張 楊

（廣元市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，四川廣元 628000）

大腸菌群是世界上大多數(shù)國家和組織評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要安全性指標之一，因和腸道致病菌有密切的相關(guān)性，大腸菌群在食品微生物指標體系中占有重要地位，被稱為糞便污染指示菌[1]。2020年度四川省市場監(jiān)督管理局組織開展食品安全監(jiān)督專項抽檢，其中28批次大腸菌群不符合食品安全國家標準，主要不合格產(chǎn)品為瓶裝飲用水、糕點、調(diào)味品、餐具等。大腸菌群超標反映出食品企業(yè)衛(wèi)生狀況不達標，可能與加工原料受污染、產(chǎn)品的滅菌不徹底、衛(wèi)生操作規(guī)范執(zhí)行不嚴格、包裝材料受污染等原因有關(guān)[2]。食品微生物實驗室的常規(guī)檢驗項目包含大腸菌群檢驗，是絕大部分食品都會要求檢驗的項目。檢驗大腸菌群方法有很多種，本次盲樣考核要求采用平板計數(shù)法，適用于大腸菌群含量較高的食品。

1 材料與方法

1.1 盲樣來源和保存

由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心下發(fā)玻璃瓶包裝的凍干塊狀樣品，樣品到達實驗室后，按盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書要求立即放入-15 ℃以下的冰箱中保存。

1.2 培養(yǎng)基試劑和儀器設(shè)備

本次盲樣考核中使用的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（以下簡稱VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（以下簡稱BGLB）均由青島海博生物技術(shù)有限公司提供，并進行性能試驗且在有限期內(nèi)，符合使用要求。

生化培養(yǎng)箱、電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、生物安全柜等。

1.3 方法

按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）第二法大腸菌群平板計數(shù)法進行檢驗[3]。

1.3.1 樣品制備

需要用總計40 mL滅菌生理鹽水再水化，即本次凍干的樣品等同于40 mL的食品樣品。首先從冰箱中取出盲樣使其達到室溫后，將西林瓶無菌開啟，立即加入4 mL滅菌生理鹽水進行再水化，凍干塊狀樣品溶解后，放入準備的無菌錐型瓶中，再反復(fù)用余下的生理鹽水清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌錐型瓶中，此溶液為待測樣品原液[4]。

1.3.2 樣品稀釋

用無菌吸管吸取25 mL待測樣品原液，放入盛有225 mL無菌生理鹽水中振搖，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 mL注入9 mL無菌生理鹽水試管中，混合均勻，制成1∶100的樣品勻液，按上述操作以此類推稀釋至1∶10 000。每稀釋一次，換一根無菌吸管。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板計數(shù)

吸取1∶10～1∶10 000稀釋度樣品勻液1 mL于無菌平皿中，每個稀釋度做2個無菌平皿，同時取1 mL無菌生理鹽水加入無菌平皿中作空白對照。將平皿中倒入融化并恒溫46 ℃的VRBA瓊脂15～20 mL，并小心轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻，待瓊脂凝固后，再加入3～4 ml VRBA覆蓋平板表層，翻轉(zhuǎn)后置于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果見表1。

表1 平板計數(shù)結(jié)果統(tǒng)計分析

2.2 菌落的選擇和證實試驗

經(jīng)培養(yǎng)后，VRBA平板上均出現(xiàn)0.5～3 mm紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)的菌落。由表1可知，只有1∶1 000稀釋度的菌落數(shù)在計數(shù)范圍之內(nèi)，從1:1 000稀釋度的兩個VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落分別接種到BGLB肉湯管中，（36±1）℃培養(yǎng)48 h后10支BGLB肉湯管均出現(xiàn)產(chǎn)氣現(xiàn)象。

2.3 大腸菌群平板計數(shù)的報告

該盲樣的大腸菌群數(shù)為：

40×10/10 ×103mL=4.0×104CFU/mL。

2.4 項目結(jié)果評價

本次食品中大腸菌群（定量）檢測項目盲樣考核結(jié)果評價為滿意。

3 結(jié)論與討論

（1）參加考核前，要認真閱讀盲樣考核作業(yè)指導(dǎo)書，按其要求對待測樣品進行前處理。由于食品中微生物的數(shù)量和種類會隨著環(huán)境的改變而出現(xiàn)消長，故食品微生物盲樣樣品很少提供食品實物，多數(shù)為人工模擬樣品的凍干粉形式出現(xiàn)。對于定量項目來說凍干塊的樣品為一個樣品單元，它是一個不可分割的整體，不能僅用一部分來檢驗，其次樣品的均勻性也會對檢驗結(jié)果造成直接影響，因此要在無菌條件下將樣品充分混勻后隨機取樣。

在日常檢驗工作中首先需根據(jù)產(chǎn)品選擇適當?shù)臋z測方法，若食品中大腸菌群含量較低，可選擇半定量計數(shù)MPN法，而大腸菌群較多的食品則可以選擇定量計數(shù)平板法[5]。其次，要選擇合適的稀釋度，稀釋度越高，檢驗人員的工作量越大，稀釋度選擇太低，平板上的菌落數(shù)又多不可計算?！妒称钒踩珖覙藴?食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）中要求選擇2～3個適宜的連續(xù)稀釋度，但作為盲樣考核，為了保證數(shù)據(jù)的準確性，需要根據(jù)實際情況多選擇幾個稀釋度，同時檢驗過程中盡量選取雙人雙平行同步檢驗，減少人員誤差。

（2）培養(yǎng)基對目標微生物檢出的準確性起重要作用，使用培養(yǎng)基時應(yīng)嚴格按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）進行制備和驗證。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂作為選擇性培養(yǎng)基是不需要進行滅菌的，煮沸2 min即可使用，該培養(yǎng)基需現(xiàn)配現(xiàn)用，不得超過3 h。在檢驗過程中，為防止有遷徙性細菌生長蔓延，對觀察結(jié)果造成影響，必須待第一次傾注的VRBA凝固后，再將其覆蓋一層，其目的是隔絕空氣，降低需氧菌生長速度。

為了提高大腸菌群的檢出率這就要求平時要多觀察VRBA平板上大腸菌群的不同形態(tài)，并挑取菌落進行BGLB肉湯管證實試驗，這樣才能對大腸菌群的各種形態(tài)了然于心，防止檢驗工作中錯檢漏檢。

（3）驗證試驗時，為了降低檢驗過程中的誤差，挑取菌落時需注意典型菌落和可疑菌落的比例。《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）要求選取菌落數(shù)在15～150 CFU的平板，挑取10個不同類型典型和可疑菌落，少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落進行BGLB發(fā)酵驗證試驗，但是并未說明每個平板挑取10個還是兩個平板總共挑取10個。如果平板上菌落形態(tài)單一，則兩個平板總共挑取10個進行驗證，若平板上菌落形態(tài)差異較大，則最好是每個平板上挑取10個菌落進行驗證，并且對典型和可疑菌落按照比例挑取驗證，最終計算結(jié)果時，還需要分別計算典型菌落的陽性率和可疑菌落的陽性率。

提高實驗室質(zhì)量控制是為了確保檢驗工作的準確性，為產(chǎn)品質(zhì)量評價提供可靠的依據(jù)。積極參加盲樣考核和能力驗證活動，是對實驗室技術(shù)能力和管理狀況進行考核的方法之一，也是保證實驗室資質(zhì)質(zhì)量的重要手段，對實驗室質(zhì)量控制十分重要。