梁簫，丁文揚，張馳，蔡雨珊，楊金龍,3*

(1.上海海洋大學(xué) 國家海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室(廣州)，廣東 廣州 511458)

厚殼貽貝Mytiluscoruscus隸屬于貽貝科Mytilidae，是中國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類之一，廣泛分布于中國的渤海、黃海、東海等海區(qū)[1-3]。厚殼貽貝也是一種典型的大型污損生物，常出現(xiàn)在船舶的底部、橋墩及其他水下設(shè)施上，對其進行腐蝕, 從而造成巨大的經(jīng)濟損失[4]。厚殼貽貝在其生活史中會經(jīng)歷由浮游生活向底棲生活轉(zhuǎn)變的過程，這一過程被稱為附著變態(tài)[5]。附著變態(tài)的成功與否不僅關(guān)系到厚殼貽貝的生長發(fā)育，同時對于海洋大型污損生物的防治也具有重要意義。

在海洋環(huán)境中，細菌主要以生物被膜形式存在，且這種存在形式對厚殼貽貝等大型污損生物的附著變態(tài)有一定的影響[6]。研究發(fā)現(xiàn)，自然生物被膜的細菌密度與地中海貽貝、鹿角杯形珊瑚的附著變態(tài)率呈正相關(guān)[7-9]；單一海洋細菌形成的生物被膜的細菌密度和厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)間存在非常明顯的關(guān)聯(lián)性[10]。通過影響生物被膜的形成，如降低其細菌密度等生物學(xué)特性的方法可能對抑制厚殼貽貝等大型污損生物的附著變態(tài)具有一定的作用。影響生物被膜形成的因素較多，其中，脂肪酸作為一種天然分子具有抑制微生物被膜形成的巨大潛力[11]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞膜的脂肪酸組成會影響其生物的物理性質(zhì)(即流動性和柔韌性)，通過影響細胞黏附改變細胞膜流動性及調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)從而抑制生物被膜的發(fā)育[12-13]?？梢?，可以考慮使用脂肪酸抑制細菌生物被膜的形成，從而降低其細菌密度的方式來控制厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率，達到防治大型海洋生物污損的效果。

本研究中，選取海假交替單胞菌Pseudoalteromonasmarina[14]為研究對象，選取3種效果較為有效的脂肪酸,通過3種脂肪酸與海假交替單胞菌形成的生物被膜的特征變化，探究脂肪酸對海假交替單胞菌生物被膜的細菌密度、膜厚、胞外物質(zhì)等生物學(xué)特性的影響，從而解釋脂肪酸、細菌生物被膜及厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)三者間的關(guān)系，旨在為大型海洋污損生物的防治工作及厚殼貽貝的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用厚殼貽貝幼蟲取自浙江省舟山市嵊泗縣(N 30°69′、E 122°46′)，幼蟲在實驗室條件下暫養(yǎng)7 d后進行試驗。暫養(yǎng)條件為18 ℃充氣培養(yǎng)，每天換水投喂餌料。

試驗用細菌海假交替單胞菌[14]分離自自然微生物被膜(保藏號MCCC 1K03544)，保存于-80 ℃冰箱中。棕櫚酸(十六烷酸，Palmitic acid)、硬脂酸(十八烷酸，Stearic acid)、油酸(十八烯酸，Oleic acid)(Anpel,中國)使用二甲基亞砜(DMSO)(Sigma,美國)助溶于滅菌過濾海水。

1.2 方法

1.2.1 生物被膜的制備 參考Yang等[10]的方法，將海假交替單胞菌在2216E固體培養(yǎng)基上劃線，挑選單菌落使用2216E液體培養(yǎng)基在25 ℃下以200 r/min培養(yǎng)24 h。將擴配后的細菌收集在離心管中，以3 500 r/min離心15 min，棄上清，留沉淀。加入滅菌過濾海水吹打混勻，以3 500 r/min離心15 min，棄上清，留沉淀，重復(fù)上述步驟3次。最終將沉淀使用滅菌過濾海水定容至50 mL,充分混勻至細菌懸濁液。取100 μL細菌懸濁液加入9 900 μL滅菌過濾海水稀釋，充分混勻后取1 mL使用0.22 μm濾膜(Whatman)過濾，然后用體積分?jǐn)?shù)0.1%的吖啶橙染色5 min，待染色液風(fēng)干后使用熒光顯微鏡(Olympus BX51)在1 000倍下隨機選10 個顯微鏡視野進行細菌計數(shù)，最終通過計算確定細菌密度。根據(jù)所得細菌密度向裝有無菌載玻片(12.7 mm×38.1 mm)的無菌培養(yǎng)皿(64 mm×19 mm)中加入相應(yīng)量菌液，并使用滅菌過濾海水定容至20 mL，培養(yǎng)48 h。

1.2.2 海假交替單胞菌與脂肪酸共同形成生物被膜 將滅菌處理后的載玻片置入無菌培養(yǎng)皿中，根據(jù)細菌密度分別加入相應(yīng)細菌菌液和棕櫚酸、硬脂酸、油酸及混合脂肪酸(質(zhì)量比1∶1∶1)，使用滅菌過濾海水定容至20 mL，最終使得細菌菌液濃度為5×108cells/mL，脂肪酸質(zhì)量濃度為0、0.01、0.1、1、5 μg/mL，同時設(shè)置DMSO、腎上腺素(EPI)和空白組，每個組設(shè)9個平行，各組細菌于18 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)48 h，最終形成生物被膜。

1.2.3 生物被膜細菌密度計數(shù) 參考Yang等[10]方法，采用體積分?jǐn)?shù)為5%的福爾馬林將培養(yǎng)好的生物被膜進行固定，然后采用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吖啶橙溶液對生物被膜染色5 min，待染色液風(fēng)干后使用鏡油制片，然后通過熒光顯微鏡(Olympus BX51)在1 000倍視野下隨機選取10個細菌視野進行統(tǒng)計，每組設(shè)置3個平行。

1.2.4 幼蟲附著試驗 取出培養(yǎng)好的細菌生物被膜，使用滅菌過濾海水輕輕涮洗，洗去表面浮游細菌。然后將生物被膜載玻片放入盛有20 mL滅菌過濾海水的無菌培養(yǎng)皿中，使用解剖鏡向培養(yǎng)皿中分別加入20只厚殼貽貝的眼點幼蟲，于18 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，并分別統(tǒng)計12、24、48、96 h后的變態(tài)個體，并除以樣本基數(shù)，計算出變態(tài)率。

1.2.6 生物被膜激光共聚焦 染色后的生物被膜采用共聚焦顯微鏡(徠卡TCS SP8)與LAS X軟件進行共聚焦拍攝。共聚焦顯微鏡及軟件設(shè)置為物鏡63倍，z-step 0.2 μm，像素1 024×1 024。每片生物被膜隨機選取3個顯微鏡視野拍攝，每組設(shè)置3個平行進行拍攝分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用JMP 10.0.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和相關(guān)性檢驗。附著變態(tài)率與細菌密度、膜厚、胞外產(chǎn)物生物量的相關(guān)性檢驗采用多元分析方法，顯著性水平設(shè)為0.05。用Image J軟件處理共聚焦顯微鏡拍攝圖像，計算生物被膜胞外產(chǎn)物共聚焦體積。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響

從圖1可知，加入不同種類及質(zhì)量濃度的脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜會對厚殼貽貝幼蟲有不同的誘導(dǎo)活性。當(dāng)單獨加入一種脂肪酸時，與海假交替單胞菌單獨形成的生物被膜的幼蟲附著變態(tài)率相比棕櫚酸和硬脂酸分別只在質(zhì)量濃度為5 mg/L時，幼蟲附著變態(tài)率顯著上升(P<0.05)，而油酸在4個濃度下的幼蟲附著變態(tài)率均無顯著性差異(P>0.05)。相比而言，混合脂肪酸(質(zhì)量比1∶1∶1)則顯示出了不同的結(jié)果，隨著混合脂肪酸質(zhì)量濃度的增加，其共同形成的生物被膜對厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)率逐漸升高；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時，其所共同形成的生物被膜的附著變態(tài)率(32.8%)，相比海假交替單胞菌單獨形成的生物被膜的幼蟲附著變態(tài)率(30.5%)無顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時，其所共同形成的生物被膜的附著變態(tài)率(40.5%)達到最高，相比海假交替單胞菌單獨形成的生物被膜的幼蟲附著變態(tài)率顯著性升高(P<0.05)(圖1)。

2.2 混合脂肪酸對生物被膜細菌密度的影響

從圖2可見：所有組海假交替單胞菌初始細菌密度均為5×108cells/mL，不同質(zhì)量濃度的混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜細菌密度會產(chǎn)生不同結(jié)果；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時，共同形成的生物被膜細菌密度(1.79×107cells/cm2)與單一細菌(脂肪酸質(zhì)量濃度為0 mg/L)形成的生物被膜細菌密度(1.78×107cells/cm2)無顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，共同形成的生物被膜細菌密度(1.70×107cells/cm2)相比單一細菌顯著降低(P<0.05)；隨著混合脂肪酸質(zhì)量濃度的升高，生物被膜細菌密度隨之降低，混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時，共同形成的生物被膜細菌密度(1.40×107cells/cm2)達到最低(P<0.05)。

2.3 混合脂肪酸對生物被膜形態(tài)與厚度的影響

從圖3可見：所有組海假交替單胞菌初始細菌密度均為5×108cells/mL，不同質(zhì)量濃度的混合脂肪酸會影響其與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜細菌分布及生物被膜膜厚；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.01 mg/L時，共同形成的生物被膜膜厚(4.82 μm)與單一細菌(脂肪酸質(zhì)量濃度為0 mg/L)形成的生物被膜膜厚(4.89 μm)無顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，共同形成的生物被膜膜厚(4.51 μm)相比單一細菌形成的生物被膜膜厚顯著降低(P<0.05)；隨著混合脂肪酸質(zhì)量濃度的增加，共同形成的生物被膜的膜厚隨之降低，當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時，其與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜的膜厚(3.44 μm)達到最低，且具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 共聚焦顯微鏡下不同質(zhì)量濃度混合脂肪酸的生物被膜形態(tài)與膜厚

2.4 混合脂肪酸對生物被膜胞外多糖的影響

選取5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成生物被膜，觀察其對生物被膜胞外多糖的影響。從圖4可見，5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成生物被膜的α多糖、β多糖的生物量均與單一細菌形成的生物被膜無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 共同形成的生物被膜胞外α多糖和β多糖的共聚焦顯微鏡圖像和生物量

2.5 混合脂肪酸對生物被膜胞外蛋白質(zhì)的影響

選取5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成生物被膜，觀察其對生物被膜胞外蛋白質(zhì)的影響。從圖5(a)、(b)可知，5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜胞外蛋白質(zhì)與海假交替單胞菌單獨形成的生物被膜胞外蛋白質(zhì)相比無顯著性差異(P>0.05)。

2.6 混合脂肪酸對生物被膜胞外脂類的影響

選取5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成生物被膜，觀察其對生物被膜胞外多糖的影響。由圖5(c)、(d)可知，5 mg/L混合脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜胞外脂類(生物量體積為150 μm3)與海假交替單胞菌單獨形成的生物被膜胞外脂類相比(生物量體積為89.60 μm3)有顯著升高(P<0.05)。

圖5 共同形成的生物被膜胞外蛋白質(zhì)和脂類的共聚焦顯微鏡圖像和生物量

3 討論

脂肪酸是一種天然分子，廣泛分布于所有生命形式中[11]。脂肪酸能夠影響生物被膜的形成，如某些脂肪酸可以選擇性地抑制或破壞金黃色葡萄球菌[16-17]、銅綠假單胞菌[18-19]、白色念珠菌[20-21]、黏質(zhì)沙雷氏菌、伯克霍爾德菌及弧菌等[22-24]生物被膜的形成。同時生物被膜會誘導(dǎo)厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[3,10]。然而脂肪酸是否可以通過影響細菌生物被膜的形成抑制厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)尚未有試驗驗證。因此，本研究中使用不同質(zhì)量濃度的棕櫚酸、硬脂酸、油酸及3種脂肪酸的混合物與海假交替單胞菌共同培養(yǎng)生物被膜，并對所形成生物被膜的密度、膜厚、胞外產(chǎn)物，以及對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的誘導(dǎo)活性進行了研究。

3.1 3種脂肪酸對生物被膜形成的影響

本試驗中，不同質(zhì)量濃度脂肪酸對生物被膜形成有不同的影響，當(dāng)3種混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時，生物被膜的細菌密度和膜厚達到最低值。同時，通過共聚焦圖像可以看出，其相比海假交替單胞菌單獨形成的生物被膜細菌數(shù)量更少且更加分散。有研究表明，棕櫚酸質(zhì)量濃度為12.8 mg/L時，將會抑制Pseudomonasaeruginosa生物被膜的形成[18]；外源添加油酸抑制了金黃色葡萄球菌的黏附和生物被膜的形成[25-26]；此外，含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸的牛肉正己烷提取物及其合成混合物對大腸桿菌生物被膜的形成具有抑制作用[27]。這些結(jié)果均與本試驗研究結(jié)果一致，表明脂肪酸可以抑制細菌生物被膜的形成。

3.2 脂肪酸與海假交替單胞菌共同形成的生物被膜對厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的影響

被脂肪酸所影響的生物被膜是否也能導(dǎo)致厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)率的下降,本試驗中幼蟲試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過脂肪酸處理后密度和厚度下降的生物被膜反而促進了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)，這與最初試驗設(shè)計時所預(yù)想的結(jié)果完全相反。這表明，影響厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的因素除了生物被膜的細菌密度及膜厚之外，還存在其他影響因素。生物被膜作為細菌的一種主要存在形式，可以誘導(dǎo)厚殼貽貝等海洋無脊椎動物的附著變態(tài)[6-10]。生物被膜的組成成分較為復(fù)雜，主要包含細菌及胞外產(chǎn)物兩大部分。生物被膜的細菌密度、膜厚等生物學(xué)特征是影響海洋無脊椎動物附著變態(tài)的重要誘因[7-9]。此外，本試驗中還對混合脂肪酸處理后的海假交替單胞菌生物被膜的細菌密度與厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)率進行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物被膜的細菌密度與幼蟲附著變態(tài)率無顯著相關(guān)性(P<0.05)。

生物被膜的胞外產(chǎn)物主要包含多糖、蛋白質(zhì)、脂類等[28]。對Pseudoalteromonaslipolytica的研究發(fā)現(xiàn)，AT00_08765基因的敲除導(dǎo)致纖維素的過量產(chǎn)生，從而抑制厚殼貽貝幼蟲的附著[29]。海假交替單胞菌中01912基因的缺失導(dǎo)致可拉酸含量增加，從而促進了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[30]。海假交替單胞菌中鞭毛蛋白可以促進厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)[31]。對Pseudoalteromonasatlantica和Shewanellaloihica生物被膜與厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，其附著變態(tài)率的下降可能是由于生物被膜胞外多糖或胞外脂含量的減少所導(dǎo)致[32]。這些研究結(jié)果均表明，厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)除與生物被膜細菌密度有關(guān)外，還可能與生物被膜胞外產(chǎn)物有關(guān)。因此，本研究中通過共聚焦染色分析法，對3種脂肪酸混合物質(zhì)量濃度為5 mg/L時(厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)率最高)所形成的生物被膜的胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)、胞外脂類進行了分析。結(jié)果顯示，胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)含量無明顯變化，而生物被膜胞外脂含量顯著升高。通過以上結(jié)果推測，幼蟲附著變態(tài)率的上升可能與生物被膜胞外脂含量的升高有關(guān)。但生物被膜胞外脂含量的升高是由于脂肪酸刺激細菌分泌而生成新的脂類，還是試驗所添加的脂肪酸，還有待進一步研究。

綜上所述，海假交替單胞菌生物被膜的形成過程中添加3種脂肪酸混合物，促進了生物被膜胞外脂的產(chǎn)生從而促進了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，添加脂肪酸可以有效提高厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)率，且此結(jié)果對于了解脂肪酸、細菌生物被膜及厚殼貽貝幼蟲附著變態(tài)三者間的關(guān)系提供了新的思路，為脂肪酸未來在厚殼貽貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)參考。

4 結(jié)論

1)棕櫚酸、硬脂酸和油酸3種混合脂肪酸抑制了海假交替單胞菌生物被膜的形成，當(dāng)混合脂肪酸質(zhì)量濃度為5 mg/L時，海假交替單胞菌生物被膜的細菌密度和膜厚達到最低值。

2)3種脂肪酸混合物質(zhì)量濃度為5 mg/L時，導(dǎo)致了海假交替單胞菌生物被膜胞外脂含量顯著升高，從而促進了厚殼貽貝幼蟲的附著變態(tài)。