詹揚(yáng)，萬建華，李穎萌，楊妮，曹星辰，胡旭，劉文君

(江中藥業(yè)股份有限公司，南昌330004)

0 引言

腸道菌群是指分布在腸道的微生物菌群，它們與腸道系統(tǒng)共同構(gòu)成了腸道微生態(tài)，是維持腸道正常功能的基本保障[1]。腸道菌群失調(diào)是一些全身性疾病和消化系統(tǒng)疾病發(fā)生的病因或相關(guān)因素，其與消化系統(tǒng)疾病的關(guān)系是目前的研究熱點(diǎn)，長期大量使用廣譜抗生素導(dǎo)致腸道菌群紊亂極易發(fā)生藥源性腹瀉[2]，稱為抗生素相關(guān)性腹瀉（AAD），是抗生素使用常見的藥物副作用[2-3]。近年來，廣譜抗生素的大量使用導(dǎo)致AAD的發(fā)生率逐步增高，在接受抗生素治療的住院兒童約20%發(fā)生抗生素相關(guān)性腹瀉[4]。乳酸菌素是一種純?nèi)樗峋x產(chǎn)生的，將脫脂乳經(jīng)殺菌和真空濃縮后，再經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后干燥而制成的乳酸菌代謝產(chǎn)物混價(jià)粉狀物[5]，是改善腸道環(huán)境和調(diào)節(jié)腸道功能的傳統(tǒng)藥物，具有熱穩(wěn)定性和耐熱性，不受加工條件限制，安全性高，相比益生菌制劑其價(jià)格低廉易儲藏。隨著廣譜抗生素的應(yīng)用，近年來AAD的發(fā)生率呈逐漸增多的趨勢，其臨床表現(xiàn)輕重不一，可出現(xiàn)腹瀉、腸炎更甚者可引起死亡，同時(shí)使患者住院時(shí)間延長、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，是臨床丞待解決的問題。乳酸菌素片是常用的調(diào)節(jié)腸道功能的非處方藥物，本研究基于測序技術(shù)通過大鼠盲腸內(nèi)容物樣本的腸道微生物揭示出乳酸菌素通過干預(yù)腸道微生物達(dá)到治療腹瀉的作用，對引起腹瀉的腸道致病菌具有明顯的抑制作用，阻止病原菌侵襲，保護(hù)并促進(jìn)有益菌的生長，對于維持腸道正常微生態(tài)水平的有益菌具有明顯的增殖作用，為臨床抗生素應(yīng)用導(dǎo)致的腸道問題提供有效的解決方案。

1 材料和方法

1.1 試劑

硫酸慶大霉素(含量≥590 U/mg，批號：20190122）,福安藥業(yè)集團(tuán)煙臺只楚藥業(yè)有限公司；鹽酸林可霉素（含量≥90%，批號：20180818），河南新鄉(xiāng)華星藥廠；乳酸菌素片（批號：18059061，含量：按乳酸菌素計(jì)0.4 g/片），江中藥業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器

Secura225D-1CN型電子天秤，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；電子數(shù)顯卡尺（規(guī)格：0.01mm），南京蘇測計(jì)量儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明小鼠40只，22～25 g，雄性，許可證號：SCXK（贛）2018-0003，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)，適應(yīng)性飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物科技中心SPF級動物房。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠腸道菌群失調(diào)腹瀉模型建立

SPF級雄性昆明小鼠40只，其中16只為正常組，剩余24只造模。正常組按0.5 mL/只的劑量灌胃無菌水，造模組灌胃濃度為0.4 g/mL的硫酸慶大霉素和鹽酸林可霉素各50%的復(fù)配液，0.5 mL/只，每日灌胃2次，連續(xù)6 d，小鼠糞便變得軟濕，呈黃綠色水樣便，則說明造模成功[6-7]。

1.4.2 分組及給藥

根據(jù)排便情況選取16只造模成功的腹瀉小鼠隨機(jī)平分為模型組和乳酸菌素片組，乳酸菌素片組日給藥劑量（按乳酸菌素計(jì)）為：1.2 g/kg，藥片用研缽研碎后加無菌水溶解制成混懸液，藥液濃度為0.024 g/mL，灌胃量0.5 mL/次，每日灌胃2次。空白組和模型組灌胃無菌水0.5 m L/次，每日2次，共給藥5 d，第6天時(shí)，每組取8只小鼠收集盲腸內(nèi)容物暫存于液氮罐中備檢。

1.4.3 樣品采集

分別在造模結(jié)束后取正常組和造模組及給藥5 d后模型組和乳酸菌素片組的各8只小鼠盲腸內(nèi)容物立即置于液氮中保存。

1.4.4 一般情況觀察

小鼠每日稱體質(zhì)量，由于腹瀉小鼠盲腸脹大明顯，所以給藥結(jié)束后將盲腸結(jié)扎后剪下稱重，游標(biāo)卡尺測量盲腸長度，然后于超凈工作臺中取完盲腸內(nèi)容物后，再將盲腸稱重，通過2次稱重差值計(jì)算盲腸內(nèi)容物重量[8]。

1.4.5 小鼠腸道微生物16SrRNA基因高通量測序

測定取0.2 g小鼠盲腸內(nèi)容物，進(jìn)行微生物群落總DNA抽提和16SrRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進(jìn)行測序。對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控及優(yōu)化序列，優(yōu)化序列按照97%相似性對非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列；將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。然后，以O(shè)TU表格為基礎(chǔ)進(jìn)行物種分類，生成系統(tǒng)發(fā)育樹，并對樣品各水平相對豐度進(jìn)行劃分；依據(jù)OTU表格數(shù)據(jù)進(jìn)行每個(gè)文庫多樣性分析，并利用R軟件（Version 3.4.2）繪制稀釋曲線、Rank-Abundance曲線、Chao1指數(shù)箱線圖以及Shannon指數(shù)箱線圖。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)分析

各組數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正常組與模型組及模型組與給藥組比較均采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異顯著。腸道菌群多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student’s t-test檢驗(yàn)0.01＜P≤0.05標(biāo)記為*，0.001＜P≤0.01標(biāo)記為**，P≤0.001標(biāo)記為***。

2 結(jié)果

2.1 不同組別小鼠體重、排便狀況、盲腸內(nèi)容物指數(shù)等的差異性比較

與正常組相比，模型組給予抗生素造模6 d后，模型組小鼠采食量下降，被毛豎立，扎堆現(xiàn)象嚴(yán)重，肛周黏附軟濕糞便，應(yīng)激排便呈黃綠色水樣便，少許夾有血絲，個(gè)別出現(xiàn)脫肛，正常組未見明顯異常。已知小鼠腹瀉狀態(tài)下其盲腸重量、盲腸指數(shù)和盲腸內(nèi)容物指數(shù)與正常組相比顯著增大，模型組與正常組相比盲腸長度、體重、盲腸重量等顯著增大（P＜0.001），結(jié)果見表1，說明抗生素腹瀉模型造模成功[8]。

表1 造模6 d后，模型組與正常組相比一般情況比較(n=8，x±s)

給藥5 d后，模型組小鼠糞便仍呈輕微濕軟狀態(tài)，成形性較差，乳酸菌素片組的小鼠糞便成形性及硬度明顯優(yōu)于模型組，同時(shí)，小鼠的盲腸重量、盲腸指數(shù)和盲腸內(nèi)容物指數(shù)和模型組相比顯著減小（P＜0.01、P＜0.001，P=0.0001/0.00003/0.0040），結(jié)果見表2，表明乳酸菌素組給藥5 d后可明顯改善腹瀉小鼠腸道狀態(tài)。

表2 給藥5 d后，模型組與乳酸菌素片組相比一般情況比較(n=8，x±s)

2.2 乳酸菌素片給藥5 d后對小鼠腸道微生物多樣性的影響分析

2.2.1 測序結(jié)果質(zhì)量分析

由圖1（a）可知，隨著測序深度的增加，觀測物種的指數(shù)曲線趨于平緩，說明當(dāng)前測序深度足以發(fā)現(xiàn)各盲腸內(nèi)容物樣本中的大部分物種。同時(shí)，從圖1（b）中反映物種豐富度及均勻度的Rank-Abundance曲線可以看出，隨著OUT等級的增加，曲線愈加平坦并在橫軸的跨度也越來越大，說明樣品中物種的均勻度和相對豐度都達(dá)到了很高的水平。

圖1 樣品多樣性指數(shù)分析

2.2.2 Pan/Core物種分析

Pan/Core物種分析能判斷樣本量是否充足并且評估樣品中物種豐富度和核心物種數(shù)。根據(jù)Pan/Core物種曲線是否平緩，從而評估測序樣本量是否足夠。圖2（a）、圖2（b）中隨著樣本量增加，曲線趨于平滑，說明各組樣本量充足。灌胃純水5 d后模型組的曲線位于最下端，其總物種豐富度和核心物種數(shù)量最低。給藥組總物種豐富度和核心物種數(shù)也較低，但相比模型組有所升高。

圖2 各組腸道菌群α多樣性變化

2.2.3 腸道菌群Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可采用群落多樣性指數(shù)包括Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)表示。造模結(jié)束后和乳酸菌素片給藥5 d后對模型組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)的影響結(jié)果見圖3，造模結(jié)束后，與對照組比較，模型組Simpson指數(shù)顯著升高且Shannon指數(shù)顯著降低（0.3281±0.26635vs0.05601±0.01865，2.3129±1.2085 vs 3.9018±0.1564，P＜0.05，P=0.0354/0.0130），說明抗生素致腹瀉模型小鼠腸道菌群豐富度和群落中個(gè)體分配上的均勻性都顯著降低，抗生素致腸道菌群紊亂型腹瀉小鼠模型造模成功，由于個(gè)體差異性，模型組造模6 d后腸道群落多樣性指數(shù)差異較大，停止抗生素干預(yù)5 d后模型組腸道群落多樣性指數(shù)的差異性逐漸減少，說明小鼠腸道內(nèi)菌群自身在不斷調(diào)整。乳酸菌素片組與模型組比較，Simpson指數(shù)顯著降低且Shannon指數(shù)顯著升高（0.4918±0.0606vs0.2098±0.03812，1.1219±0.12825 vs 2.2167±0.2098，P＜0.0001，P=9.211×10-8/1.432×10-8），說明乳酸菌素能顯著提高腸道菌群紊亂型腹瀉小鼠的腸道菌群多樣性。

圖3 模型組小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)

2.2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)與組成分析

PCA得分圖（見圖4）中PC1和PC2對總體方差解釋的百分比分別為46.49%和24.81%，PCoA得分圖（見圖5）中PC1和PC2對總體方差解釋的百分比分別為41.6%和24.6%，模型組樣本點(diǎn)與正常組樣本點(diǎn)可以完全分開，模型組樣本點(diǎn)差異較大，結(jié)果和Alpha多樣性結(jié)果吻合，表明抗生素致小鼠腸道菌群紊亂模型造模成功。模型組樣本點(diǎn)與乳酸菌素片組樣本點(diǎn)完全分開，說明乳酸菌素片組腸道菌群的整體結(jié)構(gòu)與組成相比模型組發(fā)生了較大變化。

圖4 PCA分析圖

圖5 PCoA分析圖

2.2.5 乳酸菌素片對腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，在種水平下各組樣本中豐度前10的物種組成情況見圖6，活潑瘤胃球菌屬（unclassified_g_[Ruminococcus]_Gnavus_group）、梭狀芽孢桿菌_ND 2（Clostridium_sp._ND2）、生酸擬桿菌（Bacteroides_acidifaciens）、未分類的類桿菌（unclassified_g_Bacteroides）、不可培養(yǎng)的另枝菌（uncultured_bacterium_g_Alistipes）、腸球菌屬（Enterococcus_casseliflavus_g_Enterococcus）、羅爾斯頓菌屬（Ralstonia_mannitolilytica）、志 賀 氏 菌 屬（Escherichia_coil_Escherichia-Shigella）、未分類的乳酸桿菌屬（unclassified_g_Lactobacillus）、不可培養(yǎng)的無毒梭菌（uncultured_bacterium_g_[Clostridium]_innocuum_group）、不可培養(yǎng)的未分類的鼠桿菌科（uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae），乳酸菌素片組腸道菌群組成與模型組有較大差異。

圖6 種水平下各組樣本腸道菌群的相對豐度

2.2.6 腸道菌群物種差異分析

根據(jù)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，乳酸菌素片組與模型組的腸道菌群多樣性具有較大差異，乳酸菌素片的干預(yù)使得抗生素致腹瀉小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的組成發(fā)生了改變，為了比較乳酸菌素片干預(yù)后造成腸道微生物多樣性差異的關(guān)鍵菌屬，進(jìn)一步在屬水平下比較乳酸菌素片組與模型組豐度前10的物種差異性，組間差異性檢驗(yàn)結(jié)果見圖7，乳酸菌素片組與模型組比較有害菌豐度顯著降低（(62.06±15.95)%vs(27.78±11.43)%，(7.062±4.134)%vs(1.497±0.5112)%，P＜0.01，P=0.0031/0.0015）的有兩個(gè)，包括活潑瘤胃球菌屬（[Ruminococcus]_Gnavus_group）、無 害 梭 菌 組 屬（[Clostridium]_Innocuum_group），有益菌豐度顯著增加（(0.01927±0.048)%vs(14.58±10.3)%，(1.265±2.936)%vs(3.203±1.366)%，P＜0.05，P=0.0014/0.0177）的有兩個(gè)，包括腸球菌屬（Enterococcus）、糞芽孢菌屬（Coprobacillus）。腸道正常菌屬豐度顯著增加（(1.108±2.229)%vs(3.339±3.041)%，(0.1032±0.1816)%vs(3.024±3.97)%，(0.3366±0.1864)%vs(1.561±1.666)%，P＜0.05，P=0.0230/0.0065/0.0240）的有3個(gè)，包括布勞特氏菌屬（Blautia）、無嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）、未 分 類 的 毛 螺 菌 屬（unclassified_f_Lachnospiraceae）。

圖7 乳酸菌素片組與模型組屬水平下關(guān)鍵菌屬差異性比較

3 結(jié)果與討論

本研究采用抗生素干預(yù)小鼠腸道使其菌群組成嚴(yán)重破壞，模擬臨床抗生素致腹瀉患者的腸道微環(huán)境，在給予乳酸菌素5 d后，乳酸菌素片組的小鼠腹瀉狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組，進(jìn)一步采用16SrRNA基因測序技術(shù)對乳酸菌素對AAD小鼠的作用做了菌群水平的系統(tǒng)解析和關(guān)鍵菌屬的差異性比較。結(jié)果顯示，乳酸菌素片組給藥5 d后AAD小鼠的腸道菌群多樣性及物種豐度和模型組相比已有了顯著升高，其腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成與模型組相比有較大差異，進(jìn)一步的腸道菌群整體結(jié)構(gòu)分析可知，剛造模結(jié)束的模型組和自然恢復(fù)5 d后模型組之間也存在較大差異，說明停止抗生素干預(yù)后小鼠腸道菌群變化過程也較快，進(jìn)一步物種的組成分析及豐度前10的物種差異分析可知，乳酸菌素片組的活潑瘤胃球菌屬（[Ruminococcus]_Gnavus_group）和無害梭菌組屬（[Clostridium]_Innocuum_group）相比模型組極顯著性降低，其中無害梭菌組屬（[Clostridium]_Innocuum_group）是引起抗生素相關(guān)性腹瀉的典型致病菌[9-10]。活潑瘤胃球菌屬和多種腸道疾病相關(guān)如炎性腸病[11]、克羅恩腸炎[12]、憩室炎[13]等。乳酸菌素是乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生的具有益生功效的代謝產(chǎn)物稱為后生元[14]，前期已有研究證明乳酸菌在代謝過程中可產(chǎn)生過氧化氫，同時(shí)可產(chǎn)生氧化性中間產(chǎn)物，抑制病原菌的生長繁殖[15]，本文首次在腸道菌群的角度證明乳酸菌素對活潑瘤胃球菌屬和無害梭菌屬具有明顯的抑制作用。

乳酸菌素片組相比模型組的腸球菌屬（Enterococcus）、無嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）、布勞特氏菌屬（Blautia）和毛螺菌屬（Lachnospiraceae）都有顯著升高（P＜0.05）。腸球菌屬（Enterococcus）[16]是在哺乳動物腸道內(nèi)廣泛存在的兼性厭氧型腸道菌，包括糞腸球菌、鳥腸球菌、希臘腸球菌等多種類型，是人類及動物體內(nèi)正常菌群的重要組成部分。毛螺菌屬（Lachnospiraceae）為腸道有益菌，可將復(fù)雜的多糖降解為短鏈脂肪酸，如乙酸丁酸和丙酸，從而為宿主提供能量[17]。無嗅梭菌屬（Lachnoclostridium）和布勞特氏菌屬（Blautia）均屬于厚壁菌門的腸道常見菌。由此可見，乳酸菌素可快速調(diào)整抗生素致腹瀉小鼠的腸道菌群紊亂結(jié)構(gòu)，使菌群的多樣性增加，抑制或殺滅典型腹瀉相關(guān)菌屬，增加腸道有益菌和正常菌豐度。

本研究側(cè)重于乳酸菌素對腸道菌群紊亂小鼠腸道菌生長增殖的影響，對于具體作用機(jī)制研究不足，16SrRNA基因分析主要是對基因高變區(qū)進(jìn)行分析測序，通常是屬水平，屬于較高的分類學(xué)水平，無法有效鑒定到種水平，對于具體功能研究有較大限制。