蔣 寧，楊 光，彭彩亮，林 林，胡喜姣

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

慢性心律失常是以心率減慢為主要特征的一類心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病，由房室結(jié)或竇房結(jié)自律性低下或傳導(dǎo)系統(tǒng)阻滯引起，主要包括房室或竇房傳導(dǎo)阻滯、竇性心動(dòng)過緩、病態(tài)竇房結(jié)綜合征等，臨床主要表現(xiàn)為心悸、頭暈、黑蒙、暈厥甚至導(dǎo)致患者死亡[1]。目前尚無滿意的抗心律失常藥物，長期應(yīng)用口服藥有誘發(fā)新的心律失?；蚣又卦胁∏榈娘L(fēng)險(xiǎn)，此外安裝起搏器費(fèi)用較高，較難普及[2]。中醫(yī)療法因安全性、臨床療效均較好逐漸成為研究熱點(diǎn)。慢性心率失常歸屬中醫(yī)“怔忡”“昏厥”“眩暈”“心悸”范疇，主要病機(jī)是心腎陽虛，因此活血化瘀、溫腎助陽是慢性心律失常的主要治療原則[3]。慢律升顆粒是臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有益氣活血、溫腎助陽之功效[4]。環(huán)磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(Cyclic guanosine monophosphate，cGMP)是一對(duì)相互拮抗、相互對(duì)立的物質(zhì)，cAMP是細(xì)胞內(nèi)“第二信使”，具有擴(kuò)張血管、抗心律失常等多重作用，cGMP可通過激活蛋白激酶G降低心搏率[5]。本研究通過建立慢性心律失常大鼠模型，探究慢律升顆粒對(duì)慢性心律失常模型大鼠血漿cAMP、cGMP的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只健康無特定病原體動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠(購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心)，體重(200±20)g，分籠飼養(yǎng)于普通環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作流程通過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)開展。

1.1.2 主要試劑與儀器：所用試劑主要包括鹽酸普萘洛爾片(國藥準(zhǔn)字H3020584)、注射用青霉素鈉(國藥準(zhǔn)字H3021633)、水合氯醛(純度為99.8%,天津市大茂化學(xué)試劑廠)、碘伏(河北瑞康醫(yī)藥科技有限公司)、RIPA裂解液(上海貝博生物公司)、Protein Marker(Aomabio公司)、PVDF膜(美國Milipore公司)、Cx45蛋白抗體(Abclonal公司)、Gsα蛋白抗體、羊抗兔IgG(美國Affinnity公司)、HCN蛋白抗體(Gene公司)、DAS顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、Potent ECL高敏化學(xué)噶光試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)、cAMP試劑盒和cGMP試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)。

慢律升顆粒：紅參、三七粉、芍藥、細(xì)辛各5 g，炙附子、炙麻黃各7.5 g，葛根、丹皮、澤瀉各20 g，炙甘草10 g。慢律升顆粒由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室制備。

儀器：BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Aplegen公司)、酶標(biāo)儀(Tecan公司)、BMJ-1B生物組織包埋機(jī)(天津天利航空機(jī)電有限公司)、離心機(jī)(型號(hào)5425，德國Eppendorf公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模與分組：大鼠在普通環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、普萘洛爾組、乙酰膽堿組、普萘洛爾聯(lián)合慢律升組、乙酰膽堿聯(lián)合慢律升組，各6只。普萘洛爾組、乙酰膽堿組、普萘洛爾聯(lián)合慢律升組和乙酰膽堿聯(lián)合慢律升組大鼠術(shù)前禁食12 h，稱重后腹腔注射0.3 ml/100 g的10%水合氯醛麻醉，麻醉后將大鼠以仰臥位固定，頸部剃毛、消毒。除對(duì)照組外，將其余各組大鼠的喉部沿喉管方向切開約1.5 cm的小口，將肌肉充分暴露，順著喉嚨方向?qū)⒓∪夥珠_，暴露氣管，找出甲狀腺軟骨下方與氣管連接的甲狀腺，游離出氣管兩側(cè)甲狀腺上下極并將上下極靜脈和動(dòng)脈剝離，使用細(xì)線結(jié)扎血管，小心分離甲狀腺，若有出血需立即止血，止血后將傷口縫合?？p合后術(shù)口碘伏消毒，術(shù)后予小鼠注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后第28天大鼠出現(xiàn)以下癥狀：嗜睡、食欲減退、蜷縮、體溫下降、皮毛無華、心率減慢等。術(shù)后第29天起，普萘洛爾組、普萘洛爾聯(lián)合慢律升組大鼠每天上午給予鹽酸普萘洛爾15 mg/kg灌胃，乙酰膽堿組、乙酰膽堿聯(lián)合慢律升組大鼠每天上午給予乙酰膽堿15 mg/kg灌胃，均連續(xù)給藥7 d，當(dāng)心率低于300次/min或心電圖示RR間期大于60 ms時(shí)，即表示慢性心律失常大鼠模型造模成功。本實(shí)驗(yàn)24只大鼠均造模成功。

1.2.2 給藥：大鼠造模成功后第2天立即給藥。對(duì)照組大鼠分別于上午和下午灌胃0.9%氯化鈉溶液1 ml/100 g；普萘洛爾組大鼠上午灌胃鹽酸普萘洛爾15 mg/kg，下午灌胃0.9%氯化鈉溶液1 ml/100 g；乙酰膽堿組大鼠上午灌胃乙酰膽堿15 mg/kg，下午灌胃0.9%氯化鈉溶液1 ml/100 g；普萘洛爾聯(lián)合慢律升組大鼠上午灌胃鹽酸普萘洛爾15 mg/kg，下午灌胃慢律升顆粒，1袋/次；乙酰膽堿聯(lián)合慢律升組大鼠上午灌胃乙酰膽堿15 mg/kg，下午灌胃慢律升顆粒，1袋/次。各組大鼠均連續(xù)灌胃7 d。

1.2.3 cAMP和cGMP水平檢測(cè)：第7天上午各組大鼠灌胃后2 h，稱重、麻醉，用手術(shù)剪剪開腹部皮膚，逐層分離腹部肌肉組織，顯露腹主動(dòng)脈，用一次性采血針于腹主動(dòng)脈采血，將血液離心10 min、3000 r/min，取上清液放置-20 ℃冰箱中備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠血清中cAMP和cGMP含量。

1.2.4 肛溫及心率檢測(cè)：于治療后，使用體溫計(jì)測(cè)定并記錄各組大鼠肛溫，使用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)并記錄各組大鼠心率。

<1)，且各件產(chǎn)品是否為不合格品相互獨(dú)立．

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 對(duì)照組大鼠毛皮光亮，飲食和大小便均正常，體型強(qiáng)健，活動(dòng)及打斗頻繁，體重增長較快。除對(duì)照組外，其余組大鼠毛皮色暗黃、枯燥無光澤，大便稀，肛門黏著稀便，精神萎靡，活動(dòng)及打斗較少，體型瘦小，體重增長較慢。

2.2 各組大鼠肛溫、心率比較 與對(duì)照組比較，普萘洛爾組、乙酰膽堿組大鼠的肛溫均低(P<0.05)；與普萘洛爾組、乙酰膽堿組比較，普萘洛爾聯(lián)合慢律升組、乙酰膽堿聯(lián)合慢律升組治療后肛溫均高(P<0.05)。與對(duì)照組比較，普萘洛爾組、乙酰膽堿組大鼠的心率均低(P<0.05)；與普萘洛爾組、乙酰膽堿組比較，普萘洛爾聯(lián)合慢律升組、乙酰膽堿聯(lián)合慢律升組治療后心率均高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肛溫、心率比較

2.3 各組大鼠血清中cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比較 見表2。與對(duì)照組比較，普萘洛爾組、乙酰膽堿組大鼠的cAMP低，cGMP高，cAMP/cGMP比值低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與普萘洛爾組、乙酰膽堿組比較，普萘洛爾聯(lián)合慢律升組、乙酰膽堿聯(lián)合慢律升組治療后cAMP水平高，cGMP水平低，cAMP/cGMP比值高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組大鼠血清中cAMP、cGMP及cAMP/cGMP水平比較

3 討 論

慢性心律失常在中醫(yī)歸屬于“眩暈”“胸痹”“心悸”等范疇，主要臨床特征為長期的脈搏緩慢且不規(guī)則，并伴有心悸、胸悶、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、畏寒肢冷、暈厥等癥狀[6]。古代醫(yī)家認(rèn)為心為君主之官，主血脈，心陽鼓動(dòng)營血周而復(fù)始地流動(dòng)；腎陽是人體陽氣之根本，在人體生命活動(dòng)中占據(jù)重要位置，心陽根于腎陽，人至中年陽氣漸虧，心之搏動(dòng)節(jié)律減緩，因此心腎陽虛是本病的主要病因病機(jī)[7]。

本研究結(jié)果顯示，予慢律升顆粒治療后，大鼠的肛溫和心率與相應(yīng)的模型組比較均顯著升高，提示慢律升顆粒可以提高慢性心律失常模型大鼠的肛溫和心率。這可能與慢律升顆粒溫陽通脈、補(bǔ)益活血之功效相關(guān)。慢律升顆粒主要成分為紅參、炙附子、葛根、芍藥、細(xì)辛、炙麻黃、丹皮、澤瀉、炙甘草[8]。紅參為君藥，有補(bǔ)脾益氣、大補(bǔ)元?dú)饧吧虬采窆π?；炙附子為臣藥，具有補(bǔ)火助陽、回陽救逆、散寒的功效；葛根可升陽解肌，芍藥、丹皮具有活血散瘀止痛、清熱涼血之功，炙麻黃和細(xì)辛宣肺平喘、發(fā)汗解表、利水消腫，可散陰寒以調(diào)血脈，助附子發(fā)越陽氣，促進(jìn)血脈的運(yùn)行，澤瀉具有瀉熱、利水滲濕功效，炙甘草有補(bǔ)心益脾功效，可調(diào)和諸藥，以上諸藥共為佐使，全方共奏溫陽通脈、補(bǔ)益活血之功效[9-11]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，慢律升顆粒通過溫陽可使心率增加，加強(qiáng)心脈運(yùn)行，改善血流滯緩狀態(tài)[12]。

本研究結(jié)果顯示，慢律升顆粒治療后大鼠cAMP、cAMP/cGMP水平與模型組大鼠比較均顯著升高，cGMP水平均顯著低于相應(yīng)模型組，提示慢律升顆?？梢蕴岣哐逯衏AMP水平，降低血清中cGMP水平，使cAMP/cGMP升高。分析原因可能是，慢性心律失常與支配心臟的交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)功能失常相關(guān)，同時(shí)由于心肌細(xì)胞膜對(duì)K+通透性增高及房室交界細(xì)胞膜處于超極化狀態(tài)，不易爆發(fā)動(dòng)作電位有關(guān)[13]。乙酰膽堿作用于M受體，興奮迷走神經(jīng)，從而抑制心臟興奮，降低心率，引發(fā)慢性心律失常[14]。環(huán)核苷酸包括cAMP和cGMP，是體內(nèi)具有廣泛調(diào)節(jié)作用的生物活性物質(zhì)，可以將第1信使傳來的信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)功能[15-16]。cAMP和cGMP是相互拮抗的物質(zhì)，血清中cAMP含量降低時(shí)，cGMP含量會(huì)增加，cAMP/cGMP降低，是陽虛證特異性的病理變化之一[17]。cAMP是細(xì)胞內(nèi)“第二信使”，具有強(qiáng)心、抗心律失常、擴(kuò)張血管及正性肌力作用，可通過激活蛋白激酶A調(diào)節(jié)鈣通道和鈉通道，增強(qiáng)磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而提高心率，且cAMP促進(jìn)自由脂肪酸的生成，增加心肌耗氧量[18]。cGMP可通過激活蛋白激酶G抑制肌纖維膜蛋白的磷酸化，進(jìn)而降低心搏率[19]?，F(xiàn)代藥理研究表明，葛根有抗心律失常的作用，炙甘草可使竇房結(jié)自律性增加，進(jìn)而提高心率[20]。

綜上，慢律升顆?？梢陨呗孕穆墒СＤＰ痛笫蟮母販睾托穆剩岣哐錭AMP、cAMP/cGMP水平，降低血清cGMP水平。