景安琪，張鳳梅，孫立山，吳楠，雙全

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018；2.正藍(lán)旗長虹乳制品廠，內(nèi)蒙古錫林郭勒盟027200）

0 引言

目前，我國大部分企業(yè)仍需依靠購買進(jìn)口發(fā)酵劑才能進(jìn)行生產(chǎn)，存在著生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)速率低等問題，因此自主研發(fā)相關(guān)直投式發(fā)酵劑至關(guān)重要。主流的直投式發(fā)酵劑通常采用真空冷凍干燥法[1]，可降低產(chǎn)品因熱不穩(wěn)定而造成的損失[2]，而且冷凍干燥過程中向菌懸液中添加凍干保護(hù)劑，可以有效防止外界壓力對細(xì)胞膜磷脂雙分子層的破壞，從而減少低溫、高壓等物理或化學(xué)傷害[3-4]，提高乳酸菌的存活率。

本實(shí)驗(yàn)前期從傳統(tǒng)奶豆腐發(fā)酵乳中分離純化出一株優(yōu)勢菌株，編號為D655，經(jīng)16srRNA鑒定為乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis，本實(shí)驗(yàn)通過選擇甘油、山梨醇、脫脂乳、葡萄糖、菊粉、海藻糖、谷氨酸鈉和谷胱甘肽作為單一保護(hù)劑進(jìn)行研究，以凍干存活率為目標(biāo)，結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面分析法，選擇出最優(yōu)保護(hù)劑配比方案，并將直投式發(fā)酵劑用于奶豆腐生產(chǎn)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

鮮牛乳由內(nèi)蒙古正藍(lán)旗長虹乳制品廠提供，乳酸菌D655分離自內(nèi)蒙古正藍(lán)旗長虹乳制品廠奶豆腐發(fā)酵乳。

MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱生物科技有限公司；甘油，天津科貿(mào)化學(xué)試劑有限公司；山梨醇，美國西格瑪sigma公司；脫脂乳，北京酷來搏科技有限公司；葡萄糖，天津福晨化學(xué)試劑廠；菊粉，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；海藻糖、谷氨酸鈉、谷胱甘肽，北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BSA223S-CW電子分析天平，德國Sartorius公司；FDU-2200真空冷凍干燥機(jī)，日本Eyela公司；DW-86L728J超低溫保存箱，海爾集團(tuán)；SX-500全自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司；一次性注射器20 mL，河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)股份有限公司；0.22μm過濾器，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；K9860全自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；SA 402B電子舌，日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

新鮮牛乳→均質(zhì)→殺菌→降溫→接種→凝乳酶凝乳→切割→排乳清→堆釀→切碎加鹽→熱燙拉伸→冷卻成型→包裝

①均質(zhì)：為防止殺菌過程中脂肪上浮，將新鮮牛乳取回后，放入潔凈的均質(zhì)機(jī)中進(jìn)行均質(zhì)；

②殺菌：均質(zhì)后將牛乳放入80℃的水浴鍋中加熱攪拌15 min，取出后迅速冷卻至37℃。

③接種：提前1 d將單菌株按照2%的比例加入巴氏殺菌后的牛乳中，發(fā)酵至凝乳，制作成母發(fā)酵液。將母液按照10%的比例加入牛乳中進(jìn)行酸化，控制發(fā)酵溫度為37～38℃，每隔二十分鐘取樣，測其酸度。

④凝乳酶凝乳，凝乳酶進(jìn)行活化：稱取2 g食品級NaCl，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的鹽水，滅菌后放入37℃水浴鍋，以0.04 g/kg計(jì)算稱取凝乳酶的添加量，將稱取的凝乳酶倒入小燒杯中，以凝乳酶∶鹽水=1∶50的比例量取預(yù)熱好的鹽水并倒入盛放凝乳酶的燒杯中進(jìn)行活化，活化30 min后方可使用。待牛乳酸度達(dá)到22～23°T，加入活化后的凝乳酶，迅速攪拌1 min并調(diào)高發(fā)酵溫度至42℃，靜置凝乳40 min。

⑤切割：凝乳塊達(dá)適當(dāng)硬度時(shí)，用食指斜向插入凝塊中約3 cm，當(dāng)手指向上抬起時(shí)，如裂紋整齊，指上無小片凝塊殘留且乳清透明時(shí)，即可開始進(jìn)行切割。將凝塊切成1 cm3的小方塊，在原溫度下保持10 min。

⑥排乳清：當(dāng)乳清大量析出時(shí)，乳清分兩次排除，第一次排除一半，攪拌5 min，然后排除所有乳清。將干酪粒堆釀，堆釀期間每隔10 min將凝塊上下翻轉(zhuǎn)。

⑦堆釀加鹽：將堆釀后的凝塊切碎，加入原乳3%的食鹽，攪拌均勻

⑧熱燙、拉伸：將奶豆腐粒裝入容器中，加入85℃左右水，反復(fù)揉捏并拉伸折疊，凝塊可拉成絲狀即可。

⑨冷卻、包裝：將奶豆腐裝入模具中，放入5～10℃的高濃度鹽水中使其硬化，30 min后取出，進(jìn)行真空包裝。

1.3.2 菌株培養(yǎng)及凍干流程

將保藏的乳酸菌活化，按照體積分?jǐn)?shù)為3%的接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h后，在轉(zhuǎn)速為5500 r/min離心條件下離心15 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水沖洗兩次后，去除上清液，得到菌泥，加入與菌泥體積比為2∶1的保護(hù)劑[5]，混勻后，于-80℃下預(yù)冷凍12 h后，真空冷凍干燥24 h，得到凍干菌粉。

1.3.3 凍干存活率

將凍干后的乳酸菌粉加入與凍干前等體積的生理鹽水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%）進(jìn)行復(fù)水，按照稀釋涂布平板法接入MRS固體培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h，用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，每組做3個(gè)平行。

凍干存活率計(jì)算公式[6]：

式中：a為凍干存活率；m1為凍干前活菌數(shù)；m2為凍干后活菌數(shù)。

1.3.4 單一保護(hù)劑

經(jīng)查閱大量相關(guān)文獻(xiàn)，將凍干保護(hù)劑分為多元醇類、糖類、氨基酸類、蛋白質(zhì)/肽類和聚合物類這5大類，本試驗(yàn)依據(jù)這5大類凍干保護(hù)劑，從中選擇甘油、山梨醇、葡萄糖、菊粉、海藻糖、谷氨酸鈉、谷胱甘肽和脫脂乳作為凍干保護(hù)劑進(jìn)行研究。根據(jù)白友菊[5]研究中所述方法，略作改進(jìn)，各因素水平如表1所示。

表1 不同保護(hù)劑濃度水平設(shè)計(jì) g/100 mL

取一定量的上述保護(hù)劑，溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%生理鹽水中，配制成上表中的不同質(zhì)量濃度的保護(hù)劑；脫脂乳于110℃滅菌10 min，其余物質(zhì)通過孔徑為0.22μm過濾膜進(jìn)行過濾除菌后備用。按照1.3.1中所述方法，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以乳酸菌凍干存活率為依據(jù)，研究各種單一保護(hù)劑對乳酸菌存活率的影響[7]。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇脫脂乳、海藻糖、谷氨酸鈉3個(gè)因素的3個(gè)水平，顯著中心為零水平，高水平和低水平比零水平高或者低1/2個(gè)原始實(shí)際步長，用Box-Behnken法優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以凍干存活率為響應(yīng)值來確定最佳凍干保護(hù)劑的配比研究，響應(yīng)面水平表如表2所示，每組實(shí)驗(yàn)做3組平行，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)因子及水平 g/100 mL

1.3.6 直投式發(fā)酵劑制作奶豆腐與市售奶豆腐對比

根據(jù)響應(yīng)面法篩選出最佳凍干保護(hù)劑配方后，將凍干菌粉D 655用無菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%的生理鹽水復(fù)水，以3%的接種量接入脫脂乳中，按照1.3.2中工藝流程制作改進(jìn)式奶豆腐。以長虹乳制品廠生產(chǎn)的市售奶豆腐為對照組，根據(jù)國標(biāo)中規(guī)定方法測定水分、蛋白質(zhì)、脂肪及灰分，用電子舌對滋味進(jìn)行測定分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS進(jìn)行處理分析，用Origin 2018進(jìn)行圖片處理制作，用Design-Expert 11進(jìn)行響應(yīng)面模型擬合并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保護(hù)劑

單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同保護(hù)劑對菌株D655凍干存活率的影響

由圖1可知，保護(hù)劑為脫脂乳、海藻糖、谷氨酸鈉的存活率顯著高于其他組別（P＜0.05）。當(dāng)保護(hù)劑為6 g/100 mL脫脂乳時(shí)出現(xiàn)峰值，為82.44%，這與許娜等人[8]的研究結(jié)果相似；在谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為18%時(shí)，菌株D655的凍干存活率出現(xiàn)最高值為85.72%；大量試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在海藻糖中存活率較高，是較優(yōu)質(zhì)的凍干保護(hù)劑，并經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)海藻糖能和細(xì)胞膜中的某些成分形成氫鍵作用，取代水的位置，保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[9]，提高乳酸菌的存活率，通過試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)海藻糖質(zhì)量濃度為6 g/100 mL和18 g/100 mL時(shí)，存活率出現(xiàn)兩次峰值，分別為55.12%和58.91%，但考慮到實(shí)際應(yīng)用及成本費(fèi)用等因素，盡量選擇低成本、高效率的保護(hù)劑，因此，最終選擇以脫脂乳（6 g/100 mL）、海藻糖（6 g/100 mL）和谷氨酸鈉（18 g/100 mL）3種凍干保護(hù)劑及其質(zhì)量濃度為中心因子，進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化組合試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化凍干保護(hù)劑

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以脫脂乳（A）、海藻糖（B）和谷氨酸鈉（C）為自變量，以凍干存活率（Y）為響應(yīng)值，利用Design-Expert11設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)表，結(jié)果如表3所示；對菌株D 655進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到的響應(yīng)面分析結(jié)果如表4所示。經(jīng)回歸擬合后得到菌株D655凍干存活率的回歸方程：

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 D655凍干存活率的方差分析

由表4可知，模型P＜0.0001，說明該回歸模型極顯著，且失擬項(xiàng)大于0.05，證明試驗(yàn)誤差較小，且A2，B2和C2的P值均小于0.05，影響顯著，可以用該模型來反映3種因素之間的交互作用以及對乳酸菌D655凍干存活率的影響[10]。從表中也可看出，對菌株D655凍干存活率影響因素分別是海藻糖（B）＞谷氨酸鈉（C）＞脫脂乳（A）。

圖2反映了所有響應(yīng)的殘差與線性均無重大偏差，表明殘差呈正態(tài)分布。由圖3可以看出，實(shí)際值在預(yù)測值標(biāo)準(zhǔn)線兩側(cè)均勻分布，表明實(shí)驗(yàn)實(shí)際值和模型預(yù)期值契合度高，擬合程度良好，這也驗(yàn)證了模型的統(tǒng)計(jì)假設(shè)[11]。

圖2 殘差率的正態(tài)分布

圖3 預(yù)測值與實(shí)際值的關(guān)系

響應(yīng)面圖和等高線圖可以反映兩因素之間的交互作用，響應(yīng)面越陡峭說明兩自變量間的交互作用對響應(yīng)值影響程度越大，相反，則不顯著，同時(shí)等高線越接近橢圓，兩因素的交互作用越顯著，越接近圓形則交互作用越不顯著[12-14]。

由圖4可以看出，因素AB和因素BC的響應(yīng)面曲面陡峭，等高線接近橢圓，因此因素AB和因素BC之間是有顯著的交互作用（P＜0.05）；且存活率隨著保護(hù)劑的增加呈先上升后下降的趨勢，這可能是由于高質(zhì)量濃度的保護(hù)劑可以加速細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聚合，形成較強(qiáng)的玻璃化結(jié)構(gòu)，反而不利于細(xì)胞的保存，且復(fù)水效果不好[15]，當(dāng)海藻糖為低質(zhì)量濃度時(shí)，存活率隨著脫脂乳質(zhì)量濃度增加呈先上緩慢升至某一值后緩慢下降的趨勢；將海藻糖質(zhì)量濃度固定時(shí)，存活率隨著谷氨酸鈉增加呈上升至某一值后迅速下降的趨勢。且通過響應(yīng)面圖形可看出，谷氨酸鈉上升幅度比海藻糖，說明谷氨酸鈉對存活率的影響更大，這與方差分析結(jié)果一致。

圖4 3種因素交互作用的響應(yīng)面及等高線

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)建立模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，以凍干存活率最高值為優(yōu)化目標(biāo)，得到凍干菌株D655的最佳保護(hù)劑方案為：脫脂乳質(zhì)量濃度5.548 g/100 mL，海藻糖質(zhì)量濃度5.371 g/100 mL，谷氨酸鈉質(zhì)量濃度18.145 g/100 m L，參照曾慧慧等人研究根據(jù)試驗(yàn)條件修正配方[16]，修正得到菌株D 655最佳保護(hù)劑方案為，脫脂乳質(zhì)量濃度5.5 g/100 mL，海藻糖質(zhì)量濃度5.5 g/100 mL，谷氨酸鈉質(zhì)量分濃度18 g/100 mL。按照修正后的最佳方案進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，得到結(jié)果如表5所示。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株D655組的平均凍干存活率為88.68%，預(yù)測值為87.92%，RSD%為2.83%，預(yù)測值與實(shí)際值接近，表明此配方為最優(yōu)組合。

2.4 直投式發(fā)酵劑制作奶豆腐與市售奶豆腐對比

圖5為奶豆腐實(shí)試驗(yàn)組與對照組理化指標(biāo)對比結(jié)果。

圖5 實(shí)驗(yàn)組與對照組理化指標(biāo)對比

由圖5可知，對實(shí)驗(yàn)組及對照組進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對照組奶豆腐水分分別為50.28%和52.36%，無顯著差異（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)25.16%，顯著高于對照組（P＜0.001），說明在制作奶豆腐過程中，排出乳清較為清澈，蛋白質(zhì)流失較少；實(shí)驗(yàn)組的脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.8%，對照組為19.8%，顯著高于對照組；實(shí)驗(yàn)組與對照組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.32%和3.19%，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組（P＜0.05），可能是由于實(shí)驗(yàn)組水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照組低，因此灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升。

國外已經(jīng)開始運(yùn)用電子舌技術(shù)在奶酪品質(zhì)及制作過程中品質(zhì)的監(jiān)測，但國內(nèi)相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組與市售奶豆腐滋味是否存在差異，應(yīng)用電子舌系統(tǒng)檢測兩組奶豆腐的6種基本滋味和3種回味，各滋味得分結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，實(shí)驗(yàn)組與對照組具有相似滋味得分輪廓，差異很小，無法看出二者的區(qū)別。方差分析結(jié)果如表6所示。

圖6 實(shí)驗(yàn)組與對照組的滋味

由表6可以看出，實(shí)驗(yàn)組與對照組在酸味、苦味、澀味、回味-A及回味-B無顯著差異（P＞0.05），說明實(shí)驗(yàn)組與對照組均無不良風(fēng)味，而實(shí)驗(yàn)組在咸味及甜味與對照組有顯著差異（P＜0.01），可能是由于實(shí)驗(yàn)組在浸泡完鹽水后，立即取出進(jìn)行測試，表面鹽水濃度過高，導(dǎo)致咸味值高，后續(xù)可通過工藝優(yōu)化來解決此問題；實(shí)驗(yàn)組的鮮味值顯著高于對照組（P＜0.05），可能是因?yàn)樘砑恿税l(fā)酵乳酸菌液，乳酸菌將大分子的蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生各種游離氨基酸，如天冬氨酸、谷氨酸等，因此鮮味有所提高[17]，同理，實(shí)驗(yàn)組的豐富度也顯著高于對照組（P＜0.001）。

表6 改進(jìn)式奶豆腐與市售奶豆腐各滋味指標(biāo)差異性分析

直投式發(fā)酵劑發(fā)酵的奶豆腐在滋味方面與市售奶豆腐相似，脂肪、蛋白質(zhì)、灰分的含量優(yōu)于市售傳統(tǒng)奶豆腐，可對直投式發(fā)酵劑替代傳統(tǒng)奶豆腐生產(chǎn)進(jìn)行更深入的研究。

3 結(jié) 論

以菌株D 655的凍干存活率為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定了3種保護(hù)劑及其質(zhì)量濃度：脫脂乳6 g/100 m L，海藻糖6 g/100 m L，谷氨酸鈉18 g/100 m L；通過響應(yīng)面分析法，確定保護(hù)劑最佳配方為脫脂乳5.5 g/100 mL，海藻糖5.5 g/100 mL，谷氨酸鈉18 g/100 mL，此條件下凍干存活率最高，為88.68%。

將直投式發(fā)酵劑用于改進(jìn)式奶豆腐后測得水分、蛋白質(zhì)、脂肪及灰分分別為50.28%，25.16%，22.8%及3.76%，與市售奶豆腐相比有所提高；電子舌測得改進(jìn)式奶豆腐的與市售奶豆腐得分輪廓相似，在鮮味及豐富度優(yōu)于市售奶豆腐。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此配方凍干保護(hù)劑有效的提高了乳酸菌的存活率，且直投式發(fā)酵劑制作奶豆腐在滋味方面基本無差異，理化指標(biāo)顯著優(yōu)于市售奶豆腐，為后續(xù)高效率且低成本的優(yōu)質(zhì)奶豆腐開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。