯氰菊酯的降解率高達59.8%，該酶對氯氰菊酯酶促降解的最適pH為7.0，最適溫度為30 ℃。劉孝龍等[4]研究了擬除蟲菊酯降解酶的分子改造及降解特點。利用易錯 PCR技術(shù)對新型酯酶基因進行體外定向進化，獲得了酶活性和熱穩(wěn)定性較好的突變酶。其酶活力提高1.5倍; 最適反應(yīng)溫度提高了5 ℃，熱穩(wěn)定性明顯增強。其氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率可以達到92.21%、99.75%、93.21%和89.48%。從環(huán)境中分離篩選和鑒定農(nóng)藥降解菌及其產(chǎn)生的農(nóng)藥降解酶可以清除污染物，具有諸多優(yōu)點：①微生物生長速度和分解速度快，進而使得農(nóng)藥降解速效率提高，特別是農(nóng)藥濃度較低的情況下，降解菌和降解酶也能進行生物修復(fù)作用；②微生物的富集作用和酶的轉(zhuǎn)化作用使農(nóng)藥降解安全無毒副，降解產(chǎn)物可以直接溶解于水體，并隨著河流進入海洋，在光氧化作用下分解；③微生物產(chǎn)生的農(nóng)藥降解酶通常比本身的微生物更能耐受異常環(huán)境，適應(yīng)更廣的溫度和pH值；④農(nóng)藥降解酶的降解譜比農(nóng)藥降解菌寬，可以作用于相同基團的農(nóng)藥?！颈狙芯壳腥朦c】采用生物工程技術(shù)制備農(nóng)藥降解酶，具有效率高、產(chǎn)量大、純度高等優(yōu)點。同時基因工程菌中農(nóng)藥降解酶的生理生化特性，也有利于酶的綜合利用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此本研究在前期獲得陰溝腸桿菌WJ-1的基礎(chǔ)上，采用陰溝腸桿菌WJ-1克隆獲得農(nóng)藥降解酶基因pytZ，通過制備質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化EscherichiacoliBL21后誘導(dǎo)其高效表達，獲得產(chǎn)量高、純度高的重組農(nóng)藥降解酶，并對重組菌農(nóng)藥降解酶學(xué)生理生化特性和應(yīng)用性能進行了研究，為農(nóng)藥降解酶在田間降解甲氰菊酯農(nóng)藥提供實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 陰溝腸桿菌WJ-1為湖北文理學(xué)院微生物學(xué)實驗室低溫保存，采自湖北省襄陽市南漳王冠茶園土壤中，通過劃線技術(shù)分離純化培養(yǎng)獲得。EscherichiacoliBL21菌株和表達載體pET-24a(K+)由廣州市英韋創(chuàng)津生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 基因克隆所用TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶ApaI和BanII、堿性磷酸酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品等由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒等由深圳美博康生物科技有限公司生產(chǎn)；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品等由上海麥特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；基因組DNA提取試劑盒，IPTG、卡那霉素等由上海生物工程股份有限公司生產(chǎn)；引物等由大連寶生物工程有限公司合成。

LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，蒸餾水1 L。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基中添加2.0%的瓊脂，加熱后獲得。LB-卡那霉素培養(yǎng)基：在LB液體或者固體培養(yǎng)基中添加100.0 μg/mL的卡那霉素。TB液體培養(yǎng)基:甘油5.0 g/L，酵母粉24.0 g/L，胰蛋白胨12.0 g/L，KH2PO42.3 g/L，K2HPO416.4 g/L，蒸餾水1 L。TB-卡那霉素培養(yǎng)基：在TB液體培養(yǎng)基中添加30.0 μg/mL的卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 陰溝腸桿菌WJ-1基因組DNA的提取 陰溝腸桿菌WJ-1基因組DNA的提取按照基因組DNA提取試劑盒說明書開展。

1.2.2pytZ基因引物設(shè)計與克隆 根據(jù)GenBank農(nóng)藥降解酶基因pytZ序列(JN248785.2)進行引物設(shè)計，并且加入限制性內(nèi)切酶位點(ApaI和BanII)，用primer5.0軟件設(shè)計PCR引物P1/P2：上游引物P1為5'-GCTTCCATGGGCCCGTCAAGCGATAAGC-3'；下游引物P2為5,-ATAAGCTTATGTGCACGCCGTAAGACGC-3'。然后使用陰溝腸桿菌WJ-1基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系為50 μL：ddH2O 32.5 μL，dNTP混合物5.0 μL，5×PS Buffer 10.0 μL，模板1.0 μL，上游引物P1 0.5 μL，下游引物P2 0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL。PCR擴增條件為：采用90 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃變性20 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。

將PCR擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳操作，將電泳后的PCR產(chǎn)物進行膠回收，回收的DNA在恒溫水浴鍋中72 ℃反應(yīng)10 min，末端加A后進行純化，然后將純化產(chǎn)物連接至pMD19載體,轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB-卡那霉素固體培養(yǎng)基，37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。最后選擇陽性克隆加入LB-卡那霉素液體培養(yǎng)基，并且抽提質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶ApaI和BanII進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳操作，驗證酶切產(chǎn)物，最后送深圳華大基因科技有限公司測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pMD19-pytZ，保存于-80 ℃甘油管。

1.2.3 重組表達載體的構(gòu)建 使用限制性內(nèi)切酶ApaI和BanII分別對pMD19-pytZ重組質(zhì)粒和表達載體pET-24a(K+)進行雙酶切，回收目標(biāo)片段,并用T4連接酶將目標(biāo)基因和表達載體20 ℃連接過夜,轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞,涂布LB-卡那霉素固體培養(yǎng)基,37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。選擇陽性克隆加入LB-卡那霉素液體培養(yǎng)基,并且抽提質(zhì)粒使用限制性內(nèi)切酶ApaI和BanII進行雙酶切，酶切產(chǎn)物送深圳華大基因科技有限公司測序。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pET-24a(K+)-pytZ。測序正確的質(zhì)粒重組轉(zhuǎn)化宿主E.coliBL21，用于表達目標(biāo)蛋白。將重組質(zhì)粒pET-24a(K+)-pytZ和重組后的宿主菌E.coliBL21保存于-80 ℃甘油管。

1.2.4 重組菌E.coliBL21的不同濃度IPTG和不同溫度誘導(dǎo)表達研究 將重組菌E.coliBL21接種于LB-卡那霉素液體培養(yǎng)基,37 ℃,200 r/min培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接上述菌液2.5 mL到50 mL TB-卡那霉素培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600約1.0，再加入0～1.0 mmol/L IPTG，在15～55 ℃，200 r/min進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。從而分別研究不同誘導(dǎo)劑IPTG濃度和不同的誘導(dǎo)溫度對重組菌E.coliBL21產(chǎn)農(nóng)藥降解酶的影響，每個因素做3個重復(fù)。

1.2.5 重組菌E.coliBL21的生長曲線測定和重組菌農(nóng)藥降解酶的制備 為了檢測重組菌E.coliBL21的生長狀態(tài)，在培養(yǎng)后的0～60 h分別取樣1 mL培養(yǎng)液，測量菌體的OD600。同時取5 mL培養(yǎng)液離心收集菌體，去離子水洗滌3次，再用1 mL 50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液懸浮菌體，超聲破碎(破碎3 s，間歇3 s，總時間10 min)，離心后獲得上清液即為重組菌農(nóng)藥降解酶。

1.2.6 可溶性蛋白含量的測定和農(nóng)藥降解酶活力測定 可溶性蛋白質(zhì)含量測定方法采用Folin-酚法，參照文獻開展[5]。甲氰菊酯濃度測定使用氣相色譜法，參考文獻操作[6]。農(nóng)藥降解酶活力測定參考文獻操作[7]。農(nóng)藥降解酶活力單位(U)定義為每分鐘降解1 mg甲氰菊酯所需的酶量。

1.2.7 重組菌農(nóng)藥降解酶的酶學(xué)特性研究 酶促反應(yīng)最適溫度測定：用0.005 mol/L的磷酸緩沖液將1.2.5獲得的重組菌農(nóng)藥降解酶濃度稀釋為0.01 mg/mL，將稀釋后的重組菌農(nóng)藥降解酶在15～65 ℃分別保持60 min，隨后檢測重組菌農(nóng)藥降解酶活力，使用酶活力最高值為基準(zhǔn)，計算不同溫度的相對活力[8]，相對活力數(shù)值最高所對應(yīng)的溫度判定為酶促反應(yīng)最適溫度。

酶促反應(yīng)最適pH值測定：使用0.005 mol/L的磷酸緩沖液把1.2.5獲得的重組菌農(nóng)藥降解酶稀釋成濃度為0.01 mg/mL，將稀釋后的重組菌農(nóng)藥降解酶pH值調(diào)節(jié)為5.0～11.0分別保持60 min，隨后檢測重組菌農(nóng)藥降解酶活力，使用酶活力最高值為基準(zhǔn)，計算不同pH值的相對活力[9]，相對活力數(shù)值最高所對應(yīng)的pH值判定為酶促反應(yīng)最適pH值。

酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定：用0.005 mol/L的磷酸緩沖液把1.2.5獲得的重組菌農(nóng)藥降解酶稀釋成濃度為0.01 mg/mL的液體，并配制成濃度為0.5～5.0 mmol/L的甲氰菊酯溶液，最適條件下進行反應(yīng)，以單位時間底物減少量來計算反應(yīng)初速率V。并使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法獲得回歸方程計算重組菌農(nóng)藥降解酶對底物甲氰菊酯的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)基因pytZ的克隆

采用陰溝腸桿菌WJ-1的基因組DNA為擴增模板和引物P1/P2進行PCR擴增獲得農(nóng)藥降解酶基因pytZ。將PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，證實pytZ基因大小為1186 bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。將目標(biāo)基因pytZ與pMD19載體分別使用ApaI和BanII雙酶切，并連接轉(zhuǎn)化EscherichiacoliJM109感受態(tài)細(xì)胞，提取E.coliJM109質(zhì)粒用ApaI和BanII進行雙酶切后，再次使用瓊脂糖凝膠電泳驗證(圖2)，證實得到1937和1186 bp 2個DNA片段，與預(yù)期結(jié)果一致。通過華大基因測序后結(jié)果顯示目標(biāo)基因pytZ全長為1186 bp，編碼463個氨基酸，通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST軟件比對，與pytZ基因序列(JN248785.2)相似度高達96%，蛋白質(zhì)序列相似度高達97%?？梢酝茢鄰年帨夏c桿菌WJ-1中獲得的目標(biāo)基因為農(nóng)藥降解酶基因pytZ。

2.2 pytZ基因重組表達載體的構(gòu)建

將測序正確的pMD19-pytZ質(zhì)粒使用ApaI和BanII進行雙酶切后，再和同樣進行ApaI和BanII雙酶切的表達載體pET-24a(K+)連接，并轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，再次提取E.coliJM109質(zhì)粒，用ApaI和BanII進行雙酶切后，再次使用瓊脂糖凝膠電泳驗證(圖3)，證實得到4785和1186 bp的2個DNA片段，所以重組表達質(zhì)粒pET-24a(K+)-pytZ構(gòu)建成功。

2.3 重組菌E.coli BL21產(chǎn)農(nóng)藥降解酶的誘導(dǎo)條件

2.3.1 最佳IPTG誘導(dǎo)濃度的測定 將2.2驗證正確的重組質(zhì)粒pET-24a(K+)-pytZ轉(zhuǎn)化受體菌EscherichiacoliBL21感受態(tài)細(xì)胞，并涂布LB-卡那霉素固體平板，挑取單菌落加入LB-卡那霉素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接2.5 mL菌液到TB-卡那霉素液體培養(yǎng)基，菌體生長至OD600為1.0時，分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG濃度對重組菌E.coliBL21進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。如圖4所示，重組菌E.coliBL21的OD600隨著IPTG濃度增加出現(xiàn)降低；而重組菌農(nóng)藥降解酶的活力隨著誘導(dǎo)劑濃度增加出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，IPTG的濃度低于0.8 mmol/L時，重組菌農(nóng)藥降解酶活力隨著IPTG濃度增加而提高，在IPTG濃度為0.8 mmol/L時，農(nóng)藥降解酶活力達到15.3 U/mL；IPTG誘導(dǎo)濃度高于0.8 mmol/L時，重組菌農(nóng)藥降解酶活力隨著IPTG濃度增加而下降。因此，重組菌產(chǎn)農(nóng)藥降解酶的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8 mmol/L。

2.3.2 最佳誘導(dǎo)溫度的測定 將2.2驗證正確的重組質(zhì)粒pET-24a(K+)-pytZ轉(zhuǎn)化受體菌E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在LB-卡那霉素固體平板上，挑取單菌落加入LB-卡那霉素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接2.5 mL菌液到TB-卡那霉素液體培養(yǎng)基，菌體生長到OD600為1.0時，以不同的誘導(dǎo)溫度15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃分析重組菌E.coliBL21的生長速度和產(chǎn)農(nóng)藥降解酶的關(guān)系(圖5)。重組菌E.coliBL21的OD600隨著誘導(dǎo)溫度的增加先提高后降低，30 ℃時重組菌的OD600最高為6.7；而重組菌E.coliBL21的農(nóng)藥降解酶活力則隨著溫度升高先增加后降低，30 ℃時酶活最高為15.1 U/mL。因此，重組菌E.coliBL21產(chǎn)農(nóng)藥降解酶的最佳溫度為30 ℃。

2.4 重組pET-24a(K+)-pytZ質(zhì)粒在受體菌E.coli BL21受體菌的表達

重組菌E.coliBL21加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG，30 ℃，200 r/min條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h，OD600大約為6.6，農(nóng)藥降解酶活力達到15.3 U/mL。對重組菌農(nóng)藥降解酶進行SDS-PAGE電泳鑒定，重組菌E.coliBL21中成功表達得到分子量約為49.2 kDa的蛋白，達到預(yù)期結(jié)果(圖7)。

2.5 重組菌農(nóng)藥降解酶的酶學(xué)特性

2.5.1 酶促反應(yīng)最適溫度測定 重組菌農(nóng)藥降解酶酶促反應(yīng)的最適溫度為35 ℃(圖8)，在25～45 ℃重組菌農(nóng)藥降解酶活力較穩(wěn)定。溫度影響重組菌農(nóng)藥降解酶促反應(yīng)主要表現(xiàn)在兩方面[11]：一方面，重組菌農(nóng)藥降解酶催化效率會因為溫度的升高而增加。本研究中，當(dāng)溫度從15 ℃上升到35 ℃時，農(nóng)藥降解酶活力從41%上升到100%；另一方面，溫度過高會引發(fā)重組菌農(nóng)藥降解酶蛋白變性，重組菌農(nóng)藥降解酶活力會下降甚至喪失。當(dāng)溫度從35 ℃上升到65 ℃時，農(nóng)藥降解酶活力從100%下降到31%。

2.5.2 酶促反應(yīng)最適pH值測定 溶液pH值對重組菌農(nóng)藥降解酶活力的影響是多方面的。pH可以改變酶分子構(gòu)象和酶活力中心性能，進而改變重組菌農(nóng)藥降解酶活力；pH可以改變酶的解離狀態(tài)，進而影響重組菌農(nóng)藥降解酶活力[12]。將重組菌農(nóng)藥降解酶分別置于不同pH值進行酶促反應(yīng)，以最高酶活為100%(圖9)，重組菌農(nóng)藥降解酶酶促反應(yīng)的最適pH值為8.0，pH 7.0～9.0農(nóng)藥降解酶活力較為穩(wěn)定，證明重組菌農(nóng)藥降解酶屬于酸性水解酶。當(dāng)pH值低于8.0時，重組菌農(nóng)藥降解酶活力隨pH值降低而減小，在pH 5.0時重組菌農(nóng)藥降解酶相對活力大約為35%。當(dāng)pH值高于8.0時，重組菌農(nóng)藥降解酶活力隨pH值上升而減小，在pH 11.0時農(nóng)藥降解酶相對活力大約為29%。

2.5.3 酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定 本研究將酶促反應(yīng)初速率倒數(shù)1/v和底物濃度倒數(shù)1/[S]進行Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，獲得線性回歸方程后計算酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)(圖10)。重組菌農(nóng)藥降解酶對底物甲氰菊酯的水解作用符合米氏常數(shù)方程Y=0.276X+0.512，校準(zhǔn)系數(shù)R2為0.993，表明該曲線擬合良好，由線性回歸方程計算得到Km為0.076 mmol/L，Vmax為3.023 mmol/(L·min)。

3 討 論

3.1 農(nóng)藥降解酶的降解作用

隨著人們生活水平提高，近年來越來越多的人開始關(guān)注食品中農(nóng)藥殘留問題，農(nóng)藥降解酶可以降解農(nóng)藥，在未來必然會有著巨大的市場發(fā)展?jié)摿?。目前居民對于食品常用的辦法是洗滌，市面常用的蔬菜和水果洗滌劑只能夠去除果、蔬表面雜質(zhì)、油漬和污漬。但是很難消除果、蔬表面的農(nóng)藥殘留。前人研究表明，傳統(tǒng)洗滌劑只能消除約30%的表皮農(nóng)藥殘留，添加農(nóng)藥降解酶的果蔬清洗劑則可以清除約75%的表皮農(nóng)藥殘留[13-15]，大大提升了消除效果。RUAN Z Y等[1]研究了擬除蟲菊酯降解酯酶，研究發(fā)現(xiàn)YZ-1中存在的降解酶對甲氰菊酯降解率為78%，最適合pH值為6.5，溫度為35 ℃。最優(yōu)溫度，pH值，農(nóng)藥濃度等均優(yōu)于農(nóng)藥降解菌。秦坤等[3]從真菌TS-203獲得的降解酶，該降解酶對氯氰菊酯的降解率為59.8%，降解氯氰菊酯的pH值為7.0，溫度為30 ℃，該酶具有良好的穩(wěn)定性和耐溫性，該酶能有效降解氯氰菊酯，該酶屬于胞內(nèi)酶。WU C等[5]研究了從ZD112獲得的擬除蟲菊酯降解酯酶特性，研究發(fā)現(xiàn)降解酶對聯(lián)苯菊酯降解率為69%，最適合pH值為7.5，溫度為30 ℃，具有較好的生物修復(fù)作用。LEE Y S 等[16]從活性污泥中分離出AP01菌株，該菌株能夠降解擬除蟲菊酯農(nóng)藥，提示存在降解酶。降解酶能降解各種擬除蟲菊酯。最佳溫度和pH分別為35 ℃和7.5，具有良好的環(huán)境友好性。LIANG W Q等[17]從活性污泥中分離出ZD11菌株，該菌株存在水解酶，能夠降解擬除蟲菊酯農(nóng)藥。最佳溫度和pH分別為30 ℃和7.0，具有良好的環(huán)境適應(yīng)性。本研究重組菌農(nóng)藥降解酶的酶學(xué)特性和其他研究人員的類似。酶促反應(yīng)最適溫度為35 ℃，最適pH值為8.0，在溫度25～45 ℃和pH 7.0～9.0范圍內(nèi)，重組菌農(nóng)藥降解酶具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。因此，生物法尤其是生物酶類，在處理擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留時，具有操作簡單、安全高效、應(yīng)用范圍廣且無二次污染等優(yōu)點[18-20]，逐漸成為菊酯類農(nóng)藥殘留生物修復(fù)的研究熱點。

3.2 基因工程技術(shù)對農(nóng)藥降解能力的提升作用

國內(nèi)外的科學(xué)研究人員使用基因工程手段從環(huán)境中篩選到各種菊酯類農(nóng)藥降解酶基因，并構(gòu)建了異源表達工程菌，有助于獲得降解譜廣、降解能力強等優(yōu)點的降解酶，為微生物降解農(nóng)藥開辟了新的途徑[21-22]。劉孝龍等[4]研究了擬除蟲菊酯降解酶的分子改造及降解特性研究，得到較為均一和有效的農(nóng)藥降解酶。獲得了一個酶活性和熱穩(wěn)定性均提高的突變酶EstM46。與野生型相比其酶活力提高 1.5倍; 最適反應(yīng)溫度提高了5 ℃，同時熱穩(wěn)定性明顯增強。此外，EstM46 對氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分別提升至 92.21%、99.75%、93.21%和89.48%。YU X W,et al.[18]將13個管家基因通過基因工程轉(zhuǎn)化于綠膿桿菌中，得到優(yōu)良的農(nóng)藥降解酶，該酶的溫度適應(yīng)性提高10 ℃以上，可以應(yīng)用于更多的植物生長環(huán)境。YANG Z H等[23]將功能性基因表達以后，分析單一氯氰菊酯的異構(gòu)降解效果，研究發(fā)現(xiàn)單一氯氰菊酯的降解效率提高，可以通過基因工程技術(shù)得到更好的降解酶。本研究技術(shù)和其他研究人員類似，將農(nóng)藥降解酶基因pytZ克隆表達于宿主菌EscherichiacoliBL21，得到的重組菌農(nóng)藥降解酶對甲氰菊酯具有良好的水解作用。該農(nóng)藥降解酶基因重組表達于宿主菌EscherichiacoliBL21是同源表達，表達效率比較高、操作比較簡單、應(yīng)用效果比較好。因此，基因工程制備技術(shù)可以獲得產(chǎn)量和純度更高的農(nóng)藥降解酶[24-25]。

4 結(jié) 論

最優(yōu)化誘導(dǎo)條件為30 ℃，0.8 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)48 h后，重組菌農(nóng)藥降解酶活力為15.3 U/mL。酶促反應(yīng)最適溫度為35 ℃，最適pH值為8.0，在溫度25～45 ℃和pH 7.0～9.0范圍內(nèi)，重組菌農(nóng)藥降解酶具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。酶促反應(yīng)動力學(xué)測定表明，重組菌農(nóng)藥降解酶對底物甲氰菊酯的Km為0.076 mmol/L，Vmax為3.023 mmol/(L·min)。