何凡 阮劍 寧曉潔 王靜

(武漢市第一醫(yī)院 1甲乳外科，湖北 武漢 430022；2婦科)

骨膜蛋白(POSTN) 是一類由POSTN基因編碼的糖蛋白，是基質(zhì)細胞蛋白的一種〔1〕。POSTN參與多種生理和病理過程。生理情況下，POSTN在膠原纖維原形，傷口愈合等過程中起到重要作用〔2〕。同時POSTN在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程中起到關(guān)鍵作用，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胚胎發(fā)育的過程中是必不可少的〔3〕。POSTN還在骨骼和牙齒結(jié)構(gòu)的矯正〔4〕，心臟發(fā)育過程中起到一定作用〔5〕。近些年來，有不少的研究顯示，POSTN還在腫瘤的形成中起到一定作用，然而其具體作用的機制卻仍未被闡明。最開始的研究認為，POSTN與表達在癌細胞膜表面的整合素受體結(jié)合，并通過加速癌細胞的血管生成和新陳代謝而加速其發(fā)展〔6～11〕。新的研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌和大腸癌中，POSTN能通過與整合素αvβ3 和 αvβ5相互作用，誘發(fā)蛋白激酶B(AKT/PKB)信號通路的活動〔12，13〕。除此之外，研究人員還發(fā)現(xiàn)POSTN能夠增強在腫瘤干細胞中Wnt信號通路的活動〔14〕。抑制乳腺癌細胞中POSTN與整合素的結(jié)合，能有效抑制乳腺癌細胞的代謝水平和擴散能力〔15〕。正是由于POSTN在多種腫瘤細胞中的高表達，更多的研究熱點是希望將其作為腫瘤診斷的標記物。在不同類型腫瘤患者中，癌細胞中高水平表達的POSTN往往與較差的預(yù)后相關(guān)。這些患者的生存周期顯著縮短，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險明顯提高，癌癥復(fù)發(fā)的概率也會增加，同時還有更高程度的耐藥性出現(xiàn)〔16～19〕。相同的結(jié)果也在離體腫瘤細胞系實驗中被證實，即高表達POSTN的腫瘤細胞系表現(xiàn)出更強的侵略性與更強的代謝能力〔20，21〕。有研究表明22，POSTN的表達在浸潤性導管癌(IDC)與非浸潤性乳腺導管原位癌(DCIS)中是不同的，然而其具體關(guān)系仍有待探究。本研究比較不同類型離體乳腺癌細胞系中POSTN的mRNA與蛋白質(zhì)的表達水平。

1 材料與方法

1.1細胞系 人乳腺癌細胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。其中MCF-7細胞系代表侵入性較弱的乳腺癌細胞，其表達雌激素受體(ER)，孕激素受體(PR)及原癌基因人類表皮生長因子受體(HER)2。SK-BR-3與MCF-7細胞系的侵入性近似，表達PR與HER2，但是不表達ER。MDA-MB-231的侵入性最強，且不表達ER，PR與HER2。

1.2乳腺癌病理材料 收集2015年1月至2018年12月武漢市第一醫(yī)院病理科材料共計94例，其中DCIS材料44例，IDC材料50例，由高年資病理醫(yī)師復(fù)核組織切片，結(jié)合臨床表現(xiàn)及影像學資料。

1.3主要試劑與儀器 α-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國Gibic公司，實驗中用到的抗體購自美國Abcam公司，RNA提取試劑盒RNeasy mini kit購于德國Hilden公司，反轉(zhuǎn)錄所需要的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Applied Biosystems公司，免疫組化工具Autostainer Link 48購于丹麥Dako公司。

1.4方法

1.4.1RNA的分離 cDNA合成與實時定量PCR所有RNA均通過RNeasy mini kit提取。通過DM-2000測定提取的RNA的濃度和純度，并使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄POSTN mRNA引物由寶生物(大連)工程有限公司合成，選用β-actin作為內(nèi)參，序列：POSTN上游：GCCATAACATCGGACATA、下游：CTCCCATAATAGACTCAGAAC，退火溫度60℃；β-actin上游：ACACTGTGCCCATCTACGAGG、下游：AGGGGCCGGACTCGTCATACT，退火溫度60℃。POSTN的定量分析通過ΔΔCt 方法。

1.4.2Western印跡檢測 取各細胞系的細胞并用放射免疫沉淀粉析液(RIPA)裂解液提取蛋白分別標記。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度后，去除蛋白并加入等體積的上樣緩沖液后煮沸5 min。將變形的蛋白溶液50 μg/孔等量上樣，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后用電轉(zhuǎn)膜儀將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%脫脂奶粉中封閉，并加入以1∶200稀釋的兔源一抗過夜，Tris-Hcl緩沖鹽吐溫溶液(TBST)洗膜后用辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶2 000)進行雜交，孵育1 h。洗膜后加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進行顯色，并放入凝膠成像掃描儀下掃描，使用Image J進行灰度值定量分析。

1.4.3免疫熒光 細胞用4%多聚甲醛溶液固定12 min，并用PBST溶液孵育10 min。之后細胞中加入POSTN一抗，放入4℃過夜。之后使用二抗進行熒光染色，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)標記細胞核位置。細胞封片后使用共聚焦激光顯微鏡拍攝。

1.4.4免疫組化 腫瘤標本用4%甲醛溶液固定，脫水并石蠟包埋。使用Autostainer Link 48進行免疫組化反應(yīng)。標本脫蠟后使用Target Retrieval Solution溶液修復(fù)抗原。標本使用兔源一抗室溫孵育20 min后繼續(xù)用二抗孵育20 min，并用DAB顯色。標本用蘇木素復(fù)染，并用酒精干燥脫水，二甲苯透明，封片，用BX41光學顯微鏡觀察。

1.5統(tǒng)計學方法 用GraphPad Prism軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1不同乳腺癌細胞系中POSTN mRNA表達的差異 對三種乳腺癌細胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231中POSTN mRNA進行PCR檢測，MDA-MB-231細胞系的POSTN mRNA表達(16.21±1.82)明顯多于SK-BR-3和MCF-7(10.12±0.48、2.32±0.24，均n=4，F(xiàn)=159.582，P=0.000)，SK-BR-3細胞系的POSTN mRNA表達明顯多于MCF-7(P<0.001)。

2.2不同乳腺癌細胞系中POSTN 蛋白質(zhì)表達的差異 對三種乳腺癌細胞系MCF-7，SK-BR-3和MDA-MB-231中POSTN蛋白質(zhì)水平進行Western印跡檢測，MDA-MB-231細胞系的POSTN 蛋白表達(2.16±0.15)明顯多于SK-BR-3和MCF-7(1.48±0.19、1.02±0.09，均n=4，F(xiàn)=59.178，P=0.000)，SK-BR-3細胞系的POSTN 蛋白表達明顯多于MCF-7(P<0.000 1)，見圖1。

圖1 Western印跡檢測三種乳腺癌細胞系中POSTN的表達

2.3不同乳腺癌細胞系中POSTN 蛋白表達免疫熒光結(jié)果 對三種乳腺癌細胞系進行POSTN蛋白染色發(fā)現(xiàn)結(jié)果與Western印跡結(jié)果類似，MDA-MB-231細胞系的POSTN 蛋白質(zhì)表達(21.35±2.65)明顯多于SK-BR-3和MCF-7(15.36±2.11、9.25±0.56，均n=4，F(xiàn)=37.261，P=0.000)。見圖2。

圖2 POSTN蛋白在三種細胞系表達的熒光染色

2.4臨床DCIS與IDC病理標本POSTN蛋白質(zhì)組化結(jié)果 對DCIS與IDC病理標本進行POSTN蛋白組化染色發(fā)現(xiàn)，IDC標本中的POSTN(1.20±0.40，n=50)顯著多于DCIS(1.01±0.50，n=44；t=2.045，P=0.046)。

3 討 論

乳腺癌是中國女性最常見的癌癥之一，并且近年來乳腺癌發(fā)病率和死亡率也有明顯的上升趨勢。高侵襲性乳腺癌由于其易復(fù)發(fā)，易轉(zhuǎn)移的特點，難以通過手術(shù)等常規(guī)方法根除，因此早發(fā)現(xiàn)早治療成了提高患者生存率的最有效方法，對于癌細胞的早期診斷技術(shù)也是目前研究的熱點。目前有文獻報道，POSTN在乳腺癌細胞和腫瘤相關(guān)纖維母細胞中都有高表達，且在30%～60%的其他類型癌癥細胞中也有異常表達〔22，23〕。然而POSTN蛋白表達水平與乳腺癌侵襲性的相互關(guān)系卻鮮有報道。

POSTN這類糖蛋白被認為是大量表達于細胞外基質(zhì)，并參與多種生理和病理過程，然而新的研究通過Western印跡和免疫組化技術(shù)，發(fā)現(xiàn)相對于正常細胞，POSTN在癌細胞的細胞核內(nèi)和細胞質(zhì)中也有高表達〔24，25〕。同時POSTN的表達與癌癥細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度呈正相關(guān)關(guān)系〔17〕。這提示我們胞內(nèi)POSTN的表達可以很好地作為檢測乳腺癌水平的診斷標志。

本實驗在小鼠上的實驗也證明高表達POSTN的腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移風險更大，腫瘤惡化概率更高〔25〕，證明了POSTN與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系。同時我們臨床DCIS與IDC病理標本也證明了，在侵襲性強的IDC乳腺癌標本中，POSTN的表達顯著高于DCIS標本。類似的臨床研究顯示，伴有淋巴轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的外泌體中，POSTN的含量顯著高于未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者，并且POSTN高表達的患者的生存率低于POSTN低表達患者〔26〕。這些結(jié)果提示，POSTN的表達是與乳腺癌發(fā)展程度相關(guān)的，并且可以作為衡量其發(fā)展程度的生物學標志。

綜上，POSTN在乳腺癌細胞中的表達程度與乳腺癌細胞的侵襲性相關(guān)，高侵襲性的乳腺癌細胞中的POSTN表達含量明顯增多，并且離體細胞系的結(jié)果與臨床病理標本的結(jié)果一致。但POSTN在高侵襲性乳腺癌細胞中表達上調(diào)的機制不完全清楚，仍需進一步研究驗證。