崔德鳳,黃文強，董劍輝,溫海京，劉希紅,張志剛,張永紅*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206； 2.楊凌知新生物科技有限公司，陜西楊凌，710016)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以水樣腹瀉、嘔吐、脫水為特征的一種高度接觸性傳染病，其中不同年齡和不同品種的豬群均可感染，但對哺乳仔豬、架子豬或育肥豬的危害較大，尤其是哺乳仔豬受害最為嚴(yán)重，發(fā)病率高達100%，死亡率為30%～80%[1-3]。目前，控制該病主要是以疫苗免疫為主[4]。中國現(xiàn)有疫苗在不同地區(qū)使用時的免疫保護效果存在一定差異，市場迫切需要高安全性、更高保護率的豬流行性腹瀉疫苗[4]。本課題組前期分離出一株病毒含量高、免疫原性好的豬流行性腹瀉病毒PEDV-WN株，鑒定后用于疫苗的研究及生產(chǎn)。滅活疫苗的研發(fā)中，其滅活工藝是最為關(guān)鍵的一部分，好的滅活劑應(yīng)該是可以徹底滅活病毒同時又不影響病毒的免疫原性，并且對外界環(huán)境和動物是安全的。傳統(tǒng)滅活劑甲醛是通過對病毒蛋白羧基端發(fā)生作用，從而使病毒失活，失去感染性[5]。甲醛雖具有滅活病毒快速、徹底的特點，但它屬致癌物，殘留的游離甲醛隨疫苗注入動物機體后，會產(chǎn)生刺激性反應(yīng)，同時使部分病毒蛋白結(jié)構(gòu)破壞，進而因蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而降低免疫原性[6]。近些年來，研究者對β-丙內(nèi)酯、N-乙酰乙烯亞胺、二乙烯亞胺(binary ethylenimine，BEI)等化學(xué)滅活劑進行諸多研究，其中二乙烯亞胺是一種烷化劑，能破壞病原微生物的核酸，使其不再具有復(fù)制能力，但不影響其蛋白成分的結(jié)構(gòu)，從而最大限度保持病毒的抗原性[7-11]。二乙烯亞胺已經(jīng)在疫苗生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，取得很好的滅活效果。

本研究用甲醛和二乙烯亞胺進行豬流行性腹瀉病毒PEDV-WN株的滅活，將滅活病毒液接種生長良好的Vero細(xì)胞進行滅活效果的檢驗，檢驗合格的滅活抗原乳化配苗，并進行安全和效力試驗，以期為豬流行性腹瀉病毒PEDV-WN株滅活疫苗工藝的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

豬流行性腹瀉病毒PEDV-WN株病毒液，病毒含量107.64 TCID50/mL和Vero細(xì)胞系，F(xiàn)20，由楊凌知新生物科技有限公司提供；二乙烯亞胺，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫代硫酸鈉和甲醛購自國藥集團有限公司；小白鼠，42～56日齡(約20 g/只)，12只，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，豬流行性腹瀉病毒中和抗體均不高于1∶4母豬所產(chǎn)的3～5日齡健康仔豬，35只，購自陜西省咸陽市郊某豬場。該試驗已通過北京農(nóng)學(xué)院動物福利與倫理審查，編號為BUA2020110。

1.2 方 法

1.2.1 二乙烯亞胺的配制 將提前配制好的1.8 mol/L二乙烯亞胺溶液330 mL與1.8 mol/L的NaOH溶液670 mL分別預(yù)溫至42 ℃后混勻，磁力攪拌器攪拌，80～120 r/min離心，通風(fēng)櫥環(huán)境下攪拌3 h，攪拌開始后15～120 min和環(huán)化終點分別采樣測定pH值(兩個點的pH值為12～13)，配制成0.6 mol/L二乙烯亞胺溶液(pH值為12～13)，可在2～8 ℃保存20 d。二乙烯亞胺溶液使用之前，5 mol/L鹽酸與二乙烯亞胺溶液的體積比約為1∶40，將二乙烯亞胺溶液pH值調(diào)整至8.0～8.3，盡量1 h內(nèi)用完。

1.2.2 硫代硫酸鈉的配制 稱50 g無水硫代硫酸鈉，溶于50 mL滅菌去離子水中，定容至100 mL，過濾除菌，配制成3.16 mol/L的硫代硫酸鈉溶液，室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 二乙烯亞胺的毒性試驗 用“1.2.1”配制好的二乙烯亞胺溶液，通過皮下注射接種小白鼠，每只0.15 mL，共6只，接種后觀察27 d。同時用生理鹽水注射小白鼠，每只0.15 mL，共6只，作為對照組。

1.2.4 甲醛和二乙烯亞胺對豬流行性腹瀉病毒的滅活 取病毒液3瓶，500 mL/瓶，加入甲醛溶液(含40%甲醛)，998 mL病毒液中添加2 mL甲醛為0.2%甲醛溶液、997 mL病毒液中添加3 mL甲醛為0.3%甲醛溶液、996 mL病毒液中添加4 mL甲醛為0.4%甲醛溶液，將病毒液在室溫條件下300 r/min攪拌24 h，分別在滅活8、12、16、20和24 h后各取10 mL置無菌容器，按0.7%的體積比加入硫代硫酸鈉，繼續(xù)攪拌30 min以中和二乙烯亞胺，獲得不同條件下滅活后的病毒液。

取病毒液3瓶，500 mL/瓶，加入二乙烯亞胺溶液，使其濃度分別為0.005、0.010和0.020 mol/L，將病毒液在室溫條件下，按照甲醛滅活病毒液的方法，獲得滅活8、12、16、20和24 h后的病毒液。

1.2.5 甲醛和二乙烯亞胺對豬流行性腹瀉病毒滅活效果的檢驗 將“1.2.4”滅活后的病毒液接種至良好單層Vero細(xì)胞瓶，每瓶1 mL，吸附1 h后棄液，加入MEM培養(yǎng)基5 mL，置于37 ℃的5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，置于-15 ℃以下凍融細(xì)胞瓶，將上一代細(xì)胞凍融液接種到下一代細(xì)胞瓶中，按照此方式，將細(xì)胞液再盲傳2代。觀察并記錄細(xì)胞是否出現(xiàn)細(xì)胞病變。

1.2.6 滅活病毒液無菌檢驗 取滅活檢驗合格的病毒液1 mL，接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(Thioglycollate Medium，TG)50 mL，置35～37 ℃培養(yǎng)，3 d后吸取培養(yǎng)物，接種2支TG小管，0.2 mL每支，1支置23～25 ℃培養(yǎng)，1支置35～37 ℃培養(yǎng)，另取0.2 mL，接種胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Trypticase Soy Broth，TSB)小管1支，置23～25 ℃培養(yǎng)，無菌生長。均培養(yǎng)7 d。

1.2.7 安全性檢驗 將滅活檢驗合格的病毒液與佐劑按一定比例混合后進行乳化制備滅活疫苗。將制備好的滅活疫苗以胸部肌肉注射方式接種健康易感母豬(豬流行性腹瀉病毒中和抗體不高于1∶4)所產(chǎn)3～5日齡哺乳仔豬，1 mL/頭，每組5頭，設(shè)立免疫組(0.010 mol/L二乙烯亞胺滅活PEDV-WN油乳劑疫苗)、免疫對照組(0.3%甲醛滅活PEDV-WN油乳劑疫苗)和空白對照組(PBS油乳劑疫苗)，見表1，觀察14 d。

表1 仔豬免疫分組情況(n=5)Tab.1 Immunization group situation(n=5)

1.2.8 效力檢驗

將制備好的滅活疫苗以胸部肌肉注射方式接種健康易感母豬(豬流行性腹瀉病毒中和抗體不高于1∶4)所產(chǎn)3～5日齡哺乳仔豬，1 mL/頭，每組5頭，設(shè)立免疫組(0.010 mol/L二乙烯亞胺滅活PEDV-WN油乳劑疫苗)、免疫對照組(0.3%甲醛滅活PEDV-WN油乳劑疫苗)、攻毒對照組和空白對照組(PBS油乳劑疫苗)，見表2。觀察14 d后進行再次免疫，7 d后各免疫組與攻毒組口服PEDV-WN株2 mL(病毒含量為107.64 TCID50/mL)，連續(xù)觀察10 d。

表2 仔豬免疫分組情況(n=5)Tab.2 Piglet grouping situation(n=5)

2 結(jié) 果

2.1 二乙烯亞胺的毒性試驗

二乙烯亞胺接種6只小白鼠后觀察28 d，所有小鼠均健活，精神狀態(tài)良好，無異常反應(yīng)，表明二乙烯亞胺是安全的。

2.2 甲醛和二乙烯亞胺對豬流行性腹瀉病毒的滅活效果驗證

加入不同體積分?jǐn)?shù)甲醛的病毒液，滅活不同時間后取樣，進行滅活檢驗，結(jié)果見表3。0.2%甲醛，滅活24 h后，Vero細(xì)胞無細(xì)胞病變，說明病毒被完全滅活；0.3%甲醛，滅活16 h后，Vero細(xì)胞無細(xì)胞病變，說明病毒被完全滅活；0.4%甲醛，滅活12 h后，Vero細(xì)胞無細(xì)胞病變，說明病毒被完全滅活。當(dāng)使用甲醛滅活病毒的時候，將其滅活條件確定為體積分?jǐn)?shù)0.3%甲醛，滅活時間16 h。

表3 不同體積分?jǐn)?shù)甲醛滅活病毒液檢驗結(jié)果Tab.3 Virus solution inactivation test results after different volume fraction of formaldehyde inactivated for different times

不同濃度二乙烯亞胺，滅活不同時間，進行滅活效果檢驗，結(jié)果見表4。二乙烯亞胺0.005 mol/L，滅活8～24 h后，Vero細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞病變，說明病毒未被完全滅活；二乙烯亞胺0.010 mol/L和0.020 mol/L，滅活8 h后，Vero細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞病變，說明病毒未被完全滅活，但是滅活12～24 h后，Vero細(xì)胞無病變，說明病毒已被完全滅活。當(dāng)使用二乙烯亞胺滅活病毒的時候，將其滅活條件確定為濃度0.010 mol/L，滅活時間12 h。

表4 不同濃度二乙烯亞胺滅活病毒液檢驗結(jié)果Tab.4 Virus solution inactivation test results after different concentrations of BEI inactivated for different times

2.3 無菌檢驗

滅活檢驗合格的病毒液無菌檢驗見表5。滅活檢驗合格的病毒液均無菌生長。

表5 病毒液無菌檢驗結(jié)果Tab.5 Results of sterility test of virus liquid

2.4 滅活疫苗安全性檢驗結(jié)果

各組仔豬接種不同滅活疫苗后，連續(xù)觀察14 d，各組仔豬精神狀態(tài)良好，未觀察到任何不良癥狀，剖檢后觀察各器官均正常，未有任何病變，見圖1。

2.5 滅活疫苗效力檢驗結(jié)果

免疫組、免疫對照組仔豬接種不同滅活疫苗后，用PEDV-WN毒株進行攻毒，免疫對照組仔豬發(fā)病率為20%，疫苗保護率為80%；0.010 mol/L免疫組仔豬發(fā)病率為0%，疫苗保護率為100%，結(jié)果如表6所示。

表6 滅活疫苗效力檢驗結(jié)果Tab.6 Efficacy test results of inactivated vaccines

3 討 論

豬流行性腹瀉病毒自1970年在歐洲首次出現(xiàn)以來，對全球養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生負(fù)面的經(jīng)濟影響[1]。迄今為止，通過疫苗接種保護豬群免受豬流行性腹瀉病毒感染并限制豬流行性腹瀉病毒傳播的努力僅取得有限的成功。中國于2010年爆發(fā)豬流行性腹瀉，盡管大多數(shù)豬種群已使用源自PEDV株CV777的商業(yè)疫苗進行免疫，但在中國養(yǎng)豬業(yè)中仍普遍存在由PEDV變異株引起的豬流行性腹瀉，市場上現(xiàn)有的商業(yè)疫苗無法為豬群提供全面的保護。常見的豬流行性腹瀉病毒疫苗主要包括：弱毒疫苗、滅活疫苗、基因工程疫苗這3種類型[4]。弱毒疫苗存在疫苗毒株不穩(wěn)定、毒株返強、毒株容易擴散、疫苗儲存條件要求比較高等問題，疫苗的研究與生產(chǎn)工藝還需要進一步探索?；蚬こ桃呙绱嬖诳乖坎蛔愕葐栴}。研究最多的就是滅活疫苗，滅活疫苗具有安全性較好、制備工藝簡單以及疫苗易于運輸?shù)葍?yōu)點，并且滅活疫苗的免疫效果較好，具有廣闊的發(fā)展空間。

在滅活疫苗的制作工藝中，病毒液的滅活是其最關(guān)鍵的一步。傳統(tǒng)的滅活劑甲醛，是一種通過影響蛋白的結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致病毒失活的化學(xué)物質(zhì)。甲醛滅活的效果容易受外界環(huán)境的影響，比如，溫度、濃度、酸堿性以及病原本身各種因素，并且甲醛的毒性比較高，且不易分解，容易造成疫苗中甲醛含量偏高，對動物造成一定的危害，降低疫苗的免疫原性[5]。好的滅活劑不僅僅可以充分使病毒滅活，同時也會保證病毒的免疫原性不會受到破壞，對外界及免疫動物不會造成任何危害，儲存方法以及運輸具有一定的優(yōu)勢。近些年來，研究者對β-丙內(nèi)酯、N-乙酰乙烯亞胺、二乙烯亞胺等化學(xué)滅活劑進行一系列的研究，其中二乙烯亞胺是一種烷化劑，由于其保存、運輸比較方便，且毒性較小，很多研究者將其作為理想的滅活劑首選。二乙烯亞胺的滅活機制主要是通過一系列的烷化反應(yīng)，改變病毒DNA的結(jié)構(gòu)，從而影響RNA的合成，參與病毒細(xì)胞的生命活動影響其病毒核酸的合成，最終達到滅活的效果。與傳統(tǒng)的滅活劑甲醛相比較，二乙烯亞胺通過影響病毒核酸的合成而達到滅活的效果，不會改變病毒抗原蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而使疫苗保持更好的免疫效果，是滅活疫苗制作工藝中比較理想的滅活劑[10-11]。許多研究表明，二乙烯亞胺已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到新城疫病毒、禽流感病毒、豬偽狂犬病毒等疫苗的制作工藝中，并取得理想的效果[12-13]。研究二乙烯亞胺對不同病毒最佳滅活條件的開發(fā)對滅活疫苗工藝的研究具有重要的意義。

本試驗將二乙烯亞胺接種小白鼠后發(fā)現(xiàn)小白鼠均健活，說明二乙烯亞胺安全，可將其應(yīng)用于后面的研究中。將不同體積分?jǐn)?shù)的甲醛和不同濃度的二乙烯亞胺加入至豬流行性腹瀉PEDV-WN株病毒液中進行病毒的滅活，當(dāng)加入0.3%的甲醛，室溫滅活16 h后，可使病毒完全滅活，且病毒無菌檢驗合格。當(dāng)加入濃度為0.010 mol/L的二乙烯亞胺，在室溫滅活12 h后，可使病毒完全滅活，且病毒無菌檢驗合格。將滅活后的病毒液乳化配苗，接種3～5日齡的仔豬，發(fā)現(xiàn)其安全性較好，二次免疫7 d后，對仔豬進行攻毒，二乙烯亞胺滅活制備的疫苗比甲醛滅活制備的疫苗保護率高，為100%。雖然甲醛可以使病毒液完全滅活，但是甲醛的毒性比較高，不易分解，制備的疫苗保護率達不到100%。確定使用濃度為0.010 mol/L的二乙烯亞胺對PEDV-WN株病毒液進行滅活，將其用于豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗的制備工藝中。本研究為豬流行性腹瀉病毒PEDV-WN株滅活疫苗的研究提供基礎(chǔ)，為下一步豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定工藝基礎(chǔ)。