丁科，盧詩麗，劉潔蘭，莫麗梅，仇雯麗，唐任光，唐玉蓮

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院檢驗學(xué)院，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種起源鼻咽黏膜的上皮源性惡性腫瘤，主要致病因素包括環(huán)境、遺傳和EB病毒(epstein-barr virus)，惡性程度高，而且易較早出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重危及人類的生命和健康[1]。NPC的流行病學(xué)特點較為獨特，在全球的地域分布存在不均衡的現(xiàn)象，好發(fā)于我國南部地區(qū)以及東南亞，近幾十年來，NPC的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)下降的趨勢，但是據(jù)統(tǒng)計分析顯示我國NPC的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)仍處于較高水平[2-3]。目前NPC的確切發(fā)病機制尚不明確，針對NPC的遺傳基因多態(tài)性成為近年來的研究熱點和重點[4-6]。血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)參與調(diào)節(jié)多種生理和病理生理過程，并且與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)[7]。PDGFB基因是PDGF家族中的一員，現(xiàn)有報道，PDGFB基因與多種腫瘤相關(guān)[8-9]，但是，目前關(guān)于PDGFB基因在NPC中的表達(dá)及作用較少報道，故本文將探究PDGFB基因rs1800817和rs1800818的多態(tài)性與NPC患病易感性關(guān)系。

1 對象與方法

1.1研究對象 采用病例對照研究方法，收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院確診的NPC患者和健康體檢者全血標(biāo)本。NPC患者共120例，其中男85例，女35例，年齡(47.76±10.22)歲。健康體檢對照者共126例，其中男62例，女64例，年齡(42.94±12.89)歲。本研究方案通過右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，受試者均知情后簽署同意書。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 病例組患者經(jīng)過臨床病理組織活檢確診，尚未接受放、化療治療，并且排除合并其它原發(fā)和繼發(fā)腫瘤。對照組的研究對象為身心健康者，排除心血管及肝腎等疾病，臨床和實驗室檢查各項指標(biāo)均正常。本研究所有研究對象均為本地戶籍，且長期居住本地。

1.3方法

1.3.1基因組DNA分離 采集研究對象的清晨空腹肘部正中新鮮靜脈血3 ml，使用基因組DNA快速抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]對血液樣品進(jìn)行DNA抽提，嚴(yán)格按照說明書方法，使用Qubit 2.0對獲得的DNA進(jìn)行濃度和純度測定，并低溫保存。

1.3.2多重PCR擴增及高通量測序 設(shè)計并合成一個包含45個SNPs位點的引物池，分兩步PCR完成目標(biāo)SNP位點序列的擴增和兼容Illumina測序文庫的制備。第一輪PCR反應(yīng)體系：總體積25 μl，其中DNA 2 μl，上下游引物各1 μl，2×PCR Ready Mix 15 μl，無核酸酶水補足25 μl，使用1%的瓊脂糖膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，確定產(chǎn)物大小正確，并用AMPure XP磁珠純化回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)入第二輪PCR反應(yīng)：總體積30 μl，其中DNA 2 μl，P7引物1 μl，P5引物1 μl；2× PCR Ready Mix 15 μl，無核酸酶水補足30 μl。最終PCR產(chǎn)物使用AMPure XP磁珠純化回收，各個PCR產(chǎn)物等量混合后，使用HiSeq XTen測序儀(Illumina，San Diego，CA)進(jìn)行測序。

1.3.3基因分型分析 使用cutadapt (v 1.2.1) 軟件切除任何含有測序接頭序列的部分序列，剩余序列使用PRINSEQ-lite(v 0.20.3)軟件進(jìn)行質(zhì)控，依照序列的3′端往5′端的順序，刪除質(zhì)量閾值低于20的堿基，余下序列視作質(zhì)控合格的序列，并使用BWA(v 0.7.13-r1126)軟件將其比對到參考基因組上，參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)，最后根據(jù)比對結(jié)果，通過samtools軟件(版本0.1.18)計算目標(biāo)位點的基因型結(jié)果，并使用Annovar(2018-04-16)軟件用于對突變位點進(jìn)行基因注釋。

1.3.4不同種族人群基因多態(tài)性的分布比較 通過ensembl在線數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)，獲得北京漢族人群(CHB)、歐洲人群(EUR)、日本人群(JPT)、非洲人群(AFR)、美國人群(AMR)和南亞人群(SAS)的基因型和等位基因分布頻率，并與126名健康人群比較。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 運用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0分析實驗數(shù)據(jù)，Logistic回歸用于分析基因型和等位基因型分布頻率與NPC易感性的關(guān)系?；蛐皖l率是否符合哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)遺傳平衡定律采取擬合c2檢驗判斷人群代表性。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1基因型遺傳平衡評估PDGFB基因 rs1800817位點的基因型有TT、GT和GG型，rs1800818位點基因型有TT、CT和CC型。經(jīng)檢驗，PDGFB基因rs1800817和rs1800818位點基因型符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，群體具有代表性，見表1。

表1 rs1800817和rs1800818基因型分布hardy-weinberg平衡檢驗

2.2基因型與NPC易感性的相關(guān)性PDGFB基因rs1800817和 rs1800818位點基因型和等位基因在兩組中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 鼻咽癌 SNP基因型和等位基因在NPC組與對照組的比較

2.3rs1800817和 rs1800818位點多態(tài)性與性別的相關(guān)性 男性rs1800817位點TT基因型和rs1800818位點TT基因型在兩組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而不同性別rs1800817位點和rs1800818位點其他基因型在兩組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 rs1800817和rs1800818與性別對鼻咽癌發(fā)病的影響

2.4rs1800817和rs1800818位點單倍型分析PDGFB基因rs1800817和rs1800818位點存在GC、GT、TC及TT 4種單倍型，各單倍型在NPC組和對照組中的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 rs1800817和rs1800818單倍型在NPC組和對照組中的比較

2.5rs1800817和rs1800818多態(tài)性與NPC臨床病理的相關(guān)性PDGFB基因rs1800817和 rs1800818位點基因型和等位基因分布頻率與NPC的組織類型、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表5、表6。

表5 rs18008187多態(tài)性與NPC患者的臨床病理特征關(guān)系

表6 rs1800818多態(tài)性與NPC患者的臨床病理特征關(guān)系

2.6廣西人群rs1800817和 rs1800818位點與不同地區(qū)人群比較 廣西人群PDGFB基因rs1800817和 rs1800818位點基因型和等位基因頻率與歐洲人群(EUR)、日本人群(JPT)、非洲人群(AFR)、美國人群(AMR)及南亞人群(SAS)之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與北京漢族人群(CHB)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表7。

表7 rs1800817和 rs1800818在不同地區(qū)人群的分布頻率

3 討論

PDGFB是PDGF家族四種成員之一，以二聚體形式存在[10]。目前研究認(rèn)為，PDGF家族成員的過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的黏附遷移、血管發(fā)生、血管形成以及轉(zhuǎn)移浸潤之間關(guān)系密切[11]。PDGFB可作用于血管周圍細(xì)胞，包括血管周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，并誘導(dǎo)其遷移至新生的血管網(wǎng)中，促進(jìn)血管的成熟和重塑[12]。PDGFB還可以引起腫瘤細(xì)胞形態(tài)和免疫表型的改變，在神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞的遷移增殖、分化和生長中起重要作用[13]。研究表明，圍手術(shù)期血清PDGFB指標(biāo)低的肝癌患者，術(shù)后早期肝癌復(fù)發(fā)率較高[8]。此外，PDGFB在卵巢腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，并且與卵巢腫瘤的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[9]。另有研究表明，作為PDGF家族成員之一，PDGFA可能通過多種途徑參與NPC的發(fā)生、發(fā)展和遷移[14]，而PDGFB的高表達(dá)與口腔、食管鱗癌的預(yù)后不良有關(guān)[15-16]。

我國NPC的患病人群分布呈現(xiàn)明顯的地域性，而且廣西地區(qū)男性患病率高于女性[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDGFB基因rs1800817和rs1800818位點基因型和等位基因可能與桂西地區(qū)人群NPC的致病并無關(guān)聯(lián)。我們進(jìn)一步探討不同性別PDGFB基因rs1800817和rs1800818位點多態(tài)性的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDGFB基因rs1800817和rs1800818位點TT基因型與桂西地區(qū)男性NPC致病相關(guān)，可增加對NPC的易感性。對于這一結(jié)果原因的分析，可能與男性患者吸煙史、工作生活環(huán)境壓力有關(guān)；另外，有研究表明桂西地區(qū)不同性別鼻咽癌患者EB病毒抗體水平之間存在差異[18]，是否不同性別間感染EB病毒會增加男性致病性，仍需要進(jìn)一步研究。

此外，我們研究發(fā)現(xiàn)，廣西人群PDGFB基因rs1800817和rs1800818位點多態(tài)性與日本、非洲、歐洲、美國及南亞人群差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而與我國北京地區(qū)漢族人群差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這一結(jié)果表明，這兩個位點在不同種族及地域間存在較強的差異。由于不同地域人群、生活習(xí)慣等差異，基因多態(tài)性也存在差異性，這種差異性往往與疾病的易感性相關(guān)，而且會導(dǎo)致疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后不同。例如，Ben-Ari Z等[19]發(fā)現(xiàn)PDGFB基因rs1800817位點多態(tài)性與肝移植后嚴(yán)重的HCV復(fù)發(fā)感染有關(guān)，并且在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Stremitzer S等[20]發(fā)現(xiàn)PDGFB基因rs1800818位點多態(tài)性與結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移患者術(shù)后接受貝伐單抗化療3年總存活率有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PDGFB基因rs1800818和rs1800817位點多態(tài)性存在著地域和種群的差異，并且其TT基因型與桂西地區(qū)男性NCP發(fā)病存在一定的相關(guān)性。然而，本研究尚存在一些不足，如尚未研究基因與環(huán)境的影響以及周圍組織浸潤的關(guān)系；其次，本研究的樣本量較小。因此，進(jìn)一步擴大樣本量深入探討PDGFB基因多態(tài)性與NPC易感性的關(guān)系，將有益于了解NCP的發(fā)病機制。