孟 園,王來(lái)兵,于姝燕,郭曉宇,王 敏,于 娟,李 冰,劉 濤,陳建平*
(1.巴彥淖爾市醫(yī)院藥劑科,內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)
苓桂術(shù)甘湯來(lái)自《傷寒雜病論》中的“金匱要略方劑”部分。苓桂術(shù)甘湯由四味常見(jiàn)藥材,即茯苓、桂枝、甘草、白術(shù)組成。此湯劑為祛濕劑,主治因中陽(yáng)不足所致的心胸滿悶、短氣而咳、起則頭眩、氣上沖胸等癥[1,2],具有健脾利濕、溫陽(yáng)化飲等功效。在現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)上,苓桂術(shù)甘湯常用于治療慢性支氣管炎、過(guò)敏性鼻炎、梅尼埃綜合征、神經(jīng)官能癥、慢性腎小球腎炎水腫、心源性水腫、慢性心力衰竭等癥,還可聯(lián)合短期低熱量飲食來(lái)控制Ⅱ型糖尿病患者的血糖[8,9]。苓桂術(shù)甘湯療效顯著、毒副作用低,具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[3~10]。
據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),目前對(duì)苓桂術(shù)甘湯的研究主要集中在臨床應(yīng)用以及藥理作用方面,對(duì)其物質(zhì)基礎(chǔ)的研究報(bào)道相對(duì)缺乏。為了充分研究苓桂術(shù)甘湯中的有效化學(xué)物質(zhì),本研究首次建立高效快速的反相高效液相色譜(RP-HPLC)測(cè)定該方劑中甘草苷和原兒茶酸含量的方法,為苓桂術(shù)甘湯的質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)等研究提供新的依據(jù)及參考。
AB135-S電子分析天平(瑞士,MettlerToledo);Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國(guó),ThermoFisher);KM-410C型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草飲片購(gòu)自內(nèi)蒙古天立藥業(yè),所有藥材經(jīng)由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室渠弼副教授鑒定,均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》要求。
甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):G-009-181216,純度>98%,成都瑞芬思公司),原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):110809-201205,99.9%,中國(guó)食品藥品檢定研究院),乙腈(色譜純,美國(guó),Merck),甲醇(美國(guó),F(xiàn)isher,色譜純),磷酸(85%水溶液,北京伊諾凱),超純水為實(shí)驗(yàn)室自制,其余所用試劑藥品均為分析純。
色譜柱:Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5 μM);在260 nm波長(zhǎng)處檢測(cè),柱溫25℃,流速1.0 mL·min-1,梯度洗脫(見(jiàn)表1),流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水,進(jìn)樣量為10 μL。此條件下,原兒茶酸及甘草苷能與其他化學(xué)成分完全分離,且原兒茶酸理論塔板數(shù)>100000,甘草苷理論塔板數(shù)>200000。
表1 梯度洗脫Tab.1 Gradient elution
精密稱取干燥至恒重的甘草苷和原兒茶酸對(duì)照品。分別為4.23 mg和2.72 mg,置于燒杯中,加入少量甲醇溶液溶解后置于100 mL容量瓶中定容,配制成含42.3 μg·mL-1的甘草苷和27.2 μg·mL-1的原兒茶酸的甲醇混合液。
精密稱取藥材粉末2.75 g(粉碎并過(guò)60目篩的茯苓1 g、桂枝0.75 g、甘草0.5 g、白術(shù)0.5 g),放置于具塞錐形瓶中,加入甲醇溶液25 mL,密塞,稱定重量,在功率40 kHz,頻率為200 W,超聲處理30 min,放至室溫,補(bǔ)足差重,搖勻,濕法抽濾,即得。
精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL,分別置于5 mL容量瓶中,加甲醇至定容。按照“2.1”項(xiàng)下的條件檢測(cè),以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)。峰面積為縱坐標(biāo),測(cè)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線,得甘草苷的回歸方程為Y=145.0X+0.089(r=0.9992;n=6)、原兒茶酸的回歸方程為Y=632.7X+0.074(r=0.9993;n=6)。結(jié)果表明,原兒茶酸、甘草苷濃度分別在1.36~13.60 μg·mL-1與2.12~21.15 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[11]。
精密量取同一批樣品溶液,按照“2.1”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定得甘草苷和原兒茶酸含量的RSD分別為0.18%、0.15%,結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。
精密量取一定量的藥品溶液,分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得甘草苷、原兒茶酸含量的RSD分別為0.33%、0.77%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。
精密稱取同批次藥材,按照“2.3”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法,平行制備6份溶液,并按“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件檢測(cè),結(jié)果測(cè)得甘草苷和原兒茶酸的平均含量分別為618.6 μg·g-1和49.09 μg·g-1,RSD均為0.9%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。(見(jiàn)表2)。
表2 含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Content determination results
分別量取空白溶劑適量、供試品試液適量、混合對(duì)照品試液適量于樣品瓶中,按“2.1”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件檢測(cè)。供試品溶液色譜圖,在混合對(duì)照品試液的甘草苷和原兒茶酸相應(yīng)的位置上,有保留時(shí)間相同的色譜峰,且空白溶劑中沒(méi)有相應(yīng)保留時(shí)間的色譜峰,空白溶劑對(duì)甘草苷及原兒茶酸的測(cè)定無(wú)干擾,說(shuō)明該方法專屬性良好(見(jiàn)圖1)。
圖1 干擾性試驗(yàn)Fig.1 Interference test
精密稱取同批次已知含量的供試品6份,分別加入80%、100%、120%的甘草苷和原兒茶酸對(duì)照品試液各2份,按照“2.3”項(xiàng)下方法制備,按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測(cè),測(cè)得甘草苷和原兒茶酸的平均回收率分別為98.37%,RSD=0.9%和98.51%,RSD=1.1%。結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法加樣回收率良好[12](見(jiàn)表3)。
表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Test results of sample addition rocovery
樣品溶液制備的預(yù)實(shí)驗(yàn)中,分別采用甲醇、無(wú)水乙醇、70%乙醇和水作為溶劑超聲處理提取樣品。測(cè)定顯示,以甲醇作為提取溶劑,被測(cè)定成分溶解度好,提取率高,得到的兩成分色譜峰峰形、高度均良好。
分別采用了乙腈-0.1%磷酸水和甲醇-0.1%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明用乙腈-0.1%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫,甘草苷及原兒茶酸均有較好的峰型和分離度;而用甲醇-0.1%磷酸水,甘草苷峰無(wú)法分開(kāi),僅原兒茶酸峰型和分離度良好。
在200~400 nm范圍內(nèi)用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)甘草苷和原兒茶酸進(jìn)行掃描,結(jié)果表明甘草苷和原兒茶酸分別在278 nm和260 nm處有最大吸收。由于苓桂術(shù)甘湯中原兒茶酸的含量比甘草苷的含量低,若以278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí),原兒茶酸的峰面積太小,難以測(cè)量,而甘草苷在260 nm處峰型穩(wěn)定,故選擇260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)同時(shí)對(duì)兩組成分進(jìn)行測(cè)定。
本試驗(yàn)成功建立了RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定苓桂術(shù)甘湯中原兒茶酸和甘草苷的含量,通過(guò)方法學(xué)考察表明,所建立的方法簡(jiǎn)單靈敏、快速高效、易于操作,為苓桂術(shù)甘湯的質(zhì)量控制研究提供理論參考。