李 曼，李巧琪，廖 真，林標(biāo)聲，魯國(guó)東，林占熺

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350002; 2.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002; 3.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364012; 4.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002)

【研究意義】植物內(nèi)生固氮菌是指能夠在玉米、水稻、牧草等許多植物體內(nèi)定殖并進(jìn)行聯(lián)合固氮作用的一類(lèi)微生物[1]，其在植物體內(nèi)占據(jù)著重要生態(tài)位，通過(guò)聯(lián)合固氮作用為宿主植物提供氮素或其他促生長(zhǎng)物質(zhì)[2-4]。植物內(nèi)生固氮菌的種類(lèi)不同，為寄主提供氮源的效率、產(chǎn)生植物激素類(lèi)物質(zhì)、促進(jìn)宿主的生理變化也不同[5]。nifH基因是固氮微生物菌株最保守的功能基因[6-7]，是固氮微生物研究的理想遺傳標(biāo)記，nifH基因作為編碼固氮酶的結(jié)構(gòu)基因在生物固氮中發(fā)揮著重要作用[8]。蘆竹屬菌草(Arundosp.)綠洲屬多年生禾本科植物，其有粗而多節(jié)的根莖，莖稈直立、根系發(fā)達(dá)，綠洲不僅可以避免大面積水土流失，而且能大量吸收保持地表水，生長(zhǎng)快，覆蓋性強(qiáng)，具有耐寒、耐高溫、耐旱、耐鹽堿及抗逆性強(qiáng)等優(yōu)良特點(diǎn)。開(kāi)發(fā)內(nèi)生固氮菌不僅可以作為微生物制劑或菌肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)中，也可以為進(jìn)一步豐富和完善禾本科植物內(nèi)生固氮菌種質(zhì)資源庫(kù)奠定理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出 ,由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR 從定性到定量的飛躍 ,而且與常規(guī) PCR技術(shù)相比，它具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn), 目前廣泛應(yīng)用于研究mRNA的表達(dá)、各種基因定量分析、單核苷酸多態(tài)性分析、DNA甲基化的檢測(cè)及對(duì)各種傳染病進(jìn)行定量定性分析等[9]。目前已有不少學(xué)者研究禾本科植物內(nèi)生固氮菌nifH基因，但關(guān)于蘆竹屬菌草綠洲固氮基因nifH的報(bào)道較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究將qRT-PCR技術(shù)應(yīng)用于蘆竹屬菌草樣本固氮基因nifH的定性定量分析，旨在豐富和完善禾本科植物內(nèi)生固氮菌種質(zhì)資源庫(kù)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)qRT-PCR技術(shù)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)到5種蘆竹屬菌草成熟期根部?jī)?nèi)生固氮菌nifH基因的拷貝數(shù)及相對(duì)表達(dá)量的變化情況。

1 材料與方法

1.1 樣本的采集及處理

樣本采集于福建農(nóng)林大學(xué)城菌草種植基地，分5個(gè)樣區(qū)采集5種綠洲，每個(gè)樣區(qū)分3個(gè)樣點(diǎn)，每個(gè)樣點(diǎn)隨機(jī)選取1株菌草，5個(gè)樣區(qū)共采集15株菌草綠洲成熟期的根部帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 培養(yǎng)基及主要儀器

1.2.1 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基[10]，LB固體培養(yǎng)基[11]。

1.2.2 主要儀器 主要儀器如表1所示。

表1 主要儀器及型號(hào)

1.3 樣品的表面消毒

樣本采集結(jié)束后，先用流水沖洗1～2 h,再依次用75%乙醇浸泡2 min，2%次氯酸鈉浸泡5 min后，用無(wú)菌水沖洗4次，再將最后一次沖洗后的無(wú)菌水洗滌液涂布于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d，以此檢驗(yàn)消毒是否徹底[12]。

1.4 基因組DNA的提取、固氮基因nifH可變區(qū)擴(kuò)增及qRT-PCR

采用快速無(wú)毒DNA提取試劑盒，提取5種綠洲成熟期根部DNA，提取完成后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳觀(guān)察提取的基因組DNA片段并測(cè)其OD值。以提取的基因組DNA為模板，采用PCR儀擴(kuò)增固氮功能基因nifH的片段。引物序列為nifH-F5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′，nifH-R5′-T TGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′[13]。PCR，qRF-P CR反應(yīng)體系及程序如表2所示。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，使用Axy Prep DNA 凝膠回收試劑盒回收目的片段。向PCR管中加入4 μL膠回收片段，從表面小心吸取1 μL質(zhì)粒，加入管中，用稍大的槍?zhuān)p輕混勻20次左右，用手加熱5 min至30 ℃左右。向1.5 mL EP管中加入感受態(tài)的大腸桿菌50 μL，再加入連接產(chǎn)物5 μL，輕輕混勻，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，水浴5 min，結(jié)束后向EP管中加入600 μL LB液體培養(yǎng)基(此過(guò)程須在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行)，37 ℃，150 r/min，培養(yǎng)2 h。轉(zhuǎn)化成功后涂布于含有氨芐卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)24 h后觀(guān)察平板菌落生長(zhǎng)狀況，挑選白色菌落作為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，并提取質(zhì)粒作為樣本nifH基因絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品。提取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品從101～105進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度取2 μL作為反應(yīng)模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

表2 PCR、qRT-PCR反應(yīng)體系及程序

1.5 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、nifH基因的擴(kuò)增及qRT-PCR

使用TRIzol Reagent提取各樣本RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及微量核酸測(cè)定儀測(cè)其OD值。隨后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄總體系 20 μL，其中Master Mix 10 μL、SUPERSCRIPT Ⅱ Reverse Transcriptase 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimerScript Buffer2 4.0 μL、RNase-free H2O 4.0 μL。將各樣本的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，設(shè)計(jì)nifH(目的基因)及16S(內(nèi)參基因)兩對(duì)引物分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物序列分別為nifH如表2所示，16S-F5′-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3′；16S-R5′-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3′。PCR反應(yīng)總體系如表2所示，建立溶解曲線(xiàn)后，將cDNA樣品模板進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?梯度，各檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔。選用16S作為內(nèi)參基因，與目的基因nifH分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，獲取兩個(gè)基因的擴(kuò)增曲線(xiàn)、溶解曲線(xiàn)及Ct值，按2-ΔΔCt法分析所獲得的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果和分析

2.1 蘆竹屬菌草成熟期根樣本nifH基因定量分析

如圖1-a所示，5個(gè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線(xiàn)較光滑，傾斜度較大，呈現(xiàn)典型的S型曲線(xiàn)，且各循環(huán)閾值間隔較均勻。根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)提供的標(biāo)準(zhǔn)品各梯度稀釋濃度反應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct值)，繪制出反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖1-b)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=-3.053X+40.509,相關(guān)系數(shù)R2=0.99，斜率K=-3.053。樣本擴(kuò)增曲線(xiàn)各線(xiàn)后期均趨于平穩(wěn)；溶解曲線(xiàn)中各樣本曲線(xiàn)均為單一尖銳峰，未出現(xiàn)其他雜峰，Tm為81.47 ℃，故不存在非特異擴(kuò)增產(chǎn)物或引物二聚體。

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)測(cè)定了5種蘆竹屬菌草成熟期根樣本nifH基因的拷貝數(shù)(圖2)，5種蘆竹屬菌草成熟期根nifH基因拷貝數(shù)逐步遞減，拷貝數(shù)差異較大，其中，綠洲1號(hào)nifH基因拷貝數(shù)最高，達(dá)8.84×1011/g；綠洲5號(hào)nifH基因拷貝數(shù)最低，達(dá)1.54×1011/g，各樣本差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.2 蘆竹屬菌草成熟期根樣本的nifH基因相對(duì)表達(dá)量分析

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)測(cè)定5種蘆竹屬菌草內(nèi)生固氮菌nifH基因的相對(duì)表達(dá)量(圖3)，所得原始數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法定量計(jì)算公式進(jìn)行相對(duì)定量分析，即綠洲2、3、4、5號(hào)樣品目的基因nifH相對(duì)于參照樣品綠洲1號(hào)相對(duì)表達(dá)量的差異(圖4)，結(jié)果表明，綠洲2號(hào)成熟期根樣本固氮nifH基因表達(dá)量最高，約為15.69，已達(dá)到過(guò)表達(dá)水平；而綠洲1號(hào)nifH基因表達(dá)量最低，其數(shù)值為0.84，綠洲2號(hào)nifH基因相對(duì)表達(dá)量為綠洲1號(hào)的18倍。其中，綠洲2號(hào)差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其余各樣本差異均不顯著。

3 討 論

本文采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了5種蘆竹屬菌草內(nèi)生固氮菌nifH基因的拷貝數(shù)及相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，5種蘆竹屬菌草成熟期根樣本固氮基因nifH的拷貝數(shù)及相對(duì)表達(dá)量均存在較大的差異。在定量分析中，樣本拷貝數(shù)的變化呈逐步遞減趨勢(shì)，綠洲1號(hào)樣本nifH基因拷貝數(shù)最高，且各樣本nifH基因拷貝數(shù)差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)；在定性分析中，綠洲2號(hào)樣本nifH基因相對(duì)表達(dá)量則最高，呈過(guò)表達(dá)水平，且差異達(dá)到顯著水平，而綠洲1號(hào)固氮基因nifH的表達(dá)量最低。

由于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明禾本科植物內(nèi)生固氮菌大部分來(lái)自成熟期根部，侯偉等[14]研究發(fā)現(xiàn)分離得到的 40 株內(nèi)生固氮菌絕大多數(shù)來(lái)源于根內(nèi)，這種分布趨勢(shì)與固氮菌本身屬性有關(guān)。林標(biāo)聲等[15]研究發(fā)現(xiàn)巨菌草在同一生長(zhǎng)時(shí)期的內(nèi)生固氮菌群豐度和多樣性均是根>葉>莖，且根的固氮酶活性在成熟期達(dá)到最高。毛曉潔[16]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)分離到的玉米內(nèi)生固氮菌從門(mén)、綱、目、屬、種5個(gè)分類(lèi)學(xué)等級(jí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明其多樣性為根部>葉部>莖部，與林標(biāo)聲等[15]的研究結(jié)果一致。因此，本研究選擇5種蘆竹屬菌草成熟期根部?jī)?nèi)生固氮菌作為研究對(duì)象，以檢測(cè)其固氮基因nifH在mRNA水平上的表達(dá)情況和定量變化情況。

綜上所述，結(jié)果表明，該5種蘆竹屬菌草成熟期根樣本內(nèi)生固氮菌nifH基因的拷貝數(shù)及表達(dá)量均存在較大差異，綠洲1號(hào)nifH基因拷貝數(shù)最高，達(dá)8.84×1011/g；而固氮基因nifH相對(duì)表達(dá)量則是綠洲2號(hào)最高，且呈過(guò)表達(dá)水平。蘆竹屬菌草作為栽培食藥用菌的栽培料，是荒漠化地區(qū)恢復(fù)植被的優(yōu)良草種[17]，是喂養(yǎng)食草性動(dòng)物適口的飼料，且植物內(nèi)生菌的研究已經(jīng)成為當(dāng)前微生物學(xué)的熱點(diǎn)之一，是待開(kāi)發(fā)的資源寶庫(kù)[18-19]。因此，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)5種菌草成熟期根部nifH基因的拷貝數(shù)及相對(duì)表達(dá)量，檢測(cè)結(jié)果表明，綠洲1號(hào)根部固氮菌的數(shù)量較多，綠洲2號(hào)根部固氮酶活性較強(qiáng)，該結(jié)果為今后植物固氮領(lǐng)域的研究及內(nèi)生固氮菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。