陳桂花，賀文斌，徐黎明，趙景壯，任廣明,4，邵軼智，段凱越，盧彤巖,4*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；3.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)動植物病原庫，上海 201306；4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223)

傳染性胰臟壞死病毒(infectious pancreas necrosis virus，IPNV)屬于雙RNA病毒科Birnaviridae水生雙RNA病毒屬Aquabirnavirus，是引起傳染性胰腺壞死病(infectious pancreatic necrosis，IPN)的病原體[1]，其主要危害鮭鱒幼魚，致死率高達70%以上[2]，同時也可使成年鮭鱒及許多其他魚類發(fā)生嚴重的急性感染，此外，在一些軟體動物和甲殼動物中也分離到了IPNV[3]。傳染性胰臟壞死病于20世紀50年代在美國首次暴發(fā)，目前，該病已在歐洲、亞洲和非洲廣泛流行[4]。1986年在中國山西省某虹鱒Oncorhynchusmykiss漁場首次暴發(fā)傳染性胰腺壞死病(IPN)[5]，隨后在甘肅[6]、山東[7]、遼寧[8]、云南[9]和四川[10]等省份接連暴發(fā)了該疫情，患病虹鱒死亡率高達90%，給鮭鱒養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

IPNV基因組由A、B兩個線性dsRNA分子組成，A鏈編碼非結(jié)構(gòu)蛋白VP5和pVP2-VP4-VP3多聚蛋白前體[11]，其中，VP4作為病毒蛋白酶將多聚蛋白切開釋放結(jié)構(gòu)蛋白VP2和VP3[12]；B鏈編碼聚合酶蛋白VP1[13]。許多學(xué)者已對VP2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行了研究，并首先確定了VP2蛋白是IPNV的主要保護性抗原[14-16]。Tarrab等[17]利用抗VP3單克隆抗體檢測到病毒粒子表面有部分VP3蛋白存在；Park等[18]研究發(fā)現(xiàn)，VP3蛋白也存在中和抗原表位；Moon等[19]用純化后的VP3和VP2蛋白分別免疫虹鱒，也證明VP3蛋白和VP2蛋白一樣，具有中和抗原表位，且具有較好的免疫原性。因此，VP3蛋白也是IPNV重要的保護性抗原。

盡管IPNV在中國流行多年，但是目前中國仍無有效防控傳染性胰臟壞死病的藥物，對待該病的防控方法主要以切斷病原傳播為主，故而對IPNV的全面監(jiān)測尤為重要。目前，全球IPNV可分為6個基因型(Genogroup Ⅰ～genogroup Ⅵ)，共包含9個血清型[20-21]，不同基因型IPNV毒株的基因序列差異較大，核酸檢測方法在IPNV檢測中具有一定的局限性，較難實現(xiàn)使用一對引物覆蓋所有基因型的IPNV毒株。因此，極有必要豐富IPNV的檢測方法，為IPNV的有效監(jiān)測提供保障。本研究中，選取IPNV毒株ChRtm213[9]，利用大腸桿菌對其VP3基因進行體外表達及純化，同時制備鼠抗血清，并成功將該血清應(yīng)用到中國不同地區(qū)Genogroup Ⅰ和Genogroup Ⅴ型IPNV分離株的免疫學(xué)鑒定，旨在為IPNV的監(jiān)測提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中所用IPNV和傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)均由黑龍江省水產(chǎn)動物疾病與免疫技術(shù)重點實驗室在中國養(yǎng)殖虹鱒流行病學(xué)調(diào)查過程中分離保存，其中，IPNV-QH、IPNV-LN和IPNV-GS的基因型為Genogroup Ⅴ，ChRtm213[9]、IPNV-JL和IPNV-HLJ的基因型為Genogroup Ⅰ。

病毒性出血性敗血癥病毒(VHSV)毒株購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。大鱗大麻哈魚胚胎細胞(chinook salmon embryo cells，CHSE-214)由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所魚類病害研究室曾令兵教授惠贈；大腸桿菌DH5α和Rosetta菌株及pET-32a表達載體均由本課題組保存。

pMD19-T simple載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver 2.0均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物純化及膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；HRP標記的羊抗鼠IgG和FITC標記的羊抗鼠IgG購自Abcam公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)IPNV ChRtm213毒株VP3基因序列(NCBI登錄號：KX234591)，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計擴增IPNVVP3基因的引物。上游引物VP3-F帶有BamH Ⅰ酶切位點：5′ GGATCCATGGACGCAGAACTGCAAGGGCTGC 3′；下游引物VP3-R帶有SalⅠ酶切位點：5′ GTCGACCACTTCTCCGTCATCGCCGGAG 3′。引物均由哈爾濱博仕生物公司合成。

1.2.2 IPNVVP3 基因的克隆及表達載體構(gòu)建 以實驗室保存的IPNV(ChRtm213)RNA為模板，以VP3-F和VP3-R為引物，利用一步法RT-PCR試劑盒克隆獲得VP3 ORF，膠回收純化后與pMD19-T simple連接，菌液經(jīng)PCR和測序鑒定后，將測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-VP3。將pMD19-T-VP3和表達載體pET-32a分別利用BamH Ⅰ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶消化并回收，將使用T4 DNA連接酶連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，涂布于含氨芐西林的瓊脂糖固體培養(yǎng)基，于37 ℃下過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，進行菌液PCR鑒定，將鑒定正確的菌液擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行BamH Ⅰ和SalⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET-32a-VP3。

1.2.3 IPNV VP3 蛋白的表達與純化 將重組pET-32a-VP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中，于37 ℃下以100 r/min振蕩培養(yǎng)。當菌液OD600 nm值達到0.3～0.4時，加入IPTG誘導(dǎo)劑(終濃度為0.25 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)后5 h內(nèi)每小時收集1 mL菌液，同時收集未誘導(dǎo)菌液作為陰性對照。經(jīng)超聲破碎后，將全菌、上清及沉淀樣本用質(zhì)量分數(shù)12%的SDS-PAGE凝膠進行電泳，以分析VP3蛋白的表達情況。

超聲破碎后的上清液使用鎳離子親和層析柱純化，依次使用含有10、20、30、40 mmol/L咪唑的洗滌液洗滌層析柱以去除雜蛋白，然后利用含有250 mmol/L咪唑的洗脫液收集目的蛋白，放入PBS溶液中(pH 8.0)透析24 h。透析結(jié)束后，于4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，收獲的上清液即為純化的VP3蛋白，用紫外分光光度計測定純化后蛋白的濃度。利用質(zhì)量分數(shù)12%的SDS-PAGE電泳分析VP3蛋白的純化情況。

1.2.4 IPNV VP3 蛋白抗血清的制備 將純化后的VP3蛋白無菌過濾，采用0.5 mg/kg的免疫劑量，根據(jù)文獻[14]中的方法對Balb/c小鼠進行皮下多點注射。將重組VP3蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化后免疫小鼠；免疫10 d后進行第2次免疫，將重組VP3蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合，完全乳化后免疫小鼠；第2次免疫10 d后進行第3次免疫，免疫方式與第2次相同；第3次免疫10 d后，通過眼球取血的方式收集免疫小鼠血液，進行血清分離，同時以PBS替代抗原免疫的小鼠血液制備的抗血清作為陰性對照。

1.2.5 IPNV VP3 蛋白抗血清效價檢測 用IPNV病毒懸液和重組VP3蛋白分別進行包被，根據(jù)文獻[14]中的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測抗血清蛋白效價。將“1.2.4節(jié)”中制備的鼠抗血清進行梯度稀釋(體積比分別為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000)，與包被的酶標板于37 ℃下孵育1 h。然后與HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶10 000，稀釋)于37 ℃下孵育1 h，用PBS洗去未被吸附的二抗，最后加入TMB底物液進行顯色，置于37 ℃暗箱中反應(yīng)5 min，每孔加入50 μL終止液。終止反應(yīng)后于490 nm下測定OD值。

陰性對照為免疫PBS與佐劑的鼠血清，空白對照為PBS。當OD490 nm所讀數(shù)值符合(陽性孔-空白孔)/(陰性孔-空白孔)>2.1時，判定樣本為陽性，陽性血清最大稀釋倍數(shù)即為抗血清效價[14]。

1.2.6 抗血清的應(yīng)用 將所制備的抗血清應(yīng)用到中國不同地區(qū)分離到的不同基因型的IPNV分離株的間接免疫熒光抗體法(IFAT)檢測中。在CHSE-214單層細胞爬片上接種本實驗室分離的6株IPNV毒株和IHNV、VHSV，在接毒后72 h取出接毒細胞爬片。將制備好的接毒細胞爬片用體積分數(shù)為4%的多聚甲醛固定，用PBS(pH 7.0)緩沖液洗滌3次，用體積分數(shù)為0.3%的BSA染色溶液于37 ℃下封閉1 h，再用PBS緩沖液洗滌，加入500倍稀釋的鼠抗VP3蛋白血清作為一抗，37 ℃下孵育1 h，再用PBS緩沖液洗滌，將FITC標記的羊抗鼠IgG抗體稀釋500倍后作為二抗，37 ℃下避光孵育1 h[22]。最后用PBS緩沖液洗滌后置于熒光顯微鏡下觀察。設(shè)置陰性血清孵育的細胞作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP3 基因的克隆及表達載體的構(gòu)建

以IPNV ChRtm213 RNA為模板，VP3-F和VP3-R為引物擴增VP3 ORF，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，獲得了符合目片段大小的PCR產(chǎn)物(711 bp)(圖1)。利用BamH Ⅰ和SalⅠ對重組質(zhì)粒pET-32a-VP3進行酶切鑒定，結(jié)果獲得與VP3基因和表達載體pET-32a大小相符的特異性條帶(圖2)，說明已成功構(gòu)建了用于VP3原核表達的重組質(zhì)粒。

M—DL2000 DNA分子量標準；1—陰性對照；2—VP3基因的PCR產(chǎn)物。

M1—DL2000 DNA分子量標準；M2—DL15000 DNA分子量標準；1—BamH Ⅰ單酶切; 2—Sal Ⅰ單酶切；3—BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切；4—pET-32a-VP3質(zhì)粒。

2.2 VP3 蛋白的誘導(dǎo)表達

將陽性pET-32a-VP3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta進行誘導(dǎo)表達，對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，VP3蛋白成功獲得表達，出現(xiàn)與目的條帶大小相符的特異性蛋白條帶(相對分子質(zhì)量約為45 000)，且隨著誘導(dǎo)時間的延長，表達量逐漸上升(圖3)，在誘導(dǎo)后3 h表達量顯著上升。此外，本研究中還發(fā)現(xiàn)，菌體破碎離心后的沉淀和上清液中均存在目的蛋白(圖4)，說明本研究中所表達的VP3蛋白以包涵體和可溶性蛋白兩種形式存在。

M—蛋白分子量標準；1—未誘導(dǎo)菌體；2～6—誘導(dǎo)1、2、3、4、5 h后菌體。

2.3 VP3 蛋白的純化

將超聲破碎后所得上清經(jīng)鎳離子親和層析柱純化和PBS(pH 8.0)透析24 h后，對樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結(jié)果顯示，純化的VP3蛋白與目的條帶大小相符且為單一條帶，可用于VP3蛋白鼠抗血清的制備(圖5)。

M—蛋白分子量標準；1—誘導(dǎo)前破碎菌體上清；2～8—誘導(dǎo)4 h破碎菌體上清；9—純化后的VP3蛋白。

2.4 IPNV VP3 蛋白鼠抗血清效價的檢測

利用本研究中所制備的抗血清對包被在酶標板上的IPNV和重組VP3蛋白進行酶聯(lián)免疫吸附法檢測。根據(jù)判定標準可知，該抗血清與IPNV的反應(yīng)效價為16 000，與重組VP3蛋白的反應(yīng)效價為32 000(圖6)。這表明，本研究中所制備的抗血清不僅能與重組VP3蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，還能與IPNV病毒粒子中的VP3蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。證明本研究中所制備的重組VP3蛋白具有較好的免疫原性，所制備的抗VP3蛋白的鼠血清可以應(yīng)用到IPNV的免疫學(xué)檢測。

*表示與陰性對照組有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 抗血清的應(yīng)用

將制備的鼠抗血清應(yīng)用到中國不同地區(qū)IPNV分離株的間接免疫熒光檢測中，結(jié)果顯示，抗血清與Genogroup Ⅰ型(IPNV-JL、IPNV-HLJ、ChRtm213)和Genogroup Ⅴ 型(IPNV-GS、IPNV-QH、IPNV-LN)的IPNV分離株均能發(fā)生特異性反應(yīng)，呈現(xiàn)出特異性綠色熒光，而不能與IHNV和VHSV發(fā)生反應(yīng)，無特異性熒光顯色，陰性鼠血清孵育的病毒均無任何熒光(圖7)。這表明，本研究中制備的鼠抗血清能夠特異性識別不同地區(qū)基因型為Genogroup Ⅰ和Genogroup Ⅴ的IPNV分離株，且與其他鮭鱒常見病毒IHNV和VHSV均無交叉反應(yīng)，可用于現(xiàn)行IPNV的監(jiān)測。

圖7 VP3蛋白鼠抗血清的間接免疫熒光抗體檢測結(jié)果

3 討論

傳染性胰臟壞死病是鮭鱒魚類最為嚴重的傳染性疾病之一。根據(jù)毒株、宿主和環(huán)境因素的不同，傳染性胰臟壞死病可造成患魚10%～90%的死亡率[2,23]，目前，中國尚無有效防控傳染性胰臟壞死病的藥物，該病的防控主要依賴切斷病原的傳播與擴散。由于IPNV血清型種類較多，且不同血清型毒株間免疫交叉反應(yīng)程度不同。因此，針對中國現(xiàn)行IPNV的免疫學(xué)檢測方法的建立對傳染性胰臟壞死病的監(jiān)測尤為重要。

3.1 中國現(xiàn)行IPNV的基因型

中國首次暴發(fā)傳染性胰臟壞死病是在20世紀80年代，至今已有30余年。由于缺乏有效的防控藥物與監(jiān)管措施，IPNV在中國養(yǎng)殖環(huán)境中快速傳播與擴散。流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來，在中國東北、西北、西南等虹鱒主養(yǎng)區(qū)均有IPNV檢出，給當?shù)睾琪V養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。從中國養(yǎng)殖環(huán)境中分離到的IPNV主要包含Genogroup Ⅰ型[9-10]和Genogroup Ⅴ型兩種基因型，這兩種基因型分別屬于不同的血清型。本實驗室近年在虹鱒流行病學(xué)調(diào)查過程中獲得大量的Genogroup Ⅰ型IPNV分離株，因此，本研究中采用了課題組于2013年從中國某虹鱒養(yǎng)殖場分離的Genogroup Ⅰ型毒株制備了抗血清。為了檢驗該抗血清是否能應(yīng)用到中國現(xiàn)存的兩種基因型IPNV的監(jiān)測，本研究中應(yīng)用間接免疫熒光抗體法對抗血清識別IPNV分離株的能力進行了檢驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所制備的抗血清不但能夠特異性識別Genogroup Ⅰ型IPNV毒株，而且能夠特異性識別Genogroup Ⅴ型IPNV，并且該血清不與鮭鱒常見病毒IHNV和VHSV存在交叉反應(yīng)。本研究中所制備的抗血清在IPNV的監(jiān)測中將會發(fā)揮重要作用。

3.2 VP3蛋白在IPNV免疫學(xué)檢測中的應(yīng)用

VP2和VP3蛋白均為IPNV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，而VP2蛋白更多地被用于IPN的檢測及免疫預(yù)防研究[24-28]。有研究表明，VP3和VP2蛋白同樣具有抗原表位和中和抗體表位[17-18]，且具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性[29]。因此，目前逐漸有學(xué)者開始利用VP3蛋白作為目標蛋白建立IPNV檢測方法，如Espinoza等[30]和Milne等[25]利用VP3單克隆抗體分別建立了IPNV免疫印跡法和RT-PCR-ELISA法，均能實現(xiàn)IPNV的高效檢測。此前，本課題組已制備了IPNV VP2蛋白的抗血清[14]，且在本研究中表達了IPNV VP3蛋白，制備了VP3抗血清，不但豐富了IPNV免疫學(xué)檢測手段，還可為VP3蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 本研究中所制備的抗血清的應(yīng)用價值

此前中國學(xué)者曾體外表達了Genogroup Ⅴ型IPNV的VP3蛋白[24]，制備了單克隆抗體[31]，成功將該抗體應(yīng)用到Genogroup Ⅴ型IPNV的免疫學(xué)檢測中，但并未驗證其是否可應(yīng)用于Genogroup Ⅰ型IPNV的檢測。通過文獻查閱可知，中國最初流行的IPNV為Genogroup Ⅴ型，Genogroup Ⅰ型的IPNV是近年分離鑒定的新毒株[9-10]。針對該現(xiàn)狀，本研究中選擇基因型為Genogroup Ⅰ的IPNV分離株，利用大腸桿菌Rosetta進行VP3蛋白的表達，經(jīng)過鎳離子親和層析柱純化，獲得大量可溶性VP3蛋白，并成功制備了能夠特異識別中國不同地區(qū)IPNV分離株的抗血清，該抗血清既可識別基因型為Genogroup Ⅰ的IPNV毒株，還可識別基因型為Genogroup Ⅴ的IPNV毒株，具有重要的現(xiàn)實意義。

4 結(jié)論

1)本研究中利用大腸桿菌Rosetta體外表達制備了Genogroup Ⅰ型IPNV ChRtm213毒株的重組VP3蛋白。

2)利用重組VP3蛋白制備了鼠抗血清，該血清不但能夠特異性識別Genogroup Ⅰ型IPNV毒株，還能識別Genogroup Ⅴ型IPNV毒株，可用于IPNV的監(jiān)測。