石鳳陽，李煥榮

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動(dòng)物類國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 102206)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，被其感染豬以淋巴細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞浸潤為主要特點(diǎn)，機(jī)體免疫機(jī)能受到抑制[1]。其免疫抑制機(jī)理一直是PCV2研究的熱點(diǎn)。PCV2感染在一定程度上減少了豬外周血CD4+T細(xì)胞的數(shù)量[2]。表現(xiàn)PMWS的豬腸中存在大量PCV2抗原，腸道出現(xiàn)炎性侵染現(xiàn)象[3]，PCV2能夠在豬腸上皮細(xì)胞中增殖[4]。已有研究表明PCV2感染能夠改變豬腸上皮細(xì)胞中炎性相關(guān)分子的表達(dá)[5-6]，此變化對(duì)CD4+T細(xì)胞的分化產(chǎn)生何種影響值得探索。

本研究擬通過PCV2感染的豬腸上皮細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬PCV2感染的豬腸上皮局部環(huán)境，研究PCV2感染豬腸上皮細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞分化關(guān)鍵分子mRNA水平的影響，為進(jìn)一步研究PCV2感染豬腸上皮細(xì)胞調(diào)控CD4+T細(xì)胞分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒和細(xì)胞

PCV2-SD 2008株(GenBank登錄號(hào)：GQ174519)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并惠贈(zèng)，105.5TCID50/mL。無PCV1/PCV2污染的PK-15細(xì)胞系由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)。豬腸上皮細(xì)胞系購自廣州吉尼歐生命科技有限公司(源自DSMZ，貨號(hào)No701)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

3頭30日齡經(jīng)PCR或RT-PCR檢測(cè)的豬圓環(huán)病毒1型、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒[3,6]均陰性的長白豬，購自北京市SPF豬育種管理中心。試驗(yàn)豬單獨(dú)飼養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物房，自由采食與飲水，以備采血。該試驗(yàn)已通過北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物福利與倫理審查，編號(hào)為BUA2020092。

1.3 主要試劑與抗體

MS分選柱、MiniMACS Starting Kit、抗異硫氰酸熒光素磁珠抗體購自Miltenyi公司；異硫氰酸熒光素標(biāo)記鼠抗豬CD4單抗，購自Invitrogen公司；鼠抗豬CD3單抗、鼠抗豬CD28單抗，購自Abcam公司；0.4 μm孔徑的24孔細(xì)胞共培養(yǎng)板，購自Corning公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR Mixture購自江蘇康為世紀(jì)有限公司；病毒、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子的qPCR引物由生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 PCV2感染豬腸上皮細(xì)胞

將處于對(duì)數(shù)生長期的豬腸上皮細(xì)胞分別接種至24孔培養(yǎng)板(3×104/孔)，待豬腸上皮細(xì)胞長至70%時(shí)常按規(guī)方法接種PCV2(MOI=1)，37 ℃吸附1 h，棄毒，洗滌3次。每孔加入500 μL或700 μL含10%胎牛血清的改良伊格爾培養(yǎng)基，用于之后的豬腸上皮細(xì)胞病毒載量檢測(cè)或CD4+T細(xì)胞分化關(guān)鍵分子檢測(cè)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.5 CD4+T細(xì)胞的分離

用淋巴細(xì)胞分離液對(duì)乙二胺四乙酸抗凝血進(jìn)行密度梯度離心，400×g離心20 min。分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞后，依次用異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的CD4單抗、異硫氰酸熒光素磁珠抗體標(biāo)記，經(jīng)MS柱陽選被標(biāo)記的細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，純度大于95%，計(jì)數(shù)并調(diào)整至5×106/mL，以備后用。

1.6 豬腸上皮細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)

將純化的CD4+T細(xì)胞加入24孔板膜嵌套小室，將小室分別放入24孔板孔中。所有孔的小室均補(bǔ)培養(yǎng)液至300 μL，使CD4+T細(xì)胞為1.5×106/mL，并加入1 μg/mL的CD3/CD28單抗，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.7 關(guān)鍵分子檢測(cè)試驗(yàn)分組

試驗(yàn)分為共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組，每一組均包含PCV2感染與對(duì)照。

共培養(yǎng)組PCV2感染孔為預(yù)先接種PCV2的豬腸上皮細(xì)胞，48 h后放入含CD4+T細(xì)胞的24孔板膜嵌套小室；對(duì)照孔為未接PCV2的豬腸上皮細(xì)胞，48 h后放入含CD4+T細(xì)胞的24孔板膜嵌套小室。

單獨(dú)培養(yǎng)組PCV2感染孔預(yù)先不鋪豬腸上皮細(xì)胞(僅加入700 μL培養(yǎng)液)，48 h后放入含CD4+T細(xì)胞的24孔板膜嵌套小室，同時(shí)加入同共培養(yǎng)組PCV2感染孔上清中相同量的病毒；對(duì)照孔預(yù)先不鋪豬腸上皮細(xì)胞(僅加入700 μL培養(yǎng)液)，48 h后放入含CD4+T細(xì)胞的24孔板膜嵌套小室。

1.8 PCV2核酸載量與CD4+T細(xì)胞分化關(guān)鍵分子mRNA水平的檢測(cè)

收集PCV2感染不同時(shí)間點(diǎn)豬腸上皮細(xì)胞進(jìn)行PCV2核酸載量的檢測(cè)；收集培養(yǎng)72 h的各組CD4+T細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行各亞型關(guān)鍵細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子mRNA檢測(cè)。熒光定量PCR反應(yīng)按照說明進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL：2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，ddH2O 7 μL，上游引物、下游引物各0.5 μL，模板2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。最后一個(gè)循環(huán)為95 ℃ 1 min，64 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，全程讀板收集熒光信號(hào)。所用引物見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of fluorescent quantitative PCR

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 豬腸上皮細(xì)胞中PCV2核酸載量的變化

PCV2感染豬腸上皮細(xì)胞后0、6、12、24、48和72 h，PCV2核酸載量持續(xù)升高。對(duì)照孔豬腸上皮細(xì)胞中未檢測(cè)到PCV2核酸(結(jié)果未顯示)。說明PCV2可感染豬腸上皮細(xì)胞，并在豬腸上皮細(xì)胞中增殖(圖1)。

2.2 共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組CD4+T細(xì)胞關(guān)鍵細(xì)胞因子mRNA水平的變化

共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組CD4+T細(xì)胞關(guān)鍵細(xì)胞因子mRNA水平的變化見圖2。為了探究感染PCV2的豬腸上皮細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞關(guān)鍵細(xì)胞因子的影響，通過qPCR檢測(cè)共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組CD4+T細(xì)胞關(guān)鍵細(xì)胞因子的mRNA水平。選擇PCV2感染豬腸上皮細(xì)胞后48 h與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，并于共培養(yǎng)后72 h收集細(xì)胞。

與對(duì)照孔相比，共培養(yǎng)組PCV2感染孔CD4+T細(xì)胞中IFN-γ mRNA表達(dá)量下調(diào)但無顯著差異，IL-4、IL-17A、TGF-β1 mRNA水平顯著下調(diào)，IL-10 mRNA水平顯著上調(diào)，單獨(dú)培養(yǎng)組各細(xì)胞因子變化與共培養(yǎng)組相反。

共培養(yǎng)組所得結(jié)果與單獨(dú)培養(yǎng)組不同，提示PCV2感染豬腸上皮細(xì)胞后能對(duì)CD4+T細(xì)胞分化相關(guān)的多種細(xì)胞因子的mRNA水平產(chǎn)生影響。并非是感染豬腸上皮細(xì)胞后釋放到培養(yǎng)液中的PCV2對(duì)CD4+T細(xì)胞的作用所致。

2.3 共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組CD4+T細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的變化

CD4+T細(xì)胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子變化可解釋CD4+T細(xì)胞分化情況。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照孔相比，共培養(yǎng)組PCV2感染孔CD4+T細(xì)胞的T-bet、GATA3、RORγt、Foxp3 mRNA水平顯著下調(diào)。單獨(dú)培養(yǎng)組各轉(zhuǎn)錄因子變化與共培養(yǎng)組相反，提示共培養(yǎng)組所得結(jié)果與PCV2作用無關(guān)(圖3)。

3 討 論

通過建立豬腸上皮細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞的共培養(yǎng)體系研究PCV2感染的豬腸上皮細(xì)胞對(duì)CD4+T細(xì)胞的影響，并根據(jù)PCV2感染后豬腸上皮細(xì)胞各炎性相關(guān)分子的表達(dá)情況[6]，于PCV2感染后48 h共培養(yǎng)。設(shè)立的共培養(yǎng)組與單獨(dú)培養(yǎng)組的目的在于排除感染豬腸上皮細(xì)胞后釋放到培養(yǎng)液中PCV2對(duì)CD4+T細(xì)胞分化的調(diào)控作用，明確共培養(yǎng)組結(jié)果為PCV2感染豬腸上皮細(xì)胞后誘導(dǎo)分泌的細(xì)胞因子對(duì)CD4+T細(xì)胞分化的調(diào)控。PCV2感染的豬腸上皮細(xì)胞在mRNA水平上抑制CD4+T細(xì)胞分化關(guān)鍵分子的表達(dá)，但上調(diào)IL-10的mRNA水平，提示CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化被抑制，向分泌IL-10的CD4+T細(xì)胞的分化被促進(jìn)。

CD4+T細(xì)胞在機(jī)體免疫功能中發(fā)揮重要作用，各亞型又有不同的功能。Th1細(xì)胞主要對(duì)包括病毒與細(xì)菌等的胞內(nèi)病原產(chǎn)生應(yīng)答，也在許多自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[7-8]。Th1細(xì)胞分化需要IL-12和STAT1、STAT4以及T-bet存在，以高表達(dá)IFN-γ為主要特征[9]。Th1細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子T-bet的mRNA被顯著抑制，IFN-γ mRNA水平無顯著變化，推測(cè)可能是由于非炎癥條件下各組Th1細(xì)胞分化水平均很低，IFN-γ表達(dá)量較低，導(dǎo)致其mRNA水平檢測(cè)無顯著差異。Th1細(xì)胞分化是否被抑制還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

Th2細(xì)胞主要在寄生蟲等胞外感染中發(fā)揮作用，也參與哮喘和過敏反應(yīng)的發(fā)生，其分化需要IL-4和STAT6以及GATA3存在[10]，以表達(dá)IL-4、IL-5和IL-13等為主要特征[11]。

Th17細(xì)胞分化需要RORγt參與[12]，并以高表達(dá)IL-17A或IL-17F為主要特征[13]。

與Th17細(xì)胞分化相關(guān)的具有免疫調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，以高表達(dá)TGF-β為主要特征[14-15]。

Th2細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA3和IL-4的mRNA被顯著抑制，與Th17細(xì)胞相關(guān)分子RORγt和IL-17A，以及Foxp3和TGF-β的mRNA水平均顯著下調(diào)，提示PCV2感染的豬腸上皮細(xì)胞可能抑制CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化。此外，高表達(dá)IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞-I型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[16]表達(dá)TGF-β，不產(chǎn)生IL-4與IL-17[17]，而本研究中PCV2感染的豬腸上皮細(xì)胞上調(diào)CD4+T細(xì)胞IL-10 mRNA水平，是否可表明共培養(yǎng)后的CD4+T細(xì)胞向I型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，值得探索。