方穎，陳依彤，林詠珊，程京燕，高向陽

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 公共基礎(chǔ)課實驗教學(xué)中心 廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州510642；3.珠海微豆生物技術(shù)有限公司，廣東珠海519000）

0 引言

發(fā)酵后的豆酸乳能夠克服大豆固有的抗?fàn)I養(yǎng)性、豆腥苦澀味等不良性質(zhì)，還能合成（和富集）原來不具有的或低含量的功能性成分物質(zhì)，如γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，簡稱GABA）[1-3]，有效提高發(fā)酵豆制品的功能性品質(zhì)、改良感官評價以及特性等。目前對于富集GABA的發(fā)酵工藝研究涉及的原料包括豆類、谷類以及乳制品等，如小紅豆奶發(fā)酵[4]、大麥啤酒[5]、發(fā)酵乳制品[6-7]、功能面包制品[8]、茶[9]等，而以大豆為主要發(fā)酵原料富集GABA尚未見報道。本文以大豆粉為主要原料，采用混合乳酸菌發(fā)酵豆乳，以感官評定和GABA質(zhì)量濃度為指標(biāo)，探究了發(fā)酵工藝條件對豆酸乳GABA的影響，調(diào)控了產(chǎn)GABA的發(fā)酵條件，為研發(fā)富集GABA的豆酸乳提供理論基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 試劑

混合大豆粉由珠海微豆生物技術(shù)有限公司提供；混合乳酸混合菌（Lactobacillus plantarum；Lactobacillus helveticus；Bifidobacterium animalis；Bacillus subtilis），實驗室保藏菌；谷氨酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；γ-氨基丁酸，Sigma公司；H型氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液氨基酸分析，日本W(wǎng)ako公司；MCI Buffer L-8500-PH Kit氨基酸分析，日本W(wǎng)ako公司；日立分析儀專用茚三酮顯色溶液套裝 氨基酸分析，日本W(wǎng)ako公司；茚三酮、正丁醇、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉、磺基水楊酸、無水乙醇等試劑均為廣州化學(xué)試劑廠；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8900型氨基酸分析儀，日本日立公司；DRP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司；5910R高速冷凍離心機，德國艾本德；PHS-3E型p H計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

大豆粉溶解→均質(zhì)→殺菌→冷卻（35～40℃）→接種→保溫發(fā)酵→冷藏后熟（0～4℃，12 h）→成品→感官評定、GABA質(zhì)量濃度測定

1.3.1 發(fā)酵豆酸乳的制備

使用攪拌機將100 g大豆粉溶解于500 mL的50℃無菌水中，攪拌5 min使其均勻，濾網(wǎng)過濾并控制避免泡沫形成，將豆液分裝至發(fā)酵容器中各20 g，并調(diào)節(jié)p H。待豆液降低溫度冷卻至35～40℃時加入乳酸菌粉輕微攪拌均勻，封口，置于設(shè)定溫度和時間的恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)酵，發(fā)酵完成置冰箱冷藏后熟12 h，備用。

1.3.2 紙層析法分析GABA

參照張敏等[10]的方法并略有改動。

前處理：取發(fā)酵樣品沸水浴5 min，轉(zhuǎn)速為12000 r/min離心5 min后取上清液待測。

層析過程：稱取并在層析缸中添加展開劑（正丁醇∶冰醋酸∶水=2∶1∶1）與顯色劑（8 g/L茚三酮），預(yù)飽和2 h。將新華三號濾紙裁剪成所需大小，濾紙下端2 cm處輕畫一條直線。在直線上每隔2 cm進行點樣，樣品分別為2 g/L的GABA標(biāo)樣、2 g/L谷氨酸鈉標(biāo)樣和樣品發(fā)酵液。層析后取出濾紙于90℃烘箱中顯色10 min。通過測量計算比移值Rf對GABA和谷氨酸進行初步定性。

1.3.3 氨基酸分析儀測定GABA質(zhì)量濃度

參考方法《JY/T 0194-1996氨基酸分析方法通則》[11]。豆酸乳GABA質(zhì)量濃度測定前進行樣品處理：取發(fā)酵樣品離心，取上清液沸水浴5 min，冷卻后加入2倍體積5%磺基水楊酸，放4℃冰箱靜置過夜；次日以轉(zhuǎn)速為12000 r/min離心取上清，加入4倍無水乙醇振蕩后，放4℃冰箱靜置過夜；隨后轉(zhuǎn)速為12000 r/min離心取上清，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除乙醇，用0.02 mol/L HCl定容后，過0.45μm濾膜，得供試樣品備用。

氨基酸分析儀檢測環(huán)境及檢測條件：溫度22℃；相對濕度60%；色譜柱：日立855-4507型；柱溫：程序變溫；反應(yīng)柱溫：135℃；檸檬酸（鋰）p H緩沖液梯度洗脫；檢測波長：570 nm+440 nm；流速：洗脫泵0.35 mL/min，衍生泵0.30 mL/min；分析時間：148 min。

標(biāo)準(zhǔn)氨基酸濃度C0100μmol/L，進樣量20μL。定量公式如式（1）和式（2）所示，即：

式中：X為樣品中氨基酸質(zhì)量分數(shù)；C為樣品測定液中氨基酸質(zhì)量濃度，ng/20μL；F為樣品稀釋倍數(shù)；V為定容體積，mL；M為樣品稱樣量。

外標(biāo)單點校正法公式為

式中：C為氨基酸質(zhì)量分數(shù)；A為峰面積。

1.3.4 發(fā)酵豆酸乳感官質(zhì)量評價

評分依據(jù)的制定參考《GB/T 30885-2014植物蛋白飲料 豆奶和豆奶飲料》[12]。組織具有食品專業(yè)背景與食品感官評估經(jīng)驗的10人感官評定專家小組對發(fā)酵豆酸奶做感官質(zhì)量評價，取其總分的平均值作為最終結(jié)果的評估。滿分100分，具體評分依據(jù)見表1。

表1 感官評價標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 紙層析法定性GABA

紙層析法對發(fā)酵酸豆奶中谷氨酸和GABA分析結(jié)果如圖1和表2所示。采用展開劑為v正丁醇∶v冰醋酸∶v水=2∶1∶1，顯色劑為茚三酮，快速鑒定發(fā)酵豆酸乳中含有GABA，結(jié)果如圖1所示，發(fā)酵液樣品在對應(yīng)GABA位置形成斑點，標(biāo)準(zhǔn)樣品的顯色效果較好，斑點均清晰、無重疊、無拖尾，說明分離GABA和谷氨酸鈉的效果好；樣品從左至右分辨為GABA標(biāo)樣，谷氨酸鈉標(biāo)樣，樣品1的GABA，樣品1的谷氨酸鈉，其顯色的斑點的Rf值分別為0.769，0.615，0.782，0.603。

表2 發(fā)酵豆酸乳紙層析法分離GABA的比移值

圖1 發(fā)酵豆酸乳紙層析法分析GABA

2.2 氨基酸分析儀分析氨基酸結(jié)果

采用了外標(biāo)單點校正的方法對發(fā)酵豆酸乳進行氨基酸測定，結(jié)果表明檢出的氨基酸有賴氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、甲硫氨酸、蘇氨酸（Thr）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）、組氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、GABA、精氨酸（Arg）和脯氨酸（Pro）等，特別是嬰幼兒所需要的必須氨基酸如精氨酸（Arg）、胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、?；撬幔═au），未檢出苯丙氨酸（Phe）（標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖2）。檢測樣品中各氨基酸均能達到基線分離，峰形穩(wěn)定，GABA的出峰時間為65.340 min，采用外標(biāo)單點校正法計算出GABA的質(zhì)量濃度。

圖2 氨基酸標(biāo)品測定曲線

2.3 影響豆酸乳發(fā)酵的條件

2.3.1 混合菌接種量的影響

設(shè)置混合菌接種量為0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%；其余發(fā)酵條件為初始發(fā)酵p H值為7，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時間10 h；考察了混合菌接種量對感官品質(zhì)和GABA質(zhì)量濃度的影響，結(jié)果如圖3所示?；旌暇臃N量的增加會導(dǎo)致發(fā)酵過度、代謝副產(chǎn)物增多、產(chǎn)酸過多，在超過0.6%后，豆酸乳的組織狀態(tài)粗糙、不均勻、分層，乳清析出逐漸嚴(yán)重，口感過酸，感官品質(zhì)降低，因此，混合菌接種量為0.6%時感官品質(zhì)最理想。

圖3 混合菌接種量對感官品質(zhì)和GABA質(zhì)量濃度的影響

隨著混合菌接種量逐漸增加，GABA質(zhì)量濃度相應(yīng)增加，當(dāng)混合菌接種量大于0.6%后，繼續(xù)增加混合菌接種量對GABA質(zhì)量濃度的增加影響不大。綜合考慮，確定最佳的混合菌接種量為0.6%。

2.3.2 初始發(fā)酵p H值的影響

初始發(fā)酵p H值的控制對豆酸乳GABA的含量至關(guān)重要，GABA的生物合成途徑主要由p H值調(diào)節(jié)，對發(fā)酵過程具有顯著作用，同時，不同的微生物發(fā)酵菌種的GAD生化特性不一樣最適的p H值也不一樣，高產(chǎn)GABA的最適p H值是取決于菌種種類的[13]。發(fā)酵的初始p H值對最終的GABA產(chǎn)量有決定性影響，因此發(fā)酵液的p H值最好及時保持最佳p H值[14]。

設(shè)置初始發(fā)酵p H值為4，5，6，7，8；其余條件控制為混合菌接種量0.5%、發(fā)酵溫度40℃、發(fā)酵時間10 h。制得發(fā)酵豆酸乳并進行感官品質(zhì)和GABA質(zhì)量濃度的測定，根據(jù)感官品質(zhì)評分和GABA定量比較結(jié)果確定最佳初始p H值。由圖4可知，p H值為6的感官品質(zhì)與p H值為7的相差不大，都呈淡黃色、顏色分布均勻，有濃郁的豆香味，口感細膩，氣味協(xié)調(diào)，組織狀態(tài)細膩均勻不分層，乳清析出正常；p H值為4和p H值為5的感官品質(zhì)極低，與其他組相差甚大，其發(fā)酵效果非常不理想，基本上相當(dāng)于沒發(fā)酵，還是豆液的狀態(tài)，并且有異味；p H值為8的感官品質(zhì)較低，主要是乳清析出比較多。同時，p H值為5時GABA質(zhì)量濃度最高，其次p H值為6，7，8；其GABA質(zhì)量濃度也較高，經(jīng)比較三者差別很小；而p H值為4時GABA質(zhì)量濃度最低。綜合考慮，確定采用初始p H值為7為最佳發(fā)酵初始p H值。

圖4 初始pH值對感官品質(zhì)和GABA質(zhì)量濃度的影響

2.3.3 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度也是影響GABA最大發(fā)酵產(chǎn)量的重要因素，發(fā)酵溫度除了影響生物催化劑活性和穩(wěn)定性，對反應(yīng)熱力學(xué)平衡也有影響。保證一定的細胞密度和適宜的培養(yǎng)溫度可促使谷氨酸高效轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸[15]。需要綜合考慮去控制合適的發(fā)酵溫度，使之同時得到感官品質(zhì)高和GABA質(zhì)量濃度高的豆酸乳。

分別設(shè)置發(fā)酵溫度為30，35，40，45，50℃。其余條件控制為混合菌接種量0.5%，初始p H值為7，發(fā)酵時間10 h。制得發(fā)酵豆酸乳并進行感官品質(zhì)和GABA測定，根據(jù)感官品質(zhì)和GABA定量比較結(jié)果確定最佳發(fā)酵溫度。由圖5可以看出，感官品質(zhì)先升高后降低，發(fā)酵溫度為40℃時，得到均勻淡黃色，發(fā)酵豆香味和滋味、組織細膩均勻，微量乳清析出的豆酸乳。隨著發(fā)酵溫度的升高，GABA質(zhì)量濃度先升高后降低，發(fā)酵溫度為40℃時GABA質(zhì)量濃度最高，且與其他組差別明顯，當(dāng)溫度超過40℃之后，GABA質(zhì)量濃度降低趨勢較快，這可能是溫度升高使谷氨酸脫羧酶逐漸失活。綜合考慮，確定最佳的發(fā)酵溫度為40℃。

圖5 發(fā)酵溫度對感官品質(zhì)和GABA質(zhì)量濃度的影響

2.3.4 發(fā)酵時間的影響

發(fā)酵時間對于在發(fā)酵過程中富集GABA也是一個重要的因素。發(fā)酵時間過短，感官上會造成凝固不完全等現(xiàn)象，GABA生成量太低，如本研究所添加的Lb.plantarum需要72 h的發(fā)酵才能達到GABA的最高產(chǎn)量[16]；但發(fā)酵時間過長，發(fā)酵過度，產(chǎn)酸過多，代謝副產(chǎn)物增多，也會導(dǎo)致乳清析出過多，產(chǎn)品分層等現(xiàn)象，使產(chǎn)品感官品質(zhì)降低。需要綜合考慮去控制合適的發(fā)酵時間，使之同時得到感官品質(zhì)高和GABA質(zhì)量濃度高的豆酸乳。

分別設(shè)置發(fā)酵時間為8，10，12，14，16 h。其余條件控制為混合菌接種量0.5%，發(fā)酵溫度40℃，初始p H值為7。制得發(fā)酵豆酸乳并進行感官品質(zhì)和GABA測定，根據(jù)感官品質(zhì)和GABA定量比較結(jié)果確定最佳發(fā)酵時間。由圖6可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，感官品質(zhì)先升高后降低，發(fā)酵時間為12 h時感官品質(zhì)最好，之后感官品質(zhì)降低較明顯，發(fā)酵逐漸過度，乳清析出加重，口感也過酸。由圖6可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，GABA含質(zhì)量濃度在持續(xù)增加，但增長趨勢緩慢。綜合考慮，確定最佳的發(fā)酵時間為12 h。

圖6 發(fā)酵時間對感官品質(zhì)和GABA質(zhì)量濃度的影響

3 結(jié) 論

本研究以大豆粉為主要發(fā)酵原料，乳酸菌為發(fā)酵菌開發(fā)富含GABA的發(fā)酵豆酸乳。以感官質(zhì)量評分和GABA質(zhì)量濃度為指標(biāo)，利用紙層析法快速定性、氨基酸分析儀定量比較探究不同發(fā)酵條件對發(fā)酵豆酸乳的影響。在本研究中，基于單因素分析法，混合菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間是影響GABA產(chǎn)量的主要因素，當(dāng)采用發(fā)酵條件為：混合菌接種量0.6%，初始發(fā)酵p H值為7，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時間12 h，此時制得豆酸乳中GABA質(zhì)量濃度為13.22μg/mL，使得發(fā)酵豆酸乳中GABA質(zhì)量濃度大幅提高，同時具有優(yōu)良感官質(zhì)量品質(zhì)評價。許多研究表明富含GABA的食物可以降低劑量依賴的自發(fā)性高血壓小鼠的血壓[17]，Inoue K等人[18]研究表明持續(xù)12周每天攝取10 mg的GABA對于輕度高血壓患者有效；Kono I.和Park K.B.的研究[19-20]指出當(dāng)食物中的GABA保證一定攝入量，則可調(diào)節(jié)疼痛和焦慮感以及血清中的脂質(zhì)水平并改善記憶力和學(xué)習(xí)能力。因此，攝取一定的豆酸乳可以滿足有GABA保健需求的消費者。這些健康益處吸引了醫(yī)療、化學(xué)和食品行業(yè)的興趣，在食品中添加或富集GABA，開發(fā)更多有效的生物活性功能性的GABA補充劑，能夠提升食品的營養(yǎng)健康價值具有良好的應(yīng)用前景。

本研究探索將乳酸菌產(chǎn)GABA應(yīng)用于功能性豆制品開發(fā)過程的發(fā)酵條件的優(yōu)化，研究富集GABA發(fā)酵豆酸乳的工藝方法和考察評估感官質(zhì)量，可為開發(fā)富含GABA的功能性食品、豐富大豆及其制品的原料豆類提供參考。作為富集GABA的新型功能性豆制品，既要求達到富集GABA的產(chǎn)量，也滿足發(fā)酵豆酸乳的良好口感，需針對生產(chǎn)工藝不斷進行優(yōu)化。相信富含GABA的豆酸乳的研發(fā)成功，將為我國大豆產(chǎn)業(yè)的深加工延伸及其技術(shù)發(fā)展，增添新亮點。