馬振旺，梁 浩，趙 兵，蔡紹杰，郭 婧，于 丹

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江 哈爾濱 150006；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

帕金森病是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，我國(guó)65歲以上人群的患病率約為1700/10萬，至2030年我國(guó)帕金森病患者預(yù)計(jì)將增至494萬，約占全世界帕金森病患者的50%[1-2]。既往認(rèn)為該疾病主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直等運(yùn)動(dòng)癥狀，近年研究顯示其病理改變可累及周圍神經(jīng)系統(tǒng)和大腦皮質(zhì)，從而引起焦慮等多種非運(yùn)動(dòng)障礙癥狀[3]。此類非運(yùn)動(dòng)障礙癥狀嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且常規(guī)抗帕金森病藥物難以起效[4]。焦慮是帕金森病非運(yùn)動(dòng)障礙的主要表現(xiàn)之一，這可能與神經(jīng)遞質(zhì)異常、腦內(nèi)炎癥反應(yīng)、杏仁核體積縮小等因素有關(guān)[5]。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》《中藏經(jīng)》中已有中醫(yī)治療帕金森病相關(guān)記載，并將其歸于“顫證”“郁證”“百合病”“臟躁”“不寐”等范疇。針灸的頭穴透刺能夠作用于大腦，改善腦部新陳代謝，促進(jìn)腦功能重建[6]，有助于帕金森病焦慮的臨床治療，但目前仍欠缺循證學(xué)依據(jù)。本研究擬通過建立帕金森病動(dòng)物模型探討透刺療法對(duì)帕金森病焦慮的療效，并分析其對(duì)大鼠杏仁核腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)和白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部購(gòu)入健康雄性Wistar大鼠60只，3月齡，體重250～350 g，飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房(SPF級(jí))，統(tǒng)一喂食由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心配制的鼠糧和水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，動(dòng)物室內(nèi)相對(duì)濕度50%～70%、室溫20～26 ℃、光照黑暗各12 h，自由攝食飲水，避免噪聲、強(qiáng)光等不利條件。

1.1.2 主要試劑與儀器：鹽酸6-羥基多巴(6-Hydrodopamine,6-OHDA)、阿撲嗎啡(Apomorphine,APO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；山羊抗兔TNF-α多克隆抗體、大鼠IL-10單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abeam公司。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)儀(型號(hào)OFT-100，成都泰盟科技有限公司)；高架十字迷宮(深圳瑞沃德公司)；腦立體定位儀(型號(hào)SN-2N，日本Narishige公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模、分組與給藥：帕金森病模型制備：大鼠接受水合氯醛腹腔麻醉，頭部固定于腦立體定位儀上，暴露頭骨，依據(jù)Paxinos-watson大鼠腦定位圖譜，確定左側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束位置，腹腔注射地昔帕明溶液5 mg/kg以保護(hù)去甲腎上腺素能神經(jīng)元。30 min后，左側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束緩慢注射4 μl的6-OHDA，4 min內(nèi)注射完畢，玻璃微電極在注射部位停留5～10 min，消毒、縫合傷口。所有大鼠術(shù)后均注射8萬U青霉素鈉抗感染。手術(shù)第14天后，皮下注射0.05 mg/kg的APO 誘發(fā)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，如果5 min內(nèi)大鼠向右側(cè)旋轉(zhuǎn)>20圈，提示帕金森病大鼠造模成功。帕金森病焦慮模型制備：造模成功的大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、黛力新組、透穴刺法組各15只。正常組大鼠不接受任何刺激，正常飼養(yǎng)。模型組大鼠單籠飼養(yǎng)，每日隨機(jī)接受晝夜顛倒、禁食、禁水、冷水游泳、夾尾、潮濕環(huán)境、束縛其中一種刺激造模處理。黛力新組在模型組大鼠干預(yù)的基礎(chǔ)上，在每日應(yīng)激刺激前接受黛力新(國(guó)藥準(zhǔn)字H20153122)灌胃。黛力新給藥方法：將黛力新溶于純凈水中，按照1.8 mg/kg劑量每日上午9：00～12：00灌胃給藥，1次/d。透穴刺法組在模型組大鼠干預(yù)的基礎(chǔ)上，在每日應(yīng)激刺激前接受透穴刺干預(yù)，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》和《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》進(jìn)行穴位定位，每日上午9：00～12：00采用0.35 mm×25 mm的針灸針自百會(huì)穴呈15°向太陽(yáng)穴方向遞進(jìn)透刺，行捻轉(zhuǎn)手法，200 r/min，每次行針2 min，1次/d。每組均連續(xù)干預(yù)14 d。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè)：各組大鼠干預(yù)結(jié)束后第2天上午9：00～12：00進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。①曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：將大鼠置入曠場(chǎng)，記錄5 min內(nèi)大鼠在曠場(chǎng)中的穿格數(shù)(Number of squares crossed,NSC)和直立次數(shù)(Number of rearing,NR)，并記錄在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間百分比(Residence time distribution in center，RTDC)。RTDC=(中央?yún)^(qū)停留時(shí)間/總觀察時(shí)間)×100%。NSC、NR主要反映大鼠運(yùn)動(dòng)能力，RTDC下降則與焦慮行為發(fā)生有關(guān)。②高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)：將大鼠置于中央?yún)^(qū)，面向任意一個(gè)開放臂，記錄其在5 min內(nèi)進(jìn)入開放臂和閉合臂的次數(shù)及停留時(shí)間，計(jì)算進(jìn)入開放臂次數(shù)的百分比(Percentage of access the open arms,PAOA)、開放臂停留時(shí)間百分比(Residence time distribution in the open arms,RTDOA)。PAOA=開放臂進(jìn)入次數(shù)/(開放臂進(jìn)入次數(shù)+閉合臂進(jìn)入次數(shù))×100%；RTDOA=開放臂停留時(shí)間/(開放臂停留時(shí)間+閉合臂停留時(shí)間)×100%。PAOA、RTDOA下降與焦慮行為發(fā)生有關(guān)。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，噴灑200 ml/L乙醇祛除實(shí)驗(yàn)設(shè)備中的殘留氣味。

1.2.3 蛋白免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射600 mg/kg水合氯醛深度麻醉，隨后快速心臟灌注150 ml濃度為0.01 mol/L的PBS溶液，予250 ml的40 g/L多聚甲醛固定。斷頭，剝離腦組織并固定4 h，隨后將腦組織轉(zhuǎn)移至300 g/L蔗糖溶液中，直至腦組織沉底。切取大鼠新鮮杏仁核組織，提取蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗4 ℃過夜，二抗常溫孵育2 h。隨后顯影、定影、拍照，分析IL-10和TNF-α、β-actin各曝光條帶面積和灰度的乘積，計(jì)算各指標(biāo)與β-actin的比值。

2 結(jié) 果

2.1 各大鼠NSC、NR、RTDC比較 見表1。各組大鼠NSC、NR比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組RTDC明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黛力新組、透穴刺法組RTDC高于模型組；且透穴刺法組RTDC高于黛力新組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各大鼠NSC、NR、RTDC比較

2.2 各大鼠PAOA、RTDOA比較 見表2。透穴刺法組PAOA高于正常組、模型組和黛力新組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。模型組RTDOA低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黛力新組、透穴刺法組RTDOA高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且透穴刺法組RTDOA高于黛力新組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各大鼠PAOA、RTDOA比較(%)

2.3 各組大鼠TNF-α、IL-10水平比較 見表3(圖1、2)。模型組大鼠TNF-α高于正常組，IL-10低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。黛力新組、透穴刺法組TNF-α水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。透穴刺法組IL-10水平高于模型組、黛力新組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠TNF-α、IL-10水平比較(pg/ml)

圖1 各組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)

圖2 各組大鼠IL-10蛋白表達(dá)

3 討 論

帕金森病是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，焦慮是其常見的非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀之一，采取可靠方案緩解焦慮，有助于改善患者生活質(zhì)量，提升帕金森病治療效果[7-8]。杏仁核是腦內(nèi)邊緣系統(tǒng)重要器官，在學(xué)習(xí)記憶、情緒及行為調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用，研究顯示帕金森病進(jìn)展期間杏仁核可能出現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)改變[9]，因此推測(cè)其與患者焦慮等癥狀有關(guān)，故本研究以杏仁核為研究對(duì)象，探討透穴刺法對(duì)帕金森病焦慮大鼠杏仁核TNF-α及IL-10水平的影響。

采用6-OHDA損毀單側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束是帕金森病大鼠的有效造模方案[10-11]，但所制備的帕金森病大鼠模型是否能夠表現(xiàn)出類似于人類的焦慮樣行為，目前仍有一定爭(zhēng)議。劉椰等[12]研究顯示采用上述方案制備的帕金森病模型呈現(xiàn)出一定的焦慮樣行為，但Carvalho等[13]報(bào)道指出上述方案制備的帕金森病模型雖然有一定抑郁表現(xiàn)，但欠缺焦慮表現(xiàn)。為規(guī)避這一問題，本研究在6-OHDA處理的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過每日應(yīng)激刺激誘導(dǎo)焦慮行為，通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，每日應(yīng)激不會(huì)影響帕金森病大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，但會(huì)導(dǎo)致其RTDC下降，高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)也顯示每日應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠RTDOA降低，這均說明其表現(xiàn)出焦慮行為，與既往報(bào)道[14]結(jié)論相符。

本研究結(jié)果提示透穴刺法能夠有效改善帕金森病焦慮大鼠的焦慮癥狀，且這種焦慮改善效果優(yōu)于常見抗焦慮藥物黛力新，這與既往針對(duì)焦慮治療的報(bào)道結(jié)論相一致[15-16]。從中醫(yī)理論角度而言，這可能是因?yàn)橥秆ù谭ㄗ饔糜诎贂?huì)穴等百脈匯聚之處，能夠通調(diào)陰陽(yáng)，連貫全身經(jīng)穴，調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽(yáng)平衡，還可疏肝理氣，平肝潛陽(yáng)，調(diào)暢情志[17]。另一方面，現(xiàn)代神經(jīng)生理研究也證實(shí)，針刺百會(huì)穴可以直接興奮上行的激活系統(tǒng)，改善大腦細(xì)胞新陳代謝、增強(qiáng)腦活力、提高腦氧含量，從而促進(jìn)腦功能重建，減輕焦慮樣行為。吳成舉等[18]研究也表明類似的針刺療法能夠促進(jìn)帕金森病大鼠的腦組織功能恢復(fù)。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，帕金森病焦慮的形成可能與腦組織炎癥反應(yīng)有關(guān)。腦組織炎癥反應(yīng)可能損傷神經(jīng)元，加速細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，從而促進(jìn)帕金森病的發(fā)展，并誘發(fā)焦慮等非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀，這與張楠等[19]實(shí)驗(yàn)結(jié)論相符。本研究中，相較于模型組，透穴刺法組TNF-α表達(dá)水平下降，IL-10表達(dá)水平升高，說明透穴刺法能夠減輕腦組織炎癥反應(yīng)，趙鵬等[20]對(duì)120例腦卒中患者的隨機(jī)對(duì)照研究也顯示，針刺療法有助于改善患者全身炎癥反應(yīng)。