文小竹，譚光波，樸金安(韓國)

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是呼吸系統(tǒng)的常見病，具有病程長、反復(fù)發(fā)作的特點，其對肺功能及肺組織造成不可逆的損傷，并給患者及其家庭帶來沉重負擔(dān)[1-2]。COPD病因和發(fā)病機制目前并未完全闡明，被認為可能與吸煙、生物燃料、空氣污染、遺傳等因素有關(guān)，慢性炎癥是其發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)[3]。Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)/髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)作為炎癥反應(yīng)的經(jīng)典通路，在COPD發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[4]。近年來中醫(yī)藥在改善COPD患者耐受性及生活質(zhì)量方面取得一定效果并受到廣泛關(guān)注，但鮮有TLR4/MyD88/NF-κB通路相關(guān)的研究[5]。本研究對COPD大鼠模型進行不同干預(yù)，以TLR4/MyD88/NF-κB通路為切入點，探討補肺健脾益腎方改善COPD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：清潔級Wistar大鼠40只，雌雄各20只，6～8周齡，體重150～210 g，平均(182.14±15.64)g，均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，且未限制每日進水、進食，室溫控制在20～24 ℃，濕度為50%，按照動物日節(jié)律調(diào)節(jié)光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.1.2 主要儀器與試劑：病理組織包埋機(BM-Ⅱ型，安徽電子科學(xué)研究所)、切片機(AO型，德國Leica公司)、顯微攝像儀(20486型，日本Olympus公司)、實時熒光定量儀(CFX384Touch型，美國Bio-Rad公司)、離心機(LDZ5-2型，北京京立離心機有限公司)、雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、超低溫冷凍柜(ULT-1386-3型，美國Revco Value公司)，TLR4、MyD88、NF-κB抗體均購自CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 補肺健脾益腎方：黃芪30 g，黨參、茯苓、熟地黃各20 g，白術(shù)、丹參各15 g，防風(fēng)、淫羊藿、紫河車、山茱萸、陳皮、法半夏各10 g。以水煎煮2次，過濾后濃縮為1.25 g/ml藥液。

1.2.2 模型的建立與分組：采用隨機數(shù)字表法將40只大鼠隨機分為模型組、常規(guī)組、實驗組、正常組，每組10只。除正常組外，其余組參照周鳳等[6]實驗研究采用亞硝胺煙霧暴露加脂多糖氣管滴注方案建立COPD大鼠模型。具體方法為：予氣管內(nèi)脂多糖滴注，劑量為2 ml/kg，1次/周，持續(xù)6周，其余時間則每天同一時間將大鼠放置于自制有機透明儲物箱內(nèi)，使其暴露于亞硝胺煙霧內(nèi)(將點燃的亞硝胺通過懸掛使其煙霧注入自制箱)，每次暴露時間為0.5 h，持續(xù)6周；正常組則采用等劑量0.9%氯化鈉溶液進行氣管滴注，且在自制箱內(nèi)注入正?？諝?。各組滴注劑量、頻率相同。

1.2.3 給藥：自第7周開始正常組及模型組予0.9%氯化鈉溶液5 ml/(kg·d)滴灌入胃，常規(guī)組予孟魯司特鈉混懸液1 mg/(kg·d)滴灌入胃，實驗組在常規(guī)組基礎(chǔ)上予補肺健脾益腎方6.25 g/(kg·d)滴灌入胃，各組均連續(xù)給藥6周。

1.2.4 取材：給藥結(jié)束后第1 天通過動脈放血法處死所有大鼠，在大鼠頸部做一切口并進行逐層分離，打開胸腔充分顯示雙肺，止血鉗夾閉右肺門后在氣管軟骨間作一切口并采用0.9%氯化鈉溶液反復(fù)灌洗，3次注入灌洗液共6 ml，收集灌洗液，離心，置于-80 ℃冰箱保存；取右肺標本浸泡于4%多聚甲醛緩沖液。

1.2.5 一般情況觀察：監(jiān)測各組大鼠皮毛、呼吸、活動、飲食、體重變化等情況，大鼠測量體重頻率為2次/周；記錄各組大鼠死亡情況，并分析其原因。

1.2.6 PCR檢測TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平：采取實時熒光定量法(PCR)測量TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達。取出約100 mg組織用勻漿器勻漿后離心，提取溶液mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物加入1%瓊脂糖凝膠電泳，采用計算機分析目的電泳條帶，實驗結(jié)果采用兩者積分吸光度的比值表示。TLR4引物：上游引物 5’-AGGGTTTCCTGTCAGTATCAAGTTT-3’，下游引物5’-TGATGCCTCCCTGGCTCCT-3’，片段長度140 bp；MyD88引物：上游引物 5’-TATACCAACCCTTGCACCAAGTC-3’，下游引物5’- CAGGCTCCAAGTCAGCTCATC-3’，片段長度134 bp；NF-κB引物：上游引物5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，片段長度153 bp。內(nèi)參Gapdh引物：上游引物5’-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3’，下游引物 5’-TGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’，片段長度122 bp。

1.2.7 肺組織形態(tài)學(xué)評分[7]：低倍光鏡下觀察肺組織進行形態(tài)學(xué)評分，該評分包括上皮細胞變性壞死糜爛脫落、氣道管壁黏膜充血水腫、氣道管壁中性粒細胞浸潤，每個指標均采?、?Ⅵ級評分，分數(shù)越高表明該項指標炎癥發(fā)生情況越嚴重。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 模型組大鼠干預(yù)期間毛發(fā)逐漸枯黃無光澤、倦怠少動、小便量增多、飲食減少，且分別于第5周、第8周各死亡1只，經(jīng)解剖考慮肺氣腫合并肺部感染所致。常規(guī)組和實驗組精神略顯疲乏，但其活動量、進食量明顯優(yōu)于模型組，常規(guī)組在治療第6周死亡1只，經(jīng)解剖考慮肺氣腫合并肺膿腫所致；正常組大鼠干預(yù)期間皮毛光亮，活動無明顯減少，飲水進食均正常，體重呈正常增長趨勢。

2.2 各組大鼠TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達比較 見表1(圖1、2)。與正常組比較，模型組大鼠TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平均高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，常規(guī)組、實驗組以上指標均低，且實驗組低于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組大鼠TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達比較

2.3 各組大鼠肺組織評分比較 見表2。與正常組比較，模型組大鼠肺組織上皮細胞變性壞死糜爛脫落、氣道管壁黏膜充血水腫、氣道管壁中性粒細胞浸潤評分均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，常規(guī)組、實驗組以上指標均低，且實驗組低于常規(guī)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

A：模型組；B：常規(guī)組；C：實驗組；D：正常組

A：模型組；B：常規(guī)組；C：實驗組；D：正常組

表2 各組大鼠肺組織評分比較(分)

3 討 論

中醫(yī)并無COPD病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸入“咳喘”“肺脹”范疇，其主要病機為本虛標實，病情復(fù)雜多變、纏綿難愈，病位在肺，后期可涉及脾、腎、心[8-9]?！皻飧谀I，肺氣虛耗，母病及子，腎失攝納”，肺、脾、腎三臟失常引起氣短、呼多吸少[10]。補肺健脾益腎方益氣扶正、疏風(fēng)散邪，共同發(fā)揮補肺健脾益腎之效，本研究采用補腎健脾益腎方干預(yù)COPD模型大鼠，探討其治療COPD的可能作用機制[11]。COPD作為一種慢性消耗性疾病， “肺病久傷脾，子病及母，脾胃失于健運，不能生化水谷”致使脾肺虧虛，導(dǎo)致患者營養(yǎng)代謝異常、體重下降等[12-13]。補肺健脾益腎方通過調(diào)補肺腎，補衛(wèi)表之氣提中焦之氣，滋肺化源，氣機通利，無懼邪擾，肺腎同治，氣陰雙調(diào)，咳喘俱消[14]。

本研究結(jié)果顯示，藥物干預(yù)后，實驗組、常規(guī)組大鼠TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA水平均低于模型組，實驗組、常規(guī)組大鼠氣道內(nèi)炎癥反應(yīng)受到抑制，氣道黏膜水腫得到緩解，氣道內(nèi)黏液分泌減少從而改善氣道壁炎性浸潤，氣流受限程度減輕，故其活動度、進食量、煩躁程度等均得到明顯恢復(fù)，且實驗組改善程度優(yōu)于常規(guī)組[15]。表明補肺健脾益腎方通過改善模型大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路改善COPD肺部癥狀，防止COPD進展。TLR4主要在抗原呈遞細胞及部分實質(zhì)細胞內(nèi)表達，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要分布在小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元表面，可在一系列反應(yīng)下介導(dǎo)MyD88，募集到受體細胞內(nèi)后激活白介素相關(guān)激酶，磷酸化后與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6結(jié)合，激活NF-κB并暴露核定位信號，使得NF-κB活化并進入細胞核啟動轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤壞死因子α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12，促進外周炎性細胞向氣道組織移動、黏附和浸潤，加重組織損傷[16]。TLR4/MyD88/NF-κB作為慢性炎癥機制關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在COPD的形成過程中發(fā)揮不可忽視的作用，本研究中補肺健脾益腎方可能通過TLR4/MyD88/NF-κB通路減輕氣道慢性炎癥反應(yīng)和肺壁破壞，實現(xiàn)對COPD模型大鼠的治療[17]。這與秦燕勤等[18]關(guān)于補肺益腎方對COPD模型兔炎癥因子改善效果的研究結(jié)果一致。

補肺健脾益腎方重用黃芪補氣升陽、益衛(wèi)固表，可“補諸虛”“益元氣”“壯脾胃”，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)證實其可松弛平滑肌，擴張心、肺血管，改善缺氧，與黨參同用益氣健脾，和熟地黃、淫羊藿等合用有補腎助陽之效，共為君藥；白術(shù)、茯苓健脾化濕，山茱萸補腎澀精，與紫河車同用有益氣養(yǎng)血之效，共為臣藥；法半夏、陳皮燥濕化痰，防風(fēng)解表散寒，丹參活血化瘀，四者共為佐使；全方扶正益氣、化痰活血，共奏補肺健脾益腎之效、降氣散瘀之功[19-20]。

綜上，在孟魯司特鈉基礎(chǔ)上使用補肺健脾益腎方，可通過抑制模型大鼠TLR4/MyD88/NF-κB通路改善肺組織炎癥狀態(tài)，從而延緩或阻止COPD的炎癥進程。