孫承文，賴迎迢,2，鞏華,2，任燕,2，江小燕，陳總會(huì)，黃志斌,2，陶家發(fā),2*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 珠江水產(chǎn)研究所，廣東 廣州 510380；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380)

細(xì)菌性敗血癥是淡水魚類養(yǎng)殖過程最常見的細(xì)菌性疾病之一，該病主要病原菌為氣單胞菌屬Aeromonas[1]，其中，維氏氣單胞菌Aeromonasveronii是近年來(lái)感染魚類的主要病原菌之一。每年的夏秋等高溫季節(jié)是該病暴發(fā)的高峰時(shí)期，一些重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類品種如草魚Ctenopharyngodonidellus、鯽Carassiusaumtus、鳙Aristichthysnobilis、羅非魚Oreochromismossambicus、鲇Silurussoldatovi等均有暴發(fā)此類疾病的報(bào)道[2-6]，該病常常造成養(yǎng)殖魚類大規(guī)模發(fā)病死亡，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，諸多學(xué)者對(duì)多種魚類進(jìn)行了維氏氣單胞菌疫苗免疫研究，并已取得了較好的預(yù)防效果[7-10]，充分證明疫苗免疫對(duì)預(yù)防由維氏氣單胞菌感染引起的細(xì)菌性敗血癥具有良好效用。因此，推進(jìn)維氏氣單胞菌疫苗的商品化、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和水產(chǎn)品安全具有十分重要的意義。

微生物發(fā)酵過程中液體培養(yǎng)基的組成、用量配比及發(fā)酵過程中接種量、溫度、pH、轉(zhuǎn)速等參數(shù)控制對(duì)微生物繁殖及代謝產(chǎn)物的累積均有直接的影響[11-14]。因此，若要提高微生物發(fā)酵的產(chǎn)量，在篩選出適宜發(fā)酵的培養(yǎng)基組成的同時(shí)，也需要對(duì)發(fā)酵的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。本研究中，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)維氏氣單胞菌滅活疫苗的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，并比較了不同發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵菌液制備的滅活疫苗的安全性、免疫效力的影響，從而促使維氏氣單胞菌滅活疫苗菌液活菌數(shù)增加產(chǎn)量并節(jié)約成本，旨在為產(chǎn)業(yè)化維氏氣單胞菌滅活疫苗生產(chǎn)工藝提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

取健康異育銀鯽Carassiusauratus600尾(體質(zhì)量12～16 g)于水泥池中暫養(yǎng)，水溫27～29 ℃的水環(huán)境下飼養(yǎng)7 d以上，用于后續(xù)安全性試驗(yàn)、免疫試驗(yàn)。

維氏氣單胞菌LY02，由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所從患細(xì)菌性敗血病鰱Hypophthalmichthysmolitrix腎臟中分離、鑒定和保存。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB)：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L和氯化鈉5.0 g/L，固體培養(yǎng)基另加瓊脂18.0 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10.8 g/L、牛肉膏5.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L和氯化鈉5.0 g/L。

儀器：恒溫?fù)u床(ZWY-211B，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)、紫外分光光度計(jì)(UV1800PC，上海奧析科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 二級(jí)種子液制備 將維氏氣單胞菌CA07菌種用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基溶解后，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，28 ℃下培養(yǎng) 24 h，挑取典型菌落接種于含營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下震蕩培養(yǎng)18～20 h，作為一級(jí)種子液。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 配制發(fā)酵培養(yǎng)基分裝于三角瓶(300 mL/瓶)中，分別接種一級(jí)種子液，進(jìn)行單因素試驗(yàn)時(shí)，其他發(fā)酵條件(接種量10%、培養(yǎng)基初始濃度7.5、溫度31 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min)保持不變，分別考察接種量(1%、5%、10%、15%、20%，均為體積分?jǐn)?shù)，下同)、培養(yǎng)基初始pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、溫度(25、28、31、34、37 ℃)和轉(zhuǎn)速(160、180、200、220、240 r/min)等發(fā)酵參數(shù)對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)的影響，得出最佳參數(shù)對(duì)活菌數(shù)的影響。

綜上所述，DM/PM及早診斷是獲得良好預(yù)后的關(guān)鍵。對(duì)于ILD疑似炎性肌肉病者，應(yīng)密切隨訪、完善免疫學(xué)相關(guān)檢查、及早治療，以期延緩肺纖維化進(jìn)展，尤其應(yīng)避免感染的發(fā)生發(fā)展，進(jìn)而誘發(fā)ARDS等，改善患者生活質(zhì)量，提高生存率。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)，設(shè)計(jì)溫度、培養(yǎng)基初始pH、轉(zhuǎn)速3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)方案，采用 Design Expert 12.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.2.4 優(yōu)化后發(fā)酵工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 在響應(yīng)面法優(yōu)化的發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，通過比較預(yù)測(cè)值和試驗(yàn)值驗(yàn)證模型的有效性。用優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，采用三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)維氏氣單胞菌CA07，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定維氏氣單胞菌CA07菌的活菌數(shù)。

1.2.5 安全性及免疫效力比較試驗(yàn) 篩選響應(yīng)面試驗(yàn)中活菌數(shù)最低量組(L)、中位量組的發(fā)酵菌液(M)及優(yōu)化后的驗(yàn)證試驗(yàn)發(fā)酵菌液組(H)分別添加甲醛溶液(甲醛溶液終體積分?jǐn)?shù)為0.30%)，37 ℃下滅活24 h制備滅活疫苗。將制備的滅活疫苗分為原液組、稀釋組(原液組以滅菌生理鹽水稀釋)備用。

1)安全性試驗(yàn)。取健康鯽120 尾，隨機(jī)分為4 組，每組30 尾。3個(gè)免疫組(L、M、H組)腹腔分別注射滅活菌液0.20 mL/尾，1個(gè)對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.20 mL/尾，觀察14 d，每日記錄各組魚的死亡數(shù)。

2)免疫效力比較試驗(yàn)。取健康鯽210 尾，隨機(jī)分為7組，每組30 尾。6個(gè)免疫組(L、M、H原液組及L、M、H稀釋組)腹腔分別注射滅活菌液0.20 mL/尾，1個(gè)對(duì)照組腹腔注射生理鹽水0.20 mL/尾。免疫28 d后，免疫組和對(duì)照組各腹腔注射維氏氣單胞菌CA07株菌液進(jìn)行攻毒，攻毒后觀察7 d，每日記錄各組魚的死亡數(shù)，比較不同發(fā)酵條件下CA07株疫苗的免疫效果。

取健康鯽120 尾，隨機(jī)分為4 組，每組30 尾。2個(gè)免疫組腹腔分別注射CA07滅活菌液0.20 mL/尾(滅活前菌液活菌數(shù)約4.0×109CFU/mL)，2個(gè)對(duì)照組腹腔分別注射生理鹽水0.20 mL/尾。免疫28 d后，免疫組和對(duì)照組分別以CA07株菌液、LY02株菌液進(jìn)行攻毒，攻毒后觀察7 d，每日記錄各組魚的死亡數(shù)，比較維氏氣單胞菌不同菌株對(duì)CA07株疫苗的免疫交叉保護(hù)效果。疫苗相對(duì)免疫保護(hù)率(RPS,%)計(jì)算公式為

RPS=(1-免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率)× 100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用用SPSS 17軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Design Expert 12.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)的影響

從圖1可見：維氏氣單胞菌CA07在接種量為1%時(shí)，培養(yǎng)后活菌數(shù)最低，隨著接種量體積的增加，活菌數(shù)也隨之升高；當(dāng)接種量提升為5%時(shí)，培養(yǎng)后活菌數(shù)最高(5.50×109CFU/mL)，活菌數(shù)增加顯著(P<0.05)，之后隨著接種量的增加活菌數(shù)略有下降。考慮到規(guī)?；a(chǎn)過程中節(jié)約成本等要求，因此，選擇5%為最佳接種量。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，下同。

2.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)的影響

從圖2可見：發(fā)酵培養(yǎng)基中初始pH對(duì)維氏氣單胞菌CA07菌液的濃度影響較大，當(dāng)初始pH為6.5～8.5時(shí)，隨著pH增大，維氏氣單胞菌CA07菌液的活菌數(shù)呈先增加后減少的趨勢(shì)；當(dāng)初始pH為7.5時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最大(5.67×109CFU/mL)，活菌數(shù)增加顯著(P<0.05)。這表明，過酸或偏堿性條件下會(huì)抑制該菌的生長(zhǎng)。因此，選擇7.5為最佳培養(yǎng)基初始pH。

圖2 不同pH對(duì)維氏氣單胞菌CA07株生長(zhǎng)的影響

2.3 溫度對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)的影響

從圖3可見：25 ℃時(shí)菌體生長(zhǎng)較緩慢，發(fā)酵溫度上升為28 ℃時(shí)活菌數(shù)顯著提高(P<0.05)，活菌數(shù)達(dá)到最大(6.07×109CFU/mL)；當(dāng)溫度升高至31 ℃時(shí)，活菌數(shù)開始下降。因此，選擇28 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖3 不同溫度對(duì)維氏氣單胞菌CA07株生長(zhǎng)的影響

2.4 轉(zhuǎn)速對(duì)維氏氣單胞菌CA07生長(zhǎng)的影響

從圖4可見：當(dāng)轉(zhuǎn)速?gòu)?60 r/min升至220 r/min時(shí)，維氏氣單胞菌CA07發(fā)酵活菌數(shù)呈上升趨勢(shì)；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到220 r/min時(shí)，活菌數(shù)達(dá)最高(9.23×109CFU/mL)活菌數(shù)增加顯著(P<0.05)；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到240 r/min時(shí)，發(fā)酵菌液活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)。因此，選擇220 r/min為最佳發(fā)酵轉(zhuǎn)速。

圖4 不同轉(zhuǎn)速對(duì)維氏氣單胞菌CA07株生長(zhǎng)的影響

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.5.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取溫度(A)、pH(B)和轉(zhuǎn)速(C)3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)(表1)，以活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行試驗(yàn)，維氏氣單胞菌培養(yǎng)菌液Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2.5.2 模型建立與方差分析 利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到活菌數(shù)回歸方程為

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=10.72+0.32A+0.13B+0.68C-0.02AB-0.12AC-0.03BC-1.90A2-1.83B2-1.10C2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析顯示：模型P<0.001，表明此模型達(dá)到極顯著水平；回歸方程中溫度、轉(zhuǎn)速的一次項(xiàng)達(dá)到了顯著的水平(P<0.05)，說(shuō)明在試驗(yàn)范圍內(nèi)這兩個(gè)因素對(duì)活菌數(shù)的積累有顯著性影響；在交叉項(xiàng)中，溫度、pH、轉(zhuǎn)速三者的交互作用對(duì)活菌數(shù)無(wú)顯著性影響(P>0.05)；二次項(xiàng)中，溫度、pH、轉(zhuǎn)速三者對(duì)活菌數(shù)的積累均有極顯著性影響(P<0.001)(表3)。

表3 響應(yīng)面模型方差分析

2.5.3 響應(yīng)面圖分析 各因素交互作用對(duì)菌株發(fā)酵活菌數(shù)結(jié)果的影響見圖5。若響應(yīng)面曲面圖的傾斜坡度陡峭，表明發(fā)酵條件的變化對(duì)響應(yīng)值(活菌數(shù))的影響顯著；如果響應(yīng)面曲面圖的傾斜坡度相對(duì)平緩，則表明發(fā)酵條件的變化對(duì)響應(yīng)值(活菌數(shù))的影響不敏感。由圖5可知，隨著3個(gè)因素水平的逐漸增高，活菌數(shù)值呈先增后降的趨勢(shì)，交互作用的3個(gè)響應(yīng)面均出現(xiàn)極大值。

等高線的形狀可反映出交互作用的顯著性，等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，等高線呈圓形表示交互作用不顯著，因此，可以通過等高線圖直觀觀察到A與B、A與C和B與C間相互作用的重要性。圖5中，A(溫度)、B(pH)、C(轉(zhuǎn)速)均對(duì)響應(yīng)指標(biāo)(活菌數(shù))有顯著影響，其中AC(溫度與轉(zhuǎn)速)、BC(pH與轉(zhuǎn)速)的交互作用相對(duì)較強(qiáng)，對(duì)活菌數(shù)的影響相對(duì)較大，呈現(xiàn)較大角度的橢圓形，而AB(溫度與pH)次之，橢圓形的角度相對(duì)較小。以上結(jié)果與響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)活菌數(shù)影響的響應(yīng)面

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析預(yù)測(cè)的最佳培養(yǎng)條件為溫度28.22 ℃、pH 7.52、轉(zhuǎn)速226.14 r/min，在此條件下預(yù)測(cè)的活菌數(shù)最大值為10.84×109CFU/mL。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到的發(fā)酵條件，為方便操作，將上述發(fā)酵條件設(shè)定為溫度28 ℃、pH 7.5、轉(zhuǎn)速230 r/min，并進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到活菌數(shù)為11.13×109CFU/mL，較單因素試驗(yàn)最高活菌數(shù)值(9.23×109CFU/mL)提高20.59%，與預(yù)測(cè)值基本相符。

2.7 發(fā)酵菌液滅活疫苗安全性試驗(yàn)

選取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果中活菌數(shù)最低量2#組(L)、中位量8#組(M)及優(yōu)化組(H)菌液進(jìn)行疫苗安全性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組滅活疫苗注射魚及對(duì)照組試驗(yàn)魚均全部健活，免疫魚未出現(xiàn)臨床癥狀，攝食、游姿及體色均正常，注射部位無(wú)紅腫，內(nèi)臟器官無(wú)病變(表4)，表明不同發(fā)酵條件下，發(fā)酵菌液制備的滅活疫苗安全性良好。

表4 不同發(fā)酵條件下菌液制備的疫苗安全性比較

2.8 發(fā)酵菌液滅活疫苗免疫效力的比較

對(duì)原液組、稀釋組免疫后用CA07菌液進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，免疫結(jié)果顯示：原液試驗(yàn)組相對(duì)免疫保護(hù)率在90%以上，隨著疫苗活菌數(shù)增加，保護(hù)率可達(dá)到100%，表明優(yōu)化發(fā)酵條件可提高發(fā)酵菌液制備滅活疫苗的活菌數(shù)，從而顯著提高疫苗的相對(duì)保護(hù)率；稀釋試驗(yàn)組中優(yōu)化發(fā)酵菌液的滅活疫苗經(jīng)過3倍稀釋，相對(duì)免疫保護(hù)率仍然可以達(dá)到70%以上，不同發(fā)酵條件對(duì)疫苗的免疫效果未產(chǎn)生不利影響，這表明，通過優(yōu)化發(fā)酵條件可以獲得更高活菌數(shù)的菌液，在達(dá)到疫苗免疫效果要求的前提下，通過稀釋可以顯著節(jié)約成本，獲得更高產(chǎn)量(表5)。

表5 不同發(fā)酵條件下菌液制備的疫苗免疫效力比較

進(jìn)一步通過試驗(yàn)對(duì)比維氏氣單胞菌疫苗菌株CA07株與LY02株的交叉免疫效果，結(jié)果顯示，CA07株對(duì)LY02株的相對(duì)保護(hù)率在42.31%，表明疫苗菌株CA07株與LY02株間存在一定的交叉保護(hù)作用(表6)。

表6 CA07株菌液制備的疫苗與LY02株交叉免疫效力比較

3 討論

3.1 單因素試驗(yàn)

本研究中通過考察不同轉(zhuǎn)速、溫度、培養(yǎng)基初始pH和接種量對(duì)維氏氣單胞菌CA07株發(fā)酵菌液活菌數(shù)的影響，結(jié)果表明，溫度、轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH較接種量對(duì)發(fā)酵菌液活菌數(shù)的影響更明顯，這3個(gè)因素可以作為響應(yīng)面考察因子進(jìn)一步研究。相關(guān)研究中，張曉青等[15]通過單因素試驗(yàn)考察不同的轉(zhuǎn)速、溫度、初始pH和接種量對(duì)紅球菌SY095發(fā)酵液表面張力的影響，通過單因素試驗(yàn)結(jié)果比較，選取轉(zhuǎn)速、溫度、初始pH作為響應(yīng)面試驗(yàn)考察因子。韓旭東等[16]考察不同的發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基pH、接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)芽孢桿菌ZYCHH-01發(fā)酵生產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響，通過對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果比較，選取了以發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基pH、發(fā)酵時(shí)間作為響應(yīng)面試驗(yàn)考察因子。

3.2 響應(yīng)面分析

目前，單因素法、正交試驗(yàn)法、響應(yīng)面優(yōu)化法已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐及對(duì)微生物發(fā)酵條件優(yōu)化的科學(xué)研究中。其中，單因素法、正交試驗(yàn)法存在一些缺陷，如忽略了因素間的交互作用，無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域的最優(yōu)值等；而響應(yīng)面優(yōu)化法得到的數(shù)據(jù)更精確、更全面，對(duì)試驗(yàn)有顯著影響的因素都可以用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行優(yōu)化，在微生物發(fā)酵條件的優(yōu)化中越來(lái)越多的應(yīng)用[17]。有研究表明，通過響應(yīng)面法優(yōu)化后驗(yàn)證實(shí)測(cè)的結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值接近，李書穎等[18]使用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化條件下測(cè)定的OD600 nm平均值為1.747，與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差約為1%。張安寧等[19]在香菇液態(tài)發(fā)酵單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，按照最佳條件培養(yǎng)，菌絲生物量實(shí)測(cè)值為17.76 g/L，與理論值17.58 g/L相差1.02%。也有研究表明，響應(yīng)面法優(yōu)化后驗(yàn)證實(shí)測(cè)的結(jié)果較優(yōu)化前增加顯著，如王垚等[20]通過響應(yīng)面法優(yōu)化一株產(chǎn)纖維素酶嗜鹽真菌產(chǎn)酶條件，優(yōu)化后，纖維素酶活力由113.3 U/mL提高到302.8 U/mL，提高了167%；冒鑫哲等[21]通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化枯草芽孢桿菌工程菌產(chǎn)角蛋白酶發(fā)酵條件，優(yōu)化后，搖瓶發(fā)酵24 h 角蛋白酶活性達(dá)到260 480 U/mL，較優(yōu)化前提高了4.26 倍。韓學(xué)易等[22]利用響應(yīng)面分析法(RSM)對(duì)基因工程菌WH320-pHIS1525-G7產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化發(fā)酵條件下測(cè)得纖維素酶活力為2.152 U/mL，比優(yōu)化前搖瓶發(fā)酵酶活力提高了2倍。

本研究中，首先采用單因素試驗(yàn)方法確定出溫度、培養(yǎng)基初始pH與轉(zhuǎn)速為關(guān)鍵因素，然后通過響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)分析確定出關(guān)鍵因素的最佳值，得到的最佳發(fā)酵工藝條件為溫度28 ℃、pH 7.5、轉(zhuǎn)速230 r/min，在此優(yōu)化發(fā)酵條件下，試驗(yàn)得到的活菌數(shù)最大值為11.13×109CFU/mL，較單因素試驗(yàn)最高活菌數(shù)值提高20.59%，與預(yù)測(cè)值基本相符。響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)方法可以建立變量曲面模型和回歸方程，根據(jù)響應(yīng)面曲面圖的傾斜坡度、等高線的形狀，能夠快速、有效地從發(fā)酵條件中篩選出影響活菌數(shù)的關(guān)鍵因素，并實(shí)現(xiàn)其優(yōu)化得到最佳的發(fā)酵工藝條件，說(shuō)明回歸方程可較真實(shí)地反映各篩選因素的影響，同時(shí)證明用響應(yīng)面法來(lái)尋找維氏氣單胞菌的最佳發(fā)酵工藝條件是可行、有效的。

3.3 不同發(fā)酵條件對(duì)疫苗免疫效力的影響

本研究中，通過對(duì)比不同發(fā)酵條件下菌液制備維氏氣單胞菌CA07株滅活疫苗的安全性試驗(yàn)，結(jié)果表明，發(fā)酵條件對(duì)維氏氣單胞菌CA07株滅活疫苗的安全性無(wú)影響。在免疫效力方面，不同發(fā)酵條件下制備的疫苗，原液組隨著活菌數(shù)的提高，相對(duì)免疫保護(hù)率也顯著增加。稀釋組免疫鯽，優(yōu)化組即使稀釋3倍，相對(duì)免疫保護(hù)率也達(dá)到70%以上。優(yōu)化后發(fā)酵條件下可以獲得更高濃度的活菌數(shù)，且制備疫苗可以顯著節(jié)約成本，提高產(chǎn)量。維氏氣單胞菌CA07株滅活疫苗免疫鯽后，以鰱源維氏氣單胞菌LY02株攻毒，相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)42.31%，表明該菌株與LY02株具有較強(qiáng)的交叉免疫保護(hù)作用。

4 結(jié)論

1)通過單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化維氏氣單胞菌菌液發(fā)酵工藝，初步建立維氏氣單胞菌滅活疫苗菌液發(fā)酵參數(shù)，即溫度為28 ℃，pH為7.5，轉(zhuǎn)速為230 r/min，接種量為5%，在此工藝下發(fā)酵的菌液活菌數(shù)達(dá)11.13×109CFU/mL，較單因素試驗(yàn)最高活菌產(chǎn)量顯著提高20.59%。

2)通過優(yōu)化發(fā)酵工藝發(fā)酵菌液制備的滅活疫苗安全性良好，相對(duì)免疫保護(hù)率達(dá)到70%以上，與LY02株交叉免疫保護(hù)率達(dá)42.31%。