嵇朝球 許翊坤 虞睿睿 馬中良

摘 ?要： 以農(nóng)作物秸稈，包括水稻秸稈、玉米秸稈和甘蔗渣為材料，采用分光光度法比較了煙曲霉、綠色木霉、枯草芽孢桿菌的處理效果.實驗結(jié)果顯示：總乙醇產(chǎn)量最高的是甘蔗渣，其乙醇體積分數(shù)為6.285%;而玉米秸稈和水稻秸稈相差甚微，分別是6.200%和6.195%.用2% （體積分數(shù)）氫氧化鈉溶液預(yù)處理甘蔗渣，再用煙曲霉在28 ℃下降解甘蔗渣，最后用缺陷型酵母發(fā)酵預(yù)處理濾液和煙曲霉降解液20～25 h，可以提高木質(zhì)纖維素降解、轉(zhuǎn)化乙醇的效率.

關(guān)鍵詞： 秸稈; 纖維素; 乙醇; 降解; 效率

Abstract： In this study， stems of crops， including straw of rice， stalk of corn and bagasse， were used as fermentation materials. The hydrolysis treatment effects of Aspergillus fumigatus， Trichoderma viride and Bacillus subtilis were compared via spectrophotometry. The results showed that the highest yield of ethanol was from bagasse with eventually volume fraction of ethanol in total was 6.285% volume fraction. The difference of yields between corn straw and rice straw was slightly， which were 6.200% and 6.195% respectively. Using 2% NaOH pretreating sugarcane bagasse， then using Aspergillus fumigatus to degradeat 28 ℃， 20-25 h fermentation of pretreated filtrate with defective yeast and Aspergillus fumigatus degradation solution， it can improve the degradation efficiency of the lignocellulose conversion.

Key words： straw; cellulose; ethanol; degradation; efficiency

0 ?引 言

隨著全球經(jīng)濟的持續(xù)高速發(fā)展，人們對能源的需求加速增長，也同時加重了環(huán)境污染[1].近年來，以從農(nóng)作物秸稈中得到的木質(zhì)纖維素為原料，生產(chǎn)乙醇的研究日益受到重視[2-3].雖然木質(zhì)纖維素往往具有分布分散、能量密度小、熱值低和成分復(fù)雜等缺點，但在可再生能源中，木質(zhì)纖維素制備的燃料乙醇具有方便儲存與運輸?shù)膬?yōu)點，在世界各國都得到充分重視和應(yīng)用發(fā)展[4-5].因此，開展對提高木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化效率的研究具有重要的現(xiàn)實意義.

木質(zhì)纖維素主要由纖維素（40%～50%，質(zhì)量分數(shù)）、半纖維素（25%～35%，質(zhì)量分數(shù)）和木質(zhì)素（15%～20%，質(zhì)量分數(shù)）構(gòu)成[6-7].目前利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的技術(shù)已基本成熟.經(jīng)預(yù)處理[8-9]后，木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)乙醇的過程可以分為兩步：第一步把纖維素水解為葡萄糖等可發(fā)酵的糖，即糖化過程[10-11];第二步將發(fā)酵液發(fā)酵為乙醇[12].

由于木質(zhì)素、半纖維素對纖維素的保護作用，以及纖維素自身的晶體結(jié)構(gòu)， 使得催化劑很難與纖維素接觸，必須對纖維素原料進行預(yù)處理，以除脫木質(zhì)素，避免多糖的降解和損失，以及產(chǎn)生副產(chǎn)品，同時降低成本[13].水解主要有兩種方法，即酸水解[14]和酶水解，木質(zhì)纖維原料的酶水解是利用纖維素酶、半纖維素酶將纖維素、半纖維素轉(zhuǎn)化為可被利用的葡萄糖和戊糖[15-16].發(fā)酵過程是木質(zhì)纖維原料中的纖維素先經(jīng)纖維素酶降解成葡萄糖，葡萄糖再經(jīng)發(fā)酵菌株發(fā)酵生成乙醇[17-19].如何優(yōu)化木質(zhì)纖維素預(yù)處理，選擇合適的發(fā)酵菌種，降低成本，提高發(fā)酵效率及乙醇的獲取率，是目前的研究難點[20-21].根據(jù)本實驗室前期的數(shù)據(jù)，本文作者選用質(zhì)量分數(shù)為2%的氫氧化鈉（NaOH）溶液對3種木質(zhì)纖維素進行預(yù)處理[22]，并結(jié)合專一性強且無污染酶水解法進行轉(zhuǎn)化.通過比較，發(fā)現(xiàn)選擇煙曲霉作為發(fā)酵菌種可降低生產(chǎn)成本，提高轉(zhuǎn)化效率.

1 ?材料與方法

1.1 材 ?料

實驗所用的水稻秸稈、玉米秸稈、甘蔗渣均取自南寧普建糖酒化工設(shè)備有限公司;實驗所用化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司和上海生工生物工程股份有限公司;煙曲霉、綠色木霉枯草芽孢桿菌和缺陷型酵母為上海大學(xué)微生物實驗室保存，均購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心;所使用的Czapeks Agar察氏瓊脂培養(yǎng)基、Potato Dextrose Agar （PDA）培養(yǎng)基、Luria-Bertani （LB）培養(yǎng)基、Yeast Extract Peptone Adenine Sulfate （YPDA）培養(yǎng)基均由實驗室自配.

1.2 方 ?法

1.2.1 DNS（3，5-二硝基水楊酸）分光光度法測定葡萄糖[23]

用分光光度法測量各濾液中的葡萄糖含量，方法為：取0.1 g葡萄糖溶于100 mL水，配制成質(zhì)量濃度為1 mg?mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液;取6.5 g DNS溶于少量熱蒸餾水，溶解后移入1 000 mL容量瓶，加入325 mL物質(zhì)的量濃度為2 mol?L-1的NaOH和5 g丙三醇，搖勻，冷卻定容至1 000 mL. 10 h后取出濾渣稱重.

1.2.2 原子力顯微鏡（AFM）視圖

用原子力顯微鏡（安捷倫AFM5500）分別觀察未處理、預(yù)處理后，和僅有煙曲菌處理的甘蔗渣形貌.

1.2.3 不同木質(zhì)纖維素的堿法預(yù)處理

取4 g NaOH固體溶解于蒸餾水中定容至200 mL（共6份），配制成質(zhì)量分數(shù)為2%的NaOH溶液.將準(zhǔn)備的10 g水稻秸稈（編號A組，共兩份：A1，A2），10 g玉米秸稈（編號B組，共兩份：B1，B2），10 g甘蔗渣（編號C組，共兩份：C1，C2）分別加入200 mL的上述NaOH溶液中，室溫條件下?lián)u24 h后，用紗布分別過濾6份混合液，得到6份濾渣，放入80 ℃烘箱10 h，得到6份濾液，用量筒測量濾液體積.制作DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用分光光度法測量各濾液中的葡萄糖含量.

1.2.4 對堿法預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素開展不同菌種的降解處理

取10 g水稻秸稈于6個錐形瓶中，編號1～6.分別加入200 mL質(zhì)量分數(shù)為2%的NaOH溶液，略微振蕩，放入37 ℃搖床中，放置24 h后取出過濾，濾渣80 ℃烘箱烘干，收集濾液.刮取全部濾渣并測定其干重.冷凍菌種的活化（綠色木霉、煙曲霉）后對應(yīng)接種在PDA平板和察氏瓊脂平板上，28 ℃下培養(yǎng).將枯草芽孢桿菌接種在LB平板上，37℃下培養(yǎng).接種缺陷型酵母菌于3塊YPDA平板，放恒溫箱中，24 h后分別向培養(yǎng)基中倒入一次擴大過的3種菌液，搖床24 h.從恒溫箱中取出活化好的酵母菌，分別接種到12支YPDA試管中，搖床24 h.將12瓶待發(fā)酵液過濾，濾渣烘干，所有待發(fā)酵液以4 000 r?min-1轉(zhuǎn)速離心10 min.用分光光度法測量12瓶待發(fā)酵液中葡萄糖的含量.調(diào)控12瓶待發(fā)酵液的pH值為7.每瓶取40 mL的液體，分別與4 mL的YPDA培養(yǎng)基混合（共12瓶），放入搖床中，在37 ℃和200 r?min-1轉(zhuǎn)速條件下，每隔4 h定時取樣.

1.2.5 煙曲霉處理不同木質(zhì)纖維素

分別取10 g水稻秸稈、玉米秸、甘蔗渣置于6個錐形瓶中，編號1～6.各加入200 mL質(zhì)量分數(shù)為2%的NaOH溶液，略微振蕩，放入37 ℃搖床中，放置24 h后過濾，得到的濾渣80 ℃烘干，收集濾液.從察氏瓊脂液體培養(yǎng)基上挑少量煙曲霉，放入試管液體培養(yǎng)基內(nèi)，輕輕振蕩.在28 ℃搖床放置24 h后，接種在察氏瓊脂平板上，28 ℃下培養(yǎng).24 h后將煙曲霉接種到察氏瓊脂培養(yǎng)基試管中，放入搖床24 h.接種缺陷型酵母菌于3塊YPDA平板，在恒溫箱中放置24 h后，向200 mL察氏瓊脂培養(yǎng)基中倒入一次擴大過的菌液，搖床24 h.從恒溫箱中取出活化好的酵母菌，分別接種到12支YPDA試管中（4 mL菌種培養(yǎng)液放入40 mL待發(fā)酵液中），搖床24 h.將12瓶待發(fā)酵液過濾（6瓶堿處理，6瓶菌處理），濾渣烘干24 h.所有待發(fā)酵液以4 000 r?min-1離心10 min.用分光光度法測量12瓶待發(fā)酵液中葡萄糖的含量.調(diào)控12瓶待發(fā)酵液的pH值為7，每瓶取40 mL的液體，分別與4 mL的YPDA培養(yǎng)基混合（共12瓶），放入搖床，在37 ℃和200 r?min-1轉(zhuǎn)速條件下，每隔4 h定時取樣.

2 ?結(jié)果與分析

2.1 3種木質(zhì)纖維素相同堿預(yù)處理結(jié)果比較

用2%NaOH溶液堿預(yù)處理秸稈，用DNS分光光度法（標(biāo)準(zhǔn)曲線公式y(tǒng)=0.737 6x-0.086 8）計算反應(yīng)體系中葡萄糖含量，結(jié)果如圖1所示.

由圖1可知：經(jīng)2%NaOH溶液堿預(yù)處理后，水稻秸稈的木質(zhì)纖維素成分被降解的程度最高，玉米秸稈次之，甘蔗渣被降解程度最低.在相同堿預(yù)處理前提下，應(yīng)選用水稻秸稈作為后續(xù)發(fā)酵工藝的材料.

2.2 不同菌種降解預(yù)處理結(jié)果比較

10 g水稻秸稈先經(jīng)過2%NaOH處理，再經(jīng)過不同菌處理，得到待測液中的葡萄糖含量，如圖2所示.

由圖2可知：煙曲霉組的水稻秸稈在兩次處理后共產(chǎn)葡萄糖936.10 mg;綠色木霉組兩次處理后共產(chǎn)葡萄糖884.18 mg;枯草芽孢桿菌兩次處理后共產(chǎn)葡萄糖388.63 mg.因此，煙曲霉是菌處理的最佳選擇.

將綠色木霉和煙曲霉做進一步比較，煙曲霉發(fā)酵效果比綠色木霉好（圖3），理想發(fā)酵時間大約是20～25 h.同時堿處理理想發(fā)酵時間也為20～25 h（圖4）.

2.3 原子力顯微鏡觀察不同處理下的甘蔗渣

通過AFM圖能更直觀地觀察幾種處理方法的差別.未處理的甘蔗渣形貌圖中有大塊較規(guī)律排布的白色區(qū)域，它們是比較完整的纖維結(jié)構(gòu)，如圖5（a）所示.用2%NaOH處理過的甘蔗渣纖維結(jié)構(gòu)不夠清晰，整個結(jié)構(gòu)松散模糊，代表堿溶液已經(jīng)基本將整個纖維結(jié)構(gòu)打散，將木質(zhì)素有效地分離，并開始分解纖維素，如圖5（b）所示.而僅用煙曲霉處理的甘蔗渣有一部分為比較清晰的纖維狀物質(zhì)，但周圍出現(xiàn)比較松散模糊的結(jié)構(gòu)，說明煙曲霉雖分解了一部分纖維素，但還有不少纖維被木質(zhì)素包裹，不能利用，如圖5（c）所示.

2.4 煙曲霉處理不同木質(zhì)纖維素結(jié)果比較

取水稻秸稈、玉米秸稈、甘蔗秸稈各10 g，經(jīng)2% NaOH處理后，再經(jīng)煙曲霉降解處理、發(fā)酵.因為經(jīng)堿處理過后的濾液發(fā)酵效果大體一致，所以主要比較3種木質(zhì)纖維素經(jīng)過煙曲霉降解后的乙醇產(chǎn)量，如圖6所示，可知甘蔗渣發(fā)酵效果最好.

由實驗結(jié)果可知，最優(yōu)發(fā)酵處理組合為：先用2%NaOH溶液對甘蔗進行處理，有效地剝離木質(zhì)素，釋放出纖維素;再用煙曲霉對濾渣進行處理，將多糖有效地降解為單糖，在最適pH值為7的條件下用腺嘌呤缺陷型酵母菌對其進行發(fā)酵20～25 h.但即便如此，得到的乙醇體積分數(shù)仍不足7%，其原因主要是木質(zhì)纖維素甘蔗渣還未被充分降解.一方面，由于煙曲霉是新引進的發(fā)酵菌種，對其培養(yǎng)和擴大所需的條件還未有深入研究，所培養(yǎng)的菌株還未處于最高的活性狀態(tài);另一方面，在發(fā)酵過程中取樣時，乙醇容易揮發(fā)，這會直接導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量不穩(wěn)定和產(chǎn)量過低.

3 ?結(jié) 論

本文初步研究了木質(zhì)纖維素降解轉(zhuǎn)化乙醇的處理方法組合，先用質(zhì)量分數(shù)為2%的NaOH溶液對甘蔗渣進行預(yù)處理，能有效地剝離木質(zhì)素，釋放出纖維素;再用煙曲霉對濾渣進行進一步處理，將多糖有效地降解為單糖，在pH值為7的最適條件下，用腺嘌呤缺陷型酵母菌將其發(fā)酵20～25 h.實驗結(jié)果表明：該處理組合可有效降低生產(chǎn)成本，提高轉(zhuǎn)化效率.

參考文獻：

[1] TOOR M， KUMAR S， MALYAN K， et al. An overview on bioethanol production from lignocellulosic feedstocks [J]. Chemosphere，2020，242：125080.

[2] BAJWA S， POURHASHEM G， ULLAH H， et al. A concise review of current lignin production， applications， products and their environmental impact [J]. Industrial Crops and Products，2019，139：111526.

[3] 曾麟， 安玉興， 李奇?zhèn)? 以甘蔗為原料生產(chǎn)燃料乙醇的技術(shù)經(jīng)濟分析 [J]. 甘蔗糖業(yè)，2006（2）：15-18.

ZENG L， AN Y X， LI Q W. Technical， economic and environmental analysis of fuel ethanol production from sugarcane in China [J]. Sugarcane and Canesugar，2006（2）：15-18.

[4] LIAO H， KOELEWIJIN F， VAN G， et al. A sustainable wood biorefinery for low-carbon footprint chemicals production [J]. Science，2020，367（6484）：1385-1390.

[5] 李奇?zhèn)ィ?戚榮， 張遠平. 能源甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇的發(fā)展前景 [J]. 甘蔗糖業(yè)，2004（5）：29-33.

LI Q W， QI R， ZHANG Y P. Development prospect of fuel ethanol production from energy sugarcane [J]. Sugarcane and Canesugar，2004（5）：29-33.

[6] 李松， 楊榮仲， 譚裕模. 我國發(fā)展能源甘蔗研究生產(chǎn)的現(xiàn)實意義 [J]. 廣西蔗糖，2003（3）：44-45.

LI S， YANG R Z， TAN Y M. Research and production of energy sugarcane in China [J]. Guangxi Sugar Industry，2003 （3）：44-45.

[7] 魏建華， 宋艷茹. 木質(zhì)素生物合成途徑及調(diào)控的研究進展 [J]. 植物學(xué)報，2001，43（8）：771-779.

WEI J H， SONG Y R. Recent Advances in study of lignin biosynthesis and manipulation [J]. Journal of Integrative Plant Biology，2001，43（8）：771-779.

[8] ROBAK K， BALCEREK M. Review of second generation bioethanol production from residual biomass [J]. Food Technology ang Biotechnology，2018，56（2）：174-187.

[9] 張蔭雷，李莉，戴天紜，等. 預(yù)處理方法對玉米秸稈利用的影響 [J]. 纖維素科學(xué)與技術(shù)，2009，17（3）：35-38.

ZHANG Y L， LI L， DAI T Y， et al. Effects of pretreatment on degradation of corn stalk [J]. Journal of Cellulose Science and Technology，2009，17（3）：35-38..

[10] REZANIA S， ORYANI B， CHO J， et al. Different pretreatment technologies of lignocellulosic biomass for bioethanol production： an overview [J]. Energy，2020，199：117475.

[11] 薛惠琴， 杭怡瓊. 稻草秸稈中木質(zhì)素、纖維素測定方法的研討 [J]. 上海畜牧醫(yī)通訊，2001（2）：15.

XUE H Q， HANG Y Q. Study on determination method of lignin and cellulose in straw [J]. Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2001（2）：15.

[12] MARTIN C， MARCET M， ALAMZAN O， et al. Adaptation of a recombinant xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strain to a sugarcane bagasse hydrolysate with high content of fermentation inhibitors [J]. Bioresource Technology，2007，98（3）：1767-1773.

[13] 保國裕， 楊斌， 呂燕萍， 等. 蔗渣水解液發(fā)酵乙醇的研究 [J]. 生物工程學(xué)報，1997（4）：380-386.

BAO G Y， YANG B， LYU Y P， et al. Research on fermentation hydrolysate of sugarcane bagasse to ethanol [J]. Chinese Journal of Biotechnology，1997（4）：380-386.

[14] 李春光， 周偉鐸， 田魏，等. 甘蔗渣纖維素提取及木質(zhì)素與半纖維素脫除工藝探討 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（4）：316-320.

LI C G， ZHOU W Q， TIAN W， et al. Study on extraction of cellulose and removal of hemicelluloses and lignin from bagasse [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，2011，27（4）：316-320.

[15] 陳為健， 程賢避， 陳躍先，等. 硫酸法測定花生殼中木質(zhì)素的含量 [J]. 閩江學(xué)院學(xué)報，2002，23（2）：72-74.

CHEN W J， CHENG X B， CHEN Y X， et al. The method of sulfate acid to determinate the content of the peanut coat lignin [J]. Journal of Minjiang University，2002，23（2）：72-74.

[16] BRUINEUBERG P M， DIJKEN J V， SCHEFFERS W A. An enzymic analysis of NADPH production and consumption in Candida utilis [J]. Joural of General Microbiology，1983，129（4）：956-971.

[17] KIM D. Physico-chemical conversion of lignocellulose： inhibitor effects and detoxification strategies： a mini review [J]. Molecules，2018，23（2）：309.

[18] 楊斌， 李寶璋， 高孔榮. 乙醇連續(xù)發(fā)酵與膜超濾耦合過程研究 [J]. 華南理工大學(xué)學(xué)報，1995（10）：8-15.

YANG B， LI B Z， GAO K R. Research of process of ethanol continuous fermentation coupling with separation by CA-Ti UF tubular membrane [J]. Journal of South China University of Technology，1995（10）：8-15.

[19] 李莉， 余天棟， 王德韜，等. 木質(zhì)素降解菌shu-0801降解玉米廢棄物的研究 [J]. 生物技術(shù)，2010，20（2）：80-82.

LI L， YU T D， WANG D T， et al. Ligin-degrading bacterium shu-0801 degrading corn waste [J]. Biotechnology，2010，20（2）：80-82.

[20] 李艷利， 張蔭雷， 劉迎， 等. 一株新粘細菌生物學(xué)性質(zhì)的研究 [J]. 微生物學(xué)通報，2008，35（12）：1881-1891.

LI Y L， ZHANG Y L， LIU Y， et al. The bioactivities of a new Myxobacterium [J]. Microbiology，2008，35（12）：1881-1891.

[21] 黃祖新， 陳由強， 張彥定， 等. 甘蔗生產(chǎn)燃料乙醇發(fā)酵技術(shù)的進展 [J]. 釀酒科技，2007（10）：81-84.

HUANG Z X， CHEN Y Q， ZHANG Y D， et al. Advances on fermenting technology of fuel ethanol production from sugarcane [J]. Liquor-Making Science and Technology，2007（10）：81-84.

[22] ROSALES-CALDERON O， ARANTES V. A review on commercial-scale high-value products that can be produced alongside cellulosic ethanol [J]. Biotechnology for Biofuels，2019，12（1）：240.

[23] 史貝裔，劉洋，虞睿睿，等. 生物預(yù)處理對甘蔗渣轉(zhuǎn)化的影響 [J]. 廣州化學(xué)，2012，37（2）：1868-1876.

SHI B Y， LIU Y， YU R R， et al. The study of the efficient conversion of bagasse to ethanol [J]. Guangzhou Chemistry， 2012，37（2）：1868-1876.

[24] CHEN H Z， LIU U Y， YANG X X， et al. New process of maize stalk amination treatment by steamexplosion [J]. Biomass Bioenergy，2005，28（4）：411-417.

[25] 崔永強， 林燕， 華鑫怡， 等. 木質(zhì)纖維素為原料的燃料乙醇發(fā)酵技術(shù)研究進展 [J]. 化工進展，2010，29（10）：1868-1876.

CUI Y Q， LIN Y， HUA X Y， et al. Progress in fuel ethanol production from lignocellulosic biomass [J]. Chemical Industry and Engineering Progress，2010，29（10）：1868-1876.

[26] 虞志強， 余水靜， 李昆太， 等. 生物轉(zhuǎn)化食用菌菌糠木質(zhì)纖維素產(chǎn)燃料乙醇的研究進展 [J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2015，41（5）：235-239.

YU Z Q， YU S J， LI K T， et al. Research progresses on bioconversion of spent mushroom substrate lignocellulose for fuel ethanol production [J]. Food and Fermentation Industries，2015，41（5）：235-239.

（責(zé)任編輯：顧浩然）