張浩 王擁軍 桑敬偉 張文 楊衛(wèi)兵 高雁卿 張紫機

(1安陽市人民醫(yī)院骨科，河南 安陽 455000；2中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科)

骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSCs)是一類具有多向分化潛能的干細胞，在特定環(huán)境下可誘導(dǎo)分化成為成骨細胞，調(diào)控骨的生長發(fā)育。因hBMSCs具有來源廣泛、易分離培養(yǎng)和分化潛能大等特點，被認為是治療骨質(zhì)疏松等骨組織損傷修復(fù)的理想種子細胞〔1〕。然而，如何使hBMSCs單向成骨分化一直是制約臨床修復(fù)效率的關(guān)鍵。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可與相關(guān)靶基因3′UTR區(qū)結(jié)合抑制其翻譯進而影響細胞的增殖、凋亡和分化等多種生物學(xué)過程。研究〔2～4〕證實，miRNA在hBMSCs成骨分化過程中發(fā)揮著重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-224在hBMSCs成骨分化過程中低表達，但其具體的作用及調(diào)控機制尚不清楚〔5〕。因此，本研究通過體外培養(yǎng)hBMSCs并誘導(dǎo)其成骨分化后，采用常規(guī)生物學(xué)手段上調(diào)miR-224表達，觀察其對hBMSCs成骨分化的影響，并通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測相關(guān)靶基因，探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人hBMSCs、誘導(dǎo)成骨分化的DMEM培養(yǎng)液、hBMSCs培養(yǎng)液ORICellTM和Opti-MEM培養(yǎng)液購自中國賽業(yè)生物公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶購自美國Sigma公司。成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、骨鈣素(OCN)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、SMAD同源物(Smad4)一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自英國Abcam公司。miR-224模擬物(mimics)、miR-control、Smad4 siRNA干擾序列和陰性對照序列均購自上海吉凱公司，脂質(zhì)體2000購于美國Introvigen公司。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自美國Omega公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA抽提試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自上海碧云天公司，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒購自南京建成生物公司。雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2hBMSCs培養(yǎng) 采用ORICellTM培養(yǎng)液將hBMSCs培養(yǎng)在含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，每3 d換1次培養(yǎng)基。待細胞幾乎鋪滿培養(yǎng)瓶底時，加入0.25%胰酶消化，以1∶3比例傳代。實驗使用第5代細胞。

1.3hBMSCs成骨分化的誘導(dǎo) 取6孔板，每孔接種100 μl濃度為105個/ml的hBMSCs，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，加入由10%胎牛血清、0.2 mmol/L抗壞血酸、1%谷氨酰胺、10 nmol/L地塞米松和10 mmol/L β-磷酸甘油構(gòu)成的誘導(dǎo)成骨分化的DMEM培養(yǎng)液，每3 d換液1次的，誘導(dǎo)培養(yǎng)12 d。分別在第0、3、6、9和12 d收集細胞，進行后續(xù)實驗。

1.4細胞轉(zhuǎn)染 將未分化的hBMSCs以每孔105個細胞接種24孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h后，換成無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將miR-224 mimics(終濃度為50 nmol/L)及陰性對照(終濃度為50 nmol/L)轉(zhuǎn)至未分化的hBMSCs中。轉(zhuǎn)染6 h后，換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。Smad4 siRNA干擾序列和陰性對照序列的轉(zhuǎn)染過程同上。

1.5qRT-PCR檢測miR-224表達 RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)由美國Invitrogen公司合成的miR-224引物(上游：5′-GCGAGGTCAAGTCACTAGTGGT-3′和下游5′-CGAGAAGCTTGCATCACCAGAGAACG-3′)和U6引物(上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和下游5′-AACGCTTCACGAATTT-GCGT-3′)進行PCR定量分析，以U6作內(nèi)參，檢測miR-224的表達。

1.6ALP活性檢測 收集成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的hBMSCs，采用ALP檢測試劑盒檢測ALP活性，根據(jù)公式：ALP活性=測定管吸光度值/總蛋白克數(shù)。

1.7Runx2、OCN和Smad4蛋白檢測 收集成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的hBMSCs，磷酸緩沖液洗滌后，以加蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液裂解細胞提取總蛋白。采用BCA蛋白檢測試劑盒對蛋白濃度定量后，以4∶1比例將蛋白樣品與5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液混合，沸水浴變性后，進行凝膠電泳。待蛋白分離結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。常溫下以含5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h后，加入特異性一抗4℃下孵育過夜，封閉液洗滌后，HRP標(biāo)記的二抗常溫孵育1 h。暗室內(nèi)加入ECL試劑顯影曝光，以GAPDH為內(nèi)參，檢測目的蛋白的表達情況。

1.8熒光素酶實驗 由上海吉凱公司構(gòu)建Smad4 3′-UTR野生型(含Smad4 3′-UTR目的片段)和Smad4 3′-UTR突變型(含Smad4 3′-UTR突變體)質(zhì)粒。將對數(shù)生長期的hBMSCs隨機分為野生型Smad4+miR-224 mimics組、野生型Smad4+miR-control組、突變型Smad4+miR-224 mimics組和突變型Smad4+miR-control組，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染miR-224 mimic及Smad4 3′-UTR野生型或突變型，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶活性。

1.9數(shù)據(jù)分析 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1hBMSCs的成骨分化能力 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)0、3、6、9和12 d，ALP活性由(0.11±0.02)U/g依次上升為(0.23±0.03)U/g、(0.45±0.03)U/g、(0.67±0.05)U/g和(0.89±0.06)U/g。與0 d相比，隨著誘導(dǎo)時間的延長，hBMSCs 的ALP活性顯著升高(P<0.05)，且在12 d時達到最大。在0～12 d的5個成骨培養(yǎng)時間點下OCN蛋白的相對表達量分別為0.13±0.02、0.21±0.02、0.28±0.03、0.36±0.02和0.43±0.03；Runx2蛋白的相對表達量分別為0.25±0.02、0.33±0.03、0.39±0.02、0.46±0.03和0.58±0.03。與0 d相比，OCN和Runx2蛋白的表達水平也均隨誘導(dǎo)時間的延長而明顯升高(P<0.05)?？梢姡琱BMSCs的成骨分化能力良好。見圖1。

圖1 hBMSCs成骨分化能力的檢測

2.2hBMSCs成骨分化過程中miR-224和Smad4的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-224的相對表達水平從0 d的1.00±0.06到第3天降為0.88±0.06，第6天降為0.74±0.05，第9天降為0.55±0.03，至12 d降至最低，為0.43±0.03；可見，miR-224在hBMSCs成骨分化過程中的表達水平隨著時間的延長逐漸降低(P<0.05)；Western印跡法檢測結(jié)果(圖2)顯示，在0～12 d的5個成骨培養(yǎng)時間點下，Smad4蛋白的相對表達量(0.26±0.03、0.35±0.02、0.44±0.03、0.53±0.04和0.72±0.05)則隨成骨誘導(dǎo)時間的增加而顯著升高(P<0.05)。

圖2 hBMSCs成骨分化過程中Smad4的表達

2.3上調(diào)miR-224表達抑制hBMSCs向成骨細胞分化 將miR-224 mimics轉(zhuǎn)至hBMSCs后，qRT-PCR檢測miR-224的表達水平明顯升高(1.00±0.05 vs 5.53±0.12，P<0.05)。同時，ALP活性〔(0.85±0.06)U/g vs (0.37±0.03)U/g，P<0.05〕、OCN蛋白(0.39±0.04 vs 0.15±0.02)和Runx2蛋白(0.52±0.05 vs 0.32±0.03)的表達水平均顯著降低(P<0.05)。如圖3可見，上調(diào)miR-224表達抑制hBMSCs向成骨細胞分化。

圖3 上調(diào)miR-224表達對hBMSCs向成骨細胞分化的影響

2.4miR-224靶向Smad4抑制hBMSCs向成骨細胞分化 以miRGEN軟件預(yù)測miR-224的靶基因發(fā)現(xiàn)，Smad4是miR-224的一個潛在靶基因。miR-224與Smad4有相關(guān)的綁定位點〔6〕，見圖4A。為了驗證miR-224與Smad4間的靶向關(guān)系，以Western印跡檢測Smad4蛋白表達發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-224后Smad4蛋白的表達明顯下降(0.68±0.05 vs 0.46±0.03，P<0.05)，見圖4B。同時，根據(jù)熒光素酶報告實驗檢測細胞的熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)，與共轉(zhuǎn)染Smad4突變體和miR-224陰性對照相比，共轉(zhuǎn)染Smad4突變體和miR-224 mimics細胞的熒光素酶活性無明顯改變(1.06±0.08 vs 1.01±0.11，P>0.05)；但是，與共轉(zhuǎn)染Smad4野生型和miR-224陰性對照相比，共轉(zhuǎn)染Smad4野生型和miR-224mimics的細胞熒光素酶活性明顯降低(0.57±0.04 vs 0.35±0.02，P<0.05)?？梢?，miR-224可抑制Smad4的表達，進而抑制hBMSCs向成骨細胞分化。

圖4 miR-224靶向Smad4的作用

2.5下調(diào)Smad4的表達抑制hBMSCs向成骨細胞分化 Smad4 siRNA使細胞中Smad4 蛋白表達顯著降低(0.57±0.08 vs 0.26±0.02，P<0.05)；同時發(fā)現(xiàn)成骨分化相關(guān)蛋白OCN(0.45±0.03 vs 0.29±0.02)和Runx2(0.56±0.04 vs 0.40±0.03)的表達也明顯減弱(P<0.05)；此外，ALP活性也從對照的(0.83±0.05)U/g降為(0.52±0.03)U/g，差異顯著(P<0.05)。見圖5?？梢?，下調(diào)Smad4的表達能夠抑制hBMSCs向成骨細胞分化。

圖5 下調(diào)Smad4的表達對BMSCs向成骨細胞分化的影響

3 討 論

miR-224作為miRNAs家族中的重要成員，可通過調(diào)控不同的靶基因或信號通路參與細胞的生物學(xué)過程。miR-224是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的基因，在多種腫瘤中異常表達，可發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用參與細胞的生物活動。如Wang等〔7〕研究指出，miR-224在非小細胞肺癌患者組織中表達上調(diào)，上調(diào)其表達可通過靶向調(diào)節(jié)RAS相關(guān)區(qū)域蛋白(RASSF)8促進非小細胞肺癌細胞增殖；Lin等〔8〕發(fā)現(xiàn)，miR-224在前列腺癌組織中低表達，上調(diào)其表達可通過下調(diào)Tribbles同源蛋白(TIRB)1抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移，并促進細胞凋亡。除參與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展外，miR-224還參與干細胞的分化。如Na等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-224在小鼠的精原干細胞中高表達，可通過靶向Mab-3相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(DMRT)1表達促進精原干細胞的分化。Choy等〔10〕報道稱，小鼠胚胎干細胞神經(jīng)分化過程中miR-224異常表達，過表達的miR-224通過靶向神經(jīng)元周期晝夜蛋白-芳基烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白-專一蛋白Per-Arnt-Sim(PAS)結(jié)構(gòu)域蛋白(NPAS)4延緩了早期神經(jīng)分化。hBMSCs是骨組織工程中的重要種子細胞，深入研究其定向成骨分化的機制對提高干細胞修復(fù)組織缺損具有重要意義。有學(xué)者〔5〕發(fā)現(xiàn)，miR-224在hBMSCs成骨分化過程中低表達，但其具體的作用及調(diào)控機制尚不清楚。OCN和Runx2是成骨分化的的標(biāo)志蛋白，ALP活性是反映成骨活性和成骨能力的量化衡量標(biāo)準(zhǔn)〔11，12〕。本研究結(jié)果提示miR-224在成骨分化中發(fā)揮著重要的負向調(diào)控作用。

基因在機體內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一個龐大而又復(fù)雜的過程，同一個miRNA可調(diào)控多個靶基因，參與細胞的生理過程，發(fā)揮不同的作用。Chen等〔13〕指出，miR-224通過靶向白細胞分化抗原(CD40L)參與調(diào)節(jié)氧化低密度脂蛋白(oxLDL)刺激的樹突細胞成熟過程和促炎性細胞因子分泌；而Liu等〔14〕發(fā)現(xiàn)miR-224可通過靶向調(diào)控?；o酶A脫氫酶(ACADM)和乙醛脫氫酶(ALDH)2基因參與乳腺上皮細胞凋亡和三酰甘油產(chǎn)生。同時，一個靶基因又受到多個miRNA的共同調(diào)控，發(fā)揮不同的功效。如Lee等〔15〕研究證實，miR-431通過靶向Smad4促進老年骨骼肌的分化和再生；Zhang等〔16〕發(fā)現(xiàn)，miR-146b-5p可通過直接靶向Smad4促進多能干細胞的神經(jīng)轉(zhuǎn)化；同時，Anderson等〔17〕在軟骨細胞形成過程中發(fā)現(xiàn)，miR-483可靶向Smad4抑制人hBMSCs向軟骨細胞分化。李鈞等〔18〕在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細胞成骨分化過程中發(fā)現(xiàn)，miR-125b可靶向Smad4參與骨髓基質(zhì)干細胞成骨分化與增殖。

腫瘤生長因子(TGF)-β是骨代謝過程中重要的轉(zhuǎn)化因子，其在間質(zhì)干細胞成骨分化過程中發(fā)揮著重要的促進作用〔19,20〕，Smad4作為Smad家族中的重要成員，可將TGF-β信號轉(zhuǎn)致胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，參與間質(zhì)干細胞成骨分化過程〔21,22〕。提示miR-224可負向調(diào)控Smad4參與hBMSCs成骨分化。同時，熒光素酶報告實驗進一步證實了Smad4是miR-224靶基因。證實了miR-224是通過靶向Smad4抑制了hBMSCs成骨分化。但Smad4對hBMSCs成骨分化的抑制作用明顯低于miR-224。猜測，miR-224可能還通過其他途徑參與hBMSCs成骨分化過程。

綜上，miR-224通過靶向Smad4抑制hBMSCs成骨分化。這一結(jié)果為miR-224和Smad4有望成為治療骨折愈合和骨質(zhì)疏松等骨骼疾病的藥物靶點提供了參考依據(jù)。同時，miR-224除了通過靶向Smad4調(diào)控hBMSCs成骨分化外，可能還存在其他的調(diào)控機制，還需進一步研究。