司海龍，馬仰仰，馬一鳴，張 潔，肖海娟，方 瑜，王惠玲

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046)

惡性腫瘤已成為影響人類健康和生命的重大疾病，隨著研究的深入,腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)逐漸被人們認(rèn)識(shí)[1-2]。TME是由多種基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞因子構(gòu)成的復(fù)雜生物學(xué)系統(tǒng),影響著腫瘤發(fā)展進(jìn)程中的多種生物學(xué)行為，為腫瘤增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移提供了良好的物質(zhì)條件[3]。中醫(yī)藥在重塑腫瘤相關(guān)微環(huán)境及控制腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等方面有著重要優(yōu)勢(shì)[4]。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)是TME中最主要的基質(zhì)細(xì)胞之一，在腫瘤發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[5]。研究表明α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)作為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)表達(dá)的特征性蛋白標(biāo)志物，常用以CAFs檢測(cè)[6]。而波形蛋白(Vimentin)作為細(xì)胞骨架蛋白的一類Ⅲ型中間絲蛋白，在臨床病理學(xué)鑒別腫瘤細(xì)胞分化起源過(guò)程中被廣泛的作為標(biāo)志物[7]。因此可以通過(guò)檢測(cè)α-SMA、Vimentin蛋白表型間接檢測(cè)CAFs，從而反映其在腫瘤微環(huán)境變化和對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的影響。CAFs可以分泌多種趨化因子，趨化因子由可溶性及分子量較小的細(xì)胞因子樣蛋白構(gòu)成，分泌的CXCL1、CXCL2、CXCL8以及CAFs可以誘導(dǎo)腫瘤形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及血管新生[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)CXCL可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[11]。培元抗癌湯是陜西省名中醫(yī)李仁廷教授根據(jù)30余年中醫(yī)藥治療惡性腫瘤臨床經(jīng)驗(yàn)所研制。前期臨床研究證實(shí)培元抗癌湯聯(lián)合FOLFOX4方案化療治療中晚期肝癌，療效優(yōu)于單純FOLFOX4方案化療[12]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明培元抗癌湯通過(guò)干預(yù)不同的因子，抑制H22肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，提高免疫功能。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以H22荷瘤小鼠為載體，應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)與方法，觀察培元抗癌方聯(lián)合替加氟片對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的抑制作用，檢測(cè)CAFs及相關(guān)細(xì)胞因子CXCL1、CXCL2、CXCL8的表達(dá)，探討培元抗癌湯治療肝癌的作用機(jī)理，為培元抗癌方治療惡性腫瘤提供現(xiàn)代生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株：肝癌細(xì)胞株H22，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；昆明種雄性小鼠40只，體重18～22 g，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(陜2017-003)；在陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)，室內(nèi)平均溫度(23±2)℃、平均濕度(55±10)%，飼養(yǎng)1周后造模。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：替加氟片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20066150，規(guī)格50 mg/片)。培元抗癌湯組成：西洋參、黃芪、炒白術(shù)、莪術(shù)、白花蛇舌草、茯苓各15 g，郁金、厚樸、法半夏、焦山楂各12 g，方中中草藥購(gòu)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。蛋白Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，兔多抗Gapdh(杭州賢至生物有限公司)，兔單抗CXCL2(Invitrogen公司)，兔多抗CXCL8(Affinity公司)，兔多抗CXCL1、α-SMA、Vimentin(三鷹生物公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：電泳儀電源(北京六一儀器廠)、DYY-7C垂直電泳槽(北京六一儀器廠)、DYCZ-24DN電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)、水平搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)、pH計(jì)(德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司)、酶標(biāo)儀(Thermo公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 H22腹水型瘤株懸液制備：在無(wú)菌環(huán)境下，將鼠源性肝癌細(xì)胞株H22注入Balb/c小鼠腹腔內(nèi),荷瘤10 d；荷瘤小鼠腹水異常增加時(shí),處死小鼠并收集腹水,在22 ℃條件下,30 min內(nèi)用0.9%氯化鈉溶液洗3次，再用0.9%氯化鈉溶液調(diào)整濃度為1×106/ml癌細(xì)胞懸液,通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色證實(shí)H22細(xì)胞存活率>95%，置癌細(xì)胞懸液于冰盤中待用。

1.2.2 造模分組、給藥及取材：40只健康小鼠腋下接種瘤細(xì)胞懸液進(jìn)行造模，小鼠腋下出現(xiàn)瘤體視為成功，從造模成功的小鼠中挑選24只，隨機(jī)分為三組。替加氟片小鼠用藥量計(jì)算：替加氟片成人用量為1000 mg/d(體重按60 kg計(jì)算)，則小鼠每日替加氟灌胃量應(yīng)為1000 mg/60 kg×9.01×0.02 kg=3 mg。將替加氟片研磨至粉末，加蒸餾水配制成15 mg/ml的混懸液,灌胃0.2 ml/d。培元抗癌湯小鼠用藥量計(jì)算：培元抗癌湯中各藥物重量之和為138 g，小鼠每公斤體重用藥量計(jì)算為：138 g/60 kg×9.01×0.02 kg=0.4 g，中藥用藥濃度為2 g/ml，灌胃0.2 ml/d。模型組：予0.9%氯化鈉溶液0.2 ml/只,灌胃。替加氟組：予濃度為15 mg/ml替加氟溶液0.2 ml/只，灌胃。中西結(jié)合組：予濃度為4 g/ml中藥湯劑0.1 ml/只，灌胃，濃度30 mg/ml替加氟溶液0.1 ml/只，灌胃。每日用藥1次，連續(xù)用藥14 d。用藥后第15日，小鼠脫臼處死，在超凈工作臺(tái)上，解剖剝離小鼠腋下的瘤體，除去瘤體周圍的組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗，并測(cè)量其大小、重量，計(jì)算抑瘤率。

1.2.3 觀察各組小鼠一般情況：觀察每組小鼠進(jìn)食、飲水、毛色以及活動(dòng)狀況，測(cè)試其反應(yīng)度，是否出現(xiàn)腹瀉、消瘦或死亡等不良情況并做記錄。

1.2.4 計(jì)算各組小鼠抑瘤率：小鼠全部脫臼處死后，取瘤組織稱重并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=[(模型組平均瘤重-藥物干預(yù)組平均瘤重)]/模型組平均瘤重×100%。

1.2.5 各組小鼠α-SMA、Vimentin、CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表達(dá)檢測(cè)：把少量瘤組織放于勻漿器球狀部位，剪碎，加裂解液(含苯甲基磺酰氟)在勻漿器中進(jìn)行勻漿，嚴(yán)格按照BCA蛋白定量測(cè)試盒說(shuō)明書操作，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。放入沸水中水浴10 min，冷卻后在-20 ℃冰箱存放。以RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度，5×還原樣品緩沖液滴加后調(diào)整樣品終濃度2 mg/ml。配制好含有5%脫脂奶粉的TBST，將轉(zhuǎn)膜完成的PVDF膜放入其中，室溫，置于搖床上晃動(dòng)2 h。加入稀釋過(guò)的相應(yīng)一抗，PVDF膜浸泡其中，4 ℃下孵育過(guò)夜，緩慢晃動(dòng)。按照1∶50000的比例稀釋相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶，用以標(biāo)記二抗，PVDF膜浸泡其中，37 ℃下孵育2 h，緩慢晃動(dòng)。TBST充分洗滌PVDF膜5～6次、5 min/次。配制好發(fā)光溶液并滴至PVDF膜上，用X線膠片壓片，再加入顯影液、定影液，最后沖洗膠片；掃描膠片，用Band Scan軟件分析膠片灰度值，計(jì)算α-SMA、Vimentin、CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況比較 干預(yù)后，模型組小鼠瘤體逐漸增大，進(jìn)食、飲水量日益減少，毛色暗黃，對(duì)外界刺激反應(yīng)逐漸下降，數(shù)只小鼠蜷縮在一起，活動(dòng)明顯減少。替加氟組與模型組小鼠比較，進(jìn)食、飲水量明顯增多，體重增加，可見腋下瘤體，但瘤體未明顯增大，毛色正常，對(duì)于外界刺激反應(yīng)相對(duì)靈敏。中西結(jié)合組小鼠進(jìn)食、飲水狀況良好，體重有所增加，腋下瘤體明顯小于其他組，對(duì)外部刺激反應(yīng)敏感，活動(dòng)無(wú)明顯異常。

2.2 各組小鼠瘤體重量及抑瘤率比較 見表1。替加氟組、中西結(jié)合組瘤體重量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.05)；中西結(jié)合組瘤體重量低于替加氟組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中西結(jié)合組抑瘤率高于替加氟組(P<0.05)。

表1 各組小鼠瘤體重量及抑瘤率比較

2.3 各組小鼠α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)比較 替加氟組、中西結(jié)合組小鼠α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；中西結(jié)合組較替加氟組的α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2(圖1)。

表2 各組小鼠α-SMA、Vimentin蛋白表達(dá)比較

1：模型組；2：替加氟組；3：中西結(jié)合組

2.4 各組小鼠CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表達(dá)比較 替加氟組、中西結(jié)合組小鼠CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表達(dá)低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P<0.05)。中西結(jié)合組的CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表達(dá)較替加氟組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3(圖2)。

表3 各組小鼠CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白表達(dá)比較

1：模型組；2：替加氟組；3：中西結(jié)合組

3 討 論

目前，惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康，且我國(guó)屬肝癌高發(fā)地區(qū)，年發(fā)病率和病死率均超過(guò)全球總數(shù)的50%[13-14]。中醫(yī)認(rèn)為肝癌的發(fā)生，受正氣內(nèi)虛、外感邪毒、內(nèi)傷七情、飲食失宜等多重因素共同作用，導(dǎo)致臟腑氣血運(yùn)行失常、氣滯痰凝血瘀，相互搏結(jié)，濕熱久蘊(yùn)，漸成肝積。培元抗癌湯由西洋參、郁金、黃芪、炒白術(shù)、莪術(shù)、白花蛇舌草、茯苓、厚樸等藥物組成，全方以培元祛邪，標(biāo)本兼治，諸藥合用，祛邪而不傷正。CAFs是腫瘤微環(huán)境中參與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移最重要的細(xì)胞成分之一，CAFs既能直接刺激腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，又能間接提高癌細(xì)胞的侵襲力，以上作用通過(guò)CAFs自身分泌的細(xì)胞因子、趨化因子、促炎介質(zhì)等實(shí)現(xiàn)，在腫瘤形成階段起重要作用。α-SMA起支撐細(xì)胞的作用，參與真核細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)的形成，有研究證實(shí)肝癌的分化程度與α-SMA的表達(dá)有關(guān)[15]，惡性程度高的低分化肝癌中α-SMA表達(dá)最高。Vimentin作為細(xì)胞骨架蛋白之一，是一種特異性分布于間質(zhì)細(xì)胞的中間絲蛋白，Vimentin和α-SMA為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)與CAFs數(shù)量和活性程度相關(guān)。研究表明CAFs促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成，CXCL可促進(jìn)其增殖、遷移[16]。研究發(fā)現(xiàn)不僅肝癌細(xì)胞可以分泌CXCL1，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲，CXCL1在黑色素瘤、卵巢癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移等方面起到?jīng)Q定性作用。另有研究證實(shí) CXCL2對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用[17]。CXCL8是一個(gè)被廣泛研究的細(xì)胞因子，它能加速內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成，CXCL8高表達(dá)與肝癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[18-19]。因此抑制CAFs及其分泌的CXCL1、CXCL2、CXCL8可起到抑制腫瘤的作用。近年來(lái)，不斷有研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方中藥能通過(guò)調(diào)節(jié)CAFs治療惡性腫瘤[20]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，培元抗癌湯聯(lián)合替加氟干預(yù)肝癌模型后，其小鼠一般狀態(tài)較好，優(yōu)于其他各組，提示中藥在改善生存質(zhì)量方面有優(yōu)勢(shì)，這與臨床中醫(yī)藥治療惡性腫瘤療效相一致。各用藥組移植瘤瘤體重量明顯低于模型組，中西結(jié)合組可明顯抑制瘤體生長(zhǎng)，提示中藥聯(lián)合化療在控制腫瘤生長(zhǎng)方面要優(yōu)于單純化療，這可能與干預(yù)腫瘤微環(huán)境有關(guān)。中西結(jié)合組可明顯降低α-SMA、Vimentin、CXCL1、CXCL2、CXCL8蛋白的表達(dá)，提示中西醫(yī)聯(lián)合用藥可能通過(guò)抑制α-SMA、Vimentin、CXCL1、CXCL2、CXCL8水平，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。