張?zhí)熨Y 王彥夫 曉琴 謝飛 李冉 詹艷 韓立坤

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院 1眼科，內(nèi)蒙古 通遼 028000;2內(nèi)分泌科)

視網(wǎng)膜光損傷是指光照強(qiáng)度過大或光照時(shí)間過長對(duì)視網(wǎng)膜造成的損害。研究表明視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷的3條途徑為過氧化物介導(dǎo)，視紫紅質(zhì)介導(dǎo)和細(xì)胞凋亡〔1,2〕。光損傷可導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層和色素上皮層損傷〔3〕，且與凋亡相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)相關(guān)。因此，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡是預(yù)防和治療視網(wǎng)膜光損傷疾病的重要途徑。蒙藥古日古木-13治療青光眼等視神經(jīng)損傷類疾病的療效確切〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)蒙藥日古木-13能對(duì)視神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)以蒙藥古日古木-13對(duì)視神經(jīng)損傷的保護(hù)和治療作用為出發(fā)點(diǎn)，觀察光損傷小鼠視網(wǎng)膜的功能和組織結(jié)構(gòu)的變化及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、caspase-8、caspase-9、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)情況，評(píng)估蒙藥古日古木-13對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用及抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的鼠齡7～8 w SPF級(jí)雄性C-57小鼠40只，體重18～22 g。飼養(yǎng)條件：按照晝夜節(jié)律，光照12 h(80 lux,6∶00～18∶00)，避光12 h，溫度：18～25℃，相對(duì)濕度：40%～65%，未限制攝食飲水。入組前所有小鼠經(jīng)常規(guī)檢查雙眼前節(jié)及眼底，以排除屈光介質(zhì)混濁和眼底異常。

1.2藥物與試劑 RIPA裂解液、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、Marker、多聚甲醛、75%甲醛、生理鹽水和戊巴比妥鈉鹽均購自Beyotime生物科技；羊抗鼠、β-actin抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、caspase-3 抗體、caspase-8 抗體和caspase-9抗體均購自ABCOM-Technology forerunner；阿托品眼用凝膠購自沈陽興齊制藥；左氧氟沙星眼用凝膠購自湖北東勝制藥，蒙藥古日古木-13由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.3主要儀器 眼電生理檢測儀購自法國邁威；眼科手術(shù)器械及顯微手術(shù)器械均購自新華醫(yī)療器械；超凈工作臺(tái)購自日本Airtech，光學(xué)顯微鏡、倒置相差顯微鏡、體式顯微鏡和熒光導(dǎo)致顯微鏡IX70均購自日本Olympus；Thermo酶標(biāo)儀全自動(dòng)高壓滅菌器、平衡離心機(jī)、低速離心機(jī)和微量移液器均購自美國Thermo Fisher；純水機(jī)POSEIDON-R150購自銳思捷科學(xué)儀器；-80℃超低溫冰箱購自日本SANYO；酶標(biāo)儀550型購自美國Bio-Rad。

1.4動(dòng)物分組、模型建立及給藥 將小鼠隨機(jī)分成5組：正常組(8只)，對(duì)照組(8只)和治療組(24只)。其中，治療組隨機(jī)分為3組：治療高劑量組(8只)、治療中劑量組(8只)、治療低劑量組(8只)。將對(duì)照組及治療組進(jìn)行24 h暗適應(yīng)后置入光損傷實(shí)驗(yàn)箱中進(jìn)行光照(9 000 lux冷光源,溫度：22～25℃；濕度：40%～65%；自由飲食飲水)12 h。照射結(jié)束后所有小鼠送返至暗環(huán)境12 h。模型建立后開始給藥，治療高劑量組： 1.6 g/(kg·d)劑量的古日古木-13 溶于0.7 ml生理鹽水灌胃。治療中劑量組： 0.8 g/(kg·d)劑量的古日古木-13 溶于0.7 ml生理鹽水灌胃。治療低劑量組： 0.4 g/(kg·d)劑量的古日古木-13 溶于0.7 ml生理鹽水灌胃。對(duì)照組：0.7 ml生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃給藥7 d。灌胃劑量參考《蒙藥學(xué)百科全書》《蒙醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)學(xué)》《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》

1.5ERG檢測 實(shí)驗(yàn)各組小鼠在暗黑房間中整夜進(jìn)行暗適應(yīng)；將小鼠稱重，按比例在小鼠腹腔內(nèi)注射適量麻醉劑，使其進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)；麻醉完成后，在暗紅光照明下，膠帶固定小鼠趴在動(dòng)物試驗(yàn)平臺(tái)前方，滴涂阿托品散瞳凝膠。電極安裝：連接正電極使環(huán)形電極分別接觸左右眼角膜頂端，使其接觸角膜中心，一通道正極接右眼，二通道正極接左眼；雙頭針電極輕輕插入小鼠下顎，接通兩個(gè)通道的負(fù)接口，同側(cè)正負(fù)極方向一致；針電極插入小鼠尾巴，接通地電極。將小鼠及動(dòng)物試驗(yàn)平臺(tái)推入閃光刺激球內(nèi)。于電生理計(jì)算機(jī)錄入小鼠編號(hào)，進(jìn)入ERG-0.01程序，示波信號(hào)確認(rèn)無誤后關(guān)閉暗紅光，可依次進(jìn)行0.01ERG及3.0ERG檢測(3.0ERG檢測前進(jìn)行暗適應(yīng)15～20 min)。

1.6視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)檢查 切片，1%戊巴比妥鈉鹽溶液麻醉5組小鼠，顯微鏡下摘除眼球，留取足夠長的視神經(jīng)，于12點(diǎn)位及3點(diǎn)位進(jìn)行結(jié)膜縫線標(biāo)記，用生理鹽水沖洗干凈，置于多聚甲醛中保存，標(biāo)記各組名稱。將小鼠眼球置于包埋盒中，垂直懸吊12點(diǎn)位縫線，使眼球標(biāo)本置于水平方位，OCT包埋劑包埋冷凍后，放置于冰凍切片機(jī)。切片機(jī)溫度：-30℃，切片厚度：4～7 μm，沿視神經(jīng)的上方和下方，從眼球后壁向角膜方向分別進(jìn)行切片。蘇木素-伊紅(HE)染色，37℃烘片30 min；蘇木素染色10～15 min，蒸餾水沖洗，70%乙醇沖洗20～30 s；伊紅染色10～15 min，蒸餾水沖洗。透明、固定、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化。

1.7Western印跡檢測正常組、治療組和對(duì)照組的凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)量。

1.7.1視網(wǎng)膜組織蛋白的提取 分離視網(wǎng)膜組織，用液氮研磨組織至粉末狀；將視網(wǎng)膜組織粉末倒入EP管，將細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑(比例9∶1)置于漩渦混勻器震蕩混勻60 s；冰箱裂解(4℃)30 min，離心機(jī)離心(12 000 r/min，4℃，10 min)，取上層血清置于4 ml EP管中；加入二喹啉甲酸(BCA)后進(jìn)行蛋白總濃度測定。

1.7.2檢測 取干凈清潔玻璃板，將玻璃短板與帶隔條玻璃板相對(duì)放置裝入板夾中，前后推動(dòng)，底部對(duì)齊后扣上開關(guān)，待灌入分離膠；制備10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離膠：雙蒸水3.3 ml，30%丙烯酰胺(29∶1)4.0 ml，1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)2.5 ml，10%十二烷基硫酸鈉(SDS)0.1 ml，10%過硫酸銨0.1 ml，TEMED 4 μl；將分離膠從玻璃板左上角灌入，加至玻璃板的2/3高度后再緩慢地加入雙蒸水，水液封膠面，待其凝固后可見水與分離膠之間有一折射線，即可用濾紙吸干上層水液，加入濃縮膠；配制5%濃縮膠：雙蒸水2.7 ml，30%丙烯酰胺(29∶1)670 μl，Tris-HCl(pH6.8)500 μl，10% SDS 40 μl，10%過硫酸銨40 μl，TEMED 4 μl；灌入濃縮膠，在玻璃板間插入Teflon梳子，室溫放置10 min，待梳子之間的濃縮膠回縮，即可將玻璃板裝入電泳槽內(nèi)。電泳：將配好的膠放入電泳槽內(nèi)，加入電泳液(Tris 15.1 g，Glycine 94 g，SDS 5 g，蒸餾水1 000 ml)后，豎直向上拔除梳子，加入Marker，再將制好的蛋白樣品加入加樣槽內(nèi)，設(shè)定電壓80 V進(jìn)行電泳，待Marker條帶漸進(jìn)分開且蛋白樣品超過濃縮膠后，將電壓改為120 V進(jìn)行電泳，當(dāng)?shù)鞍讟悠肪嚯x電泳槽底 2 cm時(shí)終止電泳。轉(zhuǎn)膜：撬開玻璃板，刮去濃縮膠，切開分離膠，將凝膠反折180°置于轉(zhuǎn)膜液(蒸餾水1 L，Glycine 2.9 g，Tris 5.8 g，SDS 0.37 g)中，取所需大小的聚偏氟乙烯(PVDF)膜沒入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，將濾紙、PVDF膜、凝膠和濾紙按順序依次放置在半干轉(zhuǎn)膜儀裝置上，倒入少許轉(zhuǎn)膜液后蓋好外蓋，連接電源設(shè)定電壓或電流，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。封閉：轉(zhuǎn)膜完成后將PVDF膜放入5%脫脂牛奶TBST溶液(NaCl 8.8 g，Tris-HCl 8.0 20 ml，Tween-20 0.5 ml，蒸餾水1 000 ml)搖床封閉1.5～2.0 h。一抗孵育： 倒掉5%脫脂牛奶TBST溶液，抗體按照比例用抗體稀釋液稀釋，將PVDF膜放入含有稀釋好的一抗的密封袋中，置于4℃冰箱中過夜。洗膜：將PVDF膜放置搖床用TBST溶液漂洗3次，每次5～10 min。結(jié)合二抗：根據(jù)一抗來源選擇適合的二抗，抗體按照比例用抗體稀釋液稀釋，將PVDF膜放入密封袋中，加入稀釋好的二抗后置于37℃水平搖床上勻速搖動(dòng)1.0～1.5 h。洗膜：結(jié)合二抗孵育后，將膜置于TBST溶液中洗滌3次，每次5～10 min。顯影：PVDF膜放于顯影儀器中，發(fā)光顯影液均勻滴涂在膜上，選擇程序曝光并顯影，可以清晰地顯示蛋白條帶。蛋白密度統(tǒng)計(jì)：應(yīng)用Image J系統(tǒng)對(duì)各組細(xì)胞蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析，對(duì)其光密度強(qiáng)度進(jìn)行掃描，測量各個(gè)條帶蛋白密度值，并使用Prism統(tǒng)計(jì)分析各組蛋白含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組ERG比較 正常組ERG振幅〔(953.27±15.80)μV〕明顯高于對(duì)照組〔(385.48±12.04)μV，P<0.05〕。治療低、中、高劑量組ERG振幅〔(575.13±8.66)、(708.60±18.32)、(688.47±8.70)μV〕均明顯高于對(duì)照組，且均明顯低于正常組(均P<0.05)。治療中、高劑量組ERG振幅數(shù)值顯著高于治療低劑量組(P<0.05)，治療中劑量組和治療高劑量組無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

2.2各組視網(wǎng)膜HE染色及外核層細(xì)胞比較 正常組視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)良好，排列整齊，結(jié)構(gòu)層次清晰，外核層細(xì)胞排列緊密，大小均勻；對(duì)照組視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)排列紊亂，組織結(jié)構(gòu)界限模糊不清，外核層細(xì)胞排列疏松，大小不一，可見空泡化及細(xì)胞水腫。治療低劑量組及治療高劑量組視網(wǎng)膜細(xì)胞排列不整齊，纖維間質(zhì)部分水腫，偶見空泡；治療中劑量組細(xì)胞形態(tài)大致正常。見圖2。

a波-視錐細(xì)胞反應(yīng)(3.0閃光刺激)，b波-視桿細(xì)胞反應(yīng)(0.01閃光的刺激)圖1 各組小鼠ERG檢測結(jié)果

圖2 各組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)(HE，×40)

2.3各組視網(wǎng)膜外核層厚度比較 對(duì)照組視網(wǎng)膜外核層厚度〔(24.37±3.41)μm〕明顯低于正常組〔(31.2±1.43)μm，P<0.05〕。治療低、中、高劑量組視網(wǎng)膜外核層厚度〔(25.12±2.46)μm，(29.28±2.32)μm，(26.34±1.70)μm〕均明顯高于對(duì)照組且明顯低于正常組(均P<0.05)。治療中劑量組視網(wǎng)膜外核層厚度顯著高于治療低、高劑量組(P<0.05)，治療低劑量組與治療高劑量組無顯著差異(P>0.05)。

2.4各組caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、Bcl-2比較 與正常組相比，對(duì)照組凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax表達(dá)量顯著高于正常組，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著低于正常組(均P<0.05)；與對(duì)照組相比，治療低、中、高劑量組，凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。治療高劑量組凋亡蛋白caspase-3表達(dá)量顯著低于治療低、中劑量組(P<0.05)；治療各劑量組凋亡蛋白caspase-8表達(dá)量比較：治療低劑量組>治療高劑量組>治療中劑量組(均P<0.05)；治療中劑量組caspase-9、Bax表達(dá)量均顯著低于治療低、高劑量組(P<0.05)，而治療中劑量組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量顯著高于治療低、高劑量組(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 Western 印跡檢測視網(wǎng)膜凋亡及相關(guān)蛋白水平

1～5：正常組，對(duì)照組，治療低劑量組，治療中劑量組，治療高劑量組圖3 Western印跡檢測各組視網(wǎng)膜凋亡及相關(guān)蛋白水平

3 討 論

視網(wǎng)膜是人體產(chǎn)生視覺的重要器官，極易受到內(nèi)、外致病因素的影響。過度的異常光刺激視網(wǎng)膜，會(huì)引起視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡，經(jīng)光誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，形成視網(wǎng)膜光損傷。視網(wǎng)膜光損傷主要包括光的熱損傷、機(jī)械損傷和化學(xué)損傷。光的化學(xué)損傷被認(rèn)為在視網(wǎng)膜光損傷中有重要作用〔3〕。與年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性等疾病密切相關(guān)。視網(wǎng)膜細(xì)胞，特別是感光細(xì)胞的凋亡是最重要的發(fā)病機(jī)制〔6〕。

研究發(fā)現(xiàn)古日古木-13能通過轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號(hào)通路影響RGC-5的增殖和凋亡〔5，6〕；古日古木-13可通過抑制慢性高眼壓青光眼模型大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡信號(hào)通路激活機(jī)制，保護(hù)視神經(jīng)功能。

視網(wǎng)膜電圖主要用于檢查視網(wǎng)膜功能狀態(tài)。根據(jù)調(diào)節(jié)不同的刺激條件和接受方式，可對(duì)視網(wǎng)膜各層疾病客觀地提供診斷依據(jù)，是一種無痛、無創(chuàng)的診斷方法。ERG的a 波起源感光細(xì)胞，因此 a 波振幅減小表示感光細(xì)胞功能受到損害。b 波起源于視網(wǎng)膜內(nèi)核層細(xì)胞，b 波下降表示視網(wǎng)膜內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)完整性受損〔7〕。

感光細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞凋亡是視網(wǎng)膜光損傷的主要機(jī)制。導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的因素包括光照的性質(zhì)、強(qiáng)度，細(xì)胞的氧化反應(yīng)，視紫紅質(zhì)的水平，細(xì)胞基因的調(diào)控等〔8〕。而光損傷部位主要在光感受器和外核層。外核層主要由視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞組成，其內(nèi)含長鏈不飽和脂肪酸，最易受脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的影響。當(dāng)光子被視紫紅質(zhì)吸收時(shí)，可激發(fā)電離，產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致脂類過氧化，造成細(xì)胞膜的溶解、消失和視細(xì)胞的凋亡〔9〕。因此，測量視網(wǎng)膜外核層厚度常作為檢測視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的指標(biāo)，可以比較直觀地反映視細(xì)胞的損傷程度。

前期研究證實(shí)caspase-3、caspase-8、caspase-9在視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡中是重要的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者，可接受多種信號(hào)刺激，激活下游底物種類繁多，誘導(dǎo)凋亡〔10，11〕。Bax、Bcl-2 基因是目前最重要的凋亡調(diào)控基因〔12〕，在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。其中 Bax 蛋白促進(jìn)凋亡，Bcl-2 蛋白抑制凋亡。Bax、Bcl-2通過介導(dǎo)細(xì)胞色素C 等物質(zhì)的釋放，阻止下游caspase 的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，發(fā)揮上游調(diào)控作用。caspase-3 還可裂解 Bcl-2 蛋白，產(chǎn)生類 Bax 促凋亡活性片段來激活caspase-3，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。維持兩種蛋白的表達(dá)平衡是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵〔13～15〕。