申維維，吳 瓊，胡 迪，溫海京，胡 婷，范礦士，王建舫，張永紅，崔德鳳

(北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院/獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 102206)

中國畜牧業(yè)養(yǎng)殖在生產(chǎn)中抗生素、化藥、激素等超量且不合理使用，使畜禽產(chǎn)品安全性降低[1]。益生菌在腸道中扮演著十分重要的角色，不僅可以調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物體系，還能保護機體腸道不受侵害，在發(fā)揮益生功能的同時產(chǎn)生活性物質(zhì)和抑制有害菌物質(zhì)[2]。

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)屬于芽孢桿菌屬，呈桿狀，革蘭氏陽性菌，端生芽孢，無鞭毛。最適生長溫度為45～50 ℃，最適pH值6.6～7.0，在室溫且避光的環(huán)境中其有效作用可長達720 d，主要具有“四耐”抗逆作用，具體表現(xiàn)為耐熱、耐氧、耐鹽、耐酸堿[3-4]。夏濤等[5]研究證明，在肉雞養(yǎng)殖生產(chǎn)中，飼喂凝結(jié)芽孢桿菌，可顯著改善肉雞生長性能并能提高飼料碳水化合物和脂肪的消化。HUNG等[6]在飼養(yǎng)肉雞的過程中添加凝結(jié)芽孢桿菌，結(jié)果表明該菌同樣可顯著提高肉雞的生長性能并能改善腸道吸收功能。

本試驗采取凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI飼喂肉雞，探究凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI在實際飼養(yǎng)過程中是否能代替抗生素的使用，從而起到減少抗生素殘留同時達到促進肉雞生長，改善腸道功能的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI保存于北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室。3日齡健康雄性肉雞(110～140 g)，共計75只，購自北京愛拔益加家禽育種有限公司，飼養(yǎng)于北京農(nóng)學院球蟲實驗室動物房，室溫25 ℃，濕度50%～60%。該試驗已通過北京農(nóng)學院動物福利與倫理審查，編號為BUA2021003。

超凈工作臺(東聯(lián)哈爾制造公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱、全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器公司)，電子天平(上海天平儀器廠)，4%多聚甲醛(Chiefeng公司)，蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天)，二甲苯無水乙醇(北京化工廠)，營養(yǎng)肉湯(北京奧博星)，麥康凱瓊脂(北京奧博星)，MRS培養(yǎng)基(solarbio)，營養(yǎng)瓊脂(solarbio)。

1.2 試驗設(shè)計及分組

75只肉雞經(jīng)過適應性飼養(yǎng)3 d后，隨機分為5組：對照組、抗生素組、凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組，每組15只。

對照組為基礎(chǔ)日糧；抗生素組為基礎(chǔ)日糧加桿菌肽；凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組為基礎(chǔ)日糧加凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI，細菌數(shù)2×107CFU/mL；凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組為基礎(chǔ)日糧加凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI，細菌數(shù)2×108CFU/mL；凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組為基礎(chǔ)日糧加凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI，細菌數(shù)2×109CFU/mL。

試驗期35 d，每7 d為一個周期對試驗肉雞稱量體質(zhì)量、采血和剖檢。

采用的日糧為無抗生素添加的基礎(chǔ)日糧，主要由玉米和豆粕組成(表1)。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutritional level of basal diet

1.3 飼養(yǎng)管理

首先對雞舍進行全面沖刷、消毒，提前2 d進行照射升溫。試驗肉雞分層飼養(yǎng)，每天人工給料1次，自由采食，自由飲水，雞舍內(nèi)照射熱燈，保障舍內(nèi)適宜的溫度和濕度，試驗1～7 d雞舍溫度控制在32～34 ℃，之后雞舍溫度控制在25 ℃左右。雞舍濕度為50%～60%，注意雞舍衛(wèi)生及合理通風。

1.4 樣品采集與檢測

1.4.1 樣品采集和生長指標測定 肉雞飼養(yǎng)第7天、第14天、第21天、第28天和第35天早8：00，肉雞稱量體質(zhì)量，稱量體質(zhì)量前一天晚上禁食，自由飲水。在第14天和第28天時，每組取3只肉雞剖檢，取空腸、回腸、十二指腸腸道組織用4%多聚甲醛固定，固定24 h后進行包埋試驗。每天記錄給料質(zhì)量，每組取3只肉雞采血、剖殺，稱取半凈膛質(zhì)量、全凈膛質(zhì)量，胸肌質(zhì)量和腿肌質(zhì)量，按照公式計算各項指標。

平均日采食量=采食量/試驗時間

料重比=平均日采食量/平均日增體質(zhì)量

胸肌率(%)=(兩側(cè)胸肌質(zhì)量/全凈膛質(zhì)量)×100

腿肌率(%)=(兩側(cè)腿肌質(zhì)量/全凈膛質(zhì)量)×100

1.4.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 將空腸、回腸、十二指腸腸道制作組織切片并進行蘇木精-伊紅染色，電子顯微鏡下觀察組織形態(tài)與結(jié)構(gòu)。

絨毛高度：取腸絨毛頂部到底部的距離，取3個值，計算其平均數(shù)。

隱窩深度：腸黏膜肌層至腸腺開口，取3個值，計算其平均數(shù)。

1.4.3 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞盲腸內(nèi)乳酸菌及大腸桿菌的影響 稱取0.1 g盲腸內(nèi)容物于滅菌的離心管中，吸取1 mL無菌生理鹽水，充分混勻，再用滅菌的生理鹽水進行10倍倍比稀釋。

瓊脂培養(yǎng)基：計數(shù)乳酸桿菌，稱取27.5 g培養(yǎng)基于滅菌的三角瓶中，加500 mL去離子水，進行高壓滅菌。

麥康凱培養(yǎng)基：計數(shù)大腸桿菌，稱取26 g培養(yǎng)基于滅菌的三角瓶中，加入500 mL去離子水，微波爐加熱溶解，進行高壓滅菌。

采用傾注法計數(shù)：吸取0.1 mL進行稀釋倍數(shù)為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的盲腸內(nèi)容物稀釋液至無菌平皿。

將高壓滅菌的MRS、麥康凱培養(yǎng)基倒入加有稀釋好的盲腸內(nèi)容物平皿中，待培養(yǎng)基凝固后，放入37 ℃溫箱，24 h后進行盲腸內(nèi)乳酸菌及大腸桿菌的計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)均用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計處理，結(jié)果用均值±標準差(Mean±SD)表示，用單因素方差分析差異顯著性，主要分為四種：一是無顯著差異(P>0.05)，二是有顯著性差異P<0.05，三是有極顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.01)，最后是有非常顯著性統(tǒng)計學差異(P<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞生長性能的影響

2.1.1 對肉雞平均日采食量的影響 肉雞平均日采食量隨著飼養(yǎng)時間的增加呈逐漸上升的趨勢，飼喂前期各組之間并沒有顯著差異(圖1)。肉雞飼養(yǎng)35 d時，抗生素組與對照組差異極顯著(P<0.01)，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組非常顯著高于對照組(P<0.001)。肉雞在其他飼養(yǎng)時間內(nèi)，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組日采食量較對照組與抗生素組均無顯著差異(P>0.05)。

2.1.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞料重比的影響 對肉雞料重比的影響見圖2。肉雞飼養(yǎng)21 d時，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組料重比顯著低于對照組(P<0.05)。肉雞飼養(yǎng)28 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組料重比顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)。肉雞飼養(yǎng)35 d時，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組料重比顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組料重比極顯著低于對照組(P<0.01)。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞屠宰性能的影響

對肉雞屠宰性能的影響見表2。凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組，均呈現(xiàn)出不同程度提升肉雞屠宰性能的作用。肉雞飼養(yǎng)21 d時，抗生素組半凈膛極顯著高于對照組(P<0.01)；凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組半凈膛均非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組半凈膛極顯著高于抗生素組(P<0.01)。肉雞飼養(yǎng)28 d時，抗生素組、凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組半凈膛均非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組半凈膛極顯著高于抗生素組(P<0.01)。肉雞飼養(yǎng)35 d時，抗生素組、凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組半凈膛均非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組半凈膛顯著高于抗生素組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組半凈膛極顯著高于抗生素組(P<0.01)。

表2 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞屠宰性能的影響Tab.2 Effects of different concentrations of Bacillus coagulans BC-HYI on slaughter performance of broilers

肉雞飼養(yǎng)21 d天時，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組全凈膛極顯著高于對照組與抗生素組(P<0.01)。肉雞飼養(yǎng)28 d時，抗生素組與凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組全凈膛均極顯著高于對照組(P<0.01)；凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組全凈膛非常顯著高于對照組(P<0.001)。肉雞飼養(yǎng)35 d時，抗生素組全凈膛極顯著高于對照組(P<0.01)；凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組組均非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組和凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組全凈膛非常顯著高于抗生素組(P<0.001)。

肉雞飼養(yǎng)28 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組腿肌率顯著高于對照組(P<0.05)。肉雞飼養(yǎng)35 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組腿肌率極顯著高于對照組(P<0.01)；凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組腿肌率顯著高于抗生素組(P<0.05)。

肉雞飼養(yǎng)14 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組胸肌率非常顯著高于對照組(P<0.001)；凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組胸肌率極顯著高于對照組(P<0.01)。

2.3 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞腸道組織形態(tài)的影響

對肉雞腸道組織形態(tài)的影響見表3。肉雞飼養(yǎng)14 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組十二指腸的絨毛高度顯著高于抗生素組(P<0.05)；抗生素組空腸絨毛高度顯著低于對照組(P<0.05)，抗生素組空腸隱窩深度極顯著低于對照組(P<0.01)，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組空腸隱窩深度均顯著高于抗生素組(P<0.05)；凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組和抗生素組回腸絨毛高度顯著高于對照組(P<0.05)。

肉雞飼養(yǎng)28 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組十二指腸絨毛高度顯著高于抗生素組(P<0.05)；抗生素組回腸絨毛高度顯著低于對照組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組回腸絨毛高度顯著高于抗生素組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組回腸隱窩深度顯著低于抗生素組(P<0.05)；各組空腸絨毛高度和隱窩深度均未見顯著差異。

肉雞飼養(yǎng)14 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比值顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比值極顯著高于對照組和抗生素組(P<0.01)；凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組回腸絨毛高度/隱窩深度比值顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)。

肉雞飼養(yǎng)28 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比值極顯著高于對照組和抗生素組(P<0.01)，凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比值顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞盲腸內(nèi)乳酸菌及大腸桿菌的影響

凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞盲腸內(nèi)乳酸菌和大腸桿菌的影響見表4。

表4 凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI對肉雞盲腸內(nèi)乳酸菌及大腸桿菌的影響 lgCFU/mLTab.4 Effect of Bacillus coagulans BC-HYI on Lactobacillus and Escherichia coli of cecum

乳酸菌方面：肉雞飼養(yǎng)7 d，各組之間沒有顯著差異；肉雞飼養(yǎng)14 d，抗生素組顯著低于對照組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組均顯著高于抗生素組(P<0.05)；肉雞飼養(yǎng)21 d，抗生素組顯著低于對照組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組和凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組均顯著高于抗生素組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組極顯著高于抗生素組(P<0.01)；肉雞飼養(yǎng)28 d，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組極顯著高于對照組和抗生素組(P<0.01)。

大腸桿菌方面：肉雞飼養(yǎng)7 d，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組顯著低于對照組(P<0.05)，且極顯著低于抗生素組(P<0.01)；肉雞飼養(yǎng)14 d，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組顯著低于對照組(P<0.05)，且極顯著低于抗生素組(P<0.01)，凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組顯著低于抗生素組(P<0.05)；肉雞飼養(yǎng)21 d，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組極顯著低于對照組(P<0.01)，且顯著低于抗生素組(P<0.05)；肉雞飼養(yǎng)28 d，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組顯著低于對照組和抗生素組(P<0.05)。

3 討 論

畜禽的平均日采食量、平均日增體質(zhì)量和料重比是反映益生菌制劑在實際應用中有效性和經(jīng)濟性的重要指標。申維維等[7]研究表明凝結(jié)芽孢桿菌低劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組均有不同程度提高肉雞平均日增體質(zhì)量的作用，這種促進作用在肉雞飼養(yǎng)后期表現(xiàn)更為顯著，肉雞飼養(yǎng)28～35 d時，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組高于抗生素組，說明在平均日增體質(zhì)量方面，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組在肉雞飼養(yǎng)28～35 d時可以替代抗生素桿菌肽的促生長作用。從21 d起，凝結(jié)芽孢桿菌中劑量組、凝結(jié)芽孢桿菌高劑量組料重比與對照組比較顯著降低，凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI促生長作用顯著，且隨著飼養(yǎng)時間的延長效果優(yōu)于抗生素組。凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI抗逆性強，宜于在腸道生長繁殖，發(fā)揮益生作用。研究證明凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI具有較強的耐酸性和耐堿性[8]，其活性不會受胃酸和腸道的影響，能順利進入機體的胃腸道，在腸道生長繁殖的過程中釋放消化酶，促進機體對飼料的消化吸收，從而提高飼料利用率。KANWAR等[9]研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌在腸道內(nèi)定植后會在腸道中釋放消化酶和脂肪酶，這些脂肪酶有助機體消化一些不易被機體消化利用的物質(zhì)，提高機體的營養(yǎng)水平。OU等[10]等研究發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌可以促進機體較難消化的碳水化合物吸收，從而幫助機體攝取更多營養(yǎng)物質(zhì)。凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和肽類抑菌物質(zhì)。這些小分子有機酸有效促進腸道內(nèi)礦物質(zhì)的吸收[11]。本研究團隊前期通過RT-HPLC技術(shù)，通過分析凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)含有L-乳酸、乙酸、甲酸、丙酸等有機酸[12]。

腸道是動物機體營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，腸道的結(jié)構(gòu)及菌群種類與腸道功能有十分密切的關(guān)系[13]。凝結(jié)芽孢桿菌維護腸道屏障，提升機體免疫功能。常用絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度和隱窩深度的比值來判斷腸道的健康狀態(tài)。當絨毛高度增高時，說明絨毛中成熟的上皮細胞越豐富，反映出腸道的消化吸收功能越強[14]；隱窩深度主要影響腸上皮細胞的生成速度，處于隱窩基層的細胞具有分化能力，可以分化出許多新的細胞，這些新產(chǎn)生的細胞會逐漸遷移到絨毛頂端，最后變?yōu)槟c上皮細胞，幫助機體消化營養(yǎng)物質(zhì)[15-16]。當腸道隱窩深度變低時，隱窩底部分化出來的細胞到絨毛頂端的路程就會縮短，腸上皮細胞產(chǎn)生、更新的速率也會加快，進而增強腸道的吸收能力；當絨毛高度/隱窩深度比值降低時，說明小腸內(nèi)腸黏膜可能受到損傷，導致小腸的吸收能力下降，反之，當絨毛高度/隱窩深度比值升高時，說明小腸內(nèi)結(jié)構(gòu)良好，腸黏膜完整，吸收功能提升[17-18]。王政等[19]發(fā)現(xiàn)飲水中添加106CFU/mL的凝結(jié)芽孢桿菌，具有增加白羽雞盲腸中的乳酸菌數(shù)量，抑制大腸桿菌生長，有效改善腸道中微生物體系的作用，并顯著提高白羽雞空腸的絨毛高度/隱窩深度比值，改善白羽雞腸道的消化吸收功能，與本研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

2×108CFU/mL凝結(jié)芽孢桿菌BC-HYI可以改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)盲腸內(nèi)乳酸菌和大腸桿菌的生長；對肉雞具有顯著促生長作用。