孫棋棋, 宋金明, 4, 袁華茂, 4, 李學(xué)剛, 4

細(xì)菌源3-羥基脂肪酸作為環(huán)境變化代用指標(biāo)的研究進(jìn)展

孫棋棋1, 2, 3, 宋金明1, 2, 3, 4, 袁華茂1, 2, 3, 4, 李學(xué)剛1, 2, 3, 4

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071; 4. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

細(xì)菌源3-羥基脂肪酸(C10–C18)作為環(huán)境變化指示指標(biāo)具有良好的應(yīng)用前景, 但相關(guān)研究還很不系統(tǒng), 在海洋環(huán)境中的應(yīng)用剛剛起步。3-羥基脂肪酸主要用于環(huán)境中pH和溫度的重建, 通過(guò)其支鏈比(異構(gòu)和反異構(gòu)3-羥基脂肪酸之和/正構(gòu)3-羥基脂肪酸之和)與pH的顯著正相關(guān)關(guān)系反演環(huán)境中的pH, 通過(guò)其C15和C17同系物的反異構(gòu)/正構(gòu)比(RAN15和RAN17)與大氣年均溫的顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系反演環(huán)境中的溫度, 相比基于甘油二烷基甘油四醚類(lèi)化合物或其他生物標(biāo)志物的環(huán)境代用指標(biāo)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。然而, 陸地生態(tài)系統(tǒng)中基于3-羥基脂肪酸的環(huán)境指標(biāo)不適用于海洋環(huán)境, 最新研究提出了基于3-羥基脂肪酸的新的海洋溫度指標(biāo)(RAN13), 而3-羥基脂肪酸作為海洋環(huán)境中pH替代指標(biāo)的成功應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。3-羥基脂肪酸與特定細(xì)菌群落的空間耦合或菌株培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示含有3-羥基脂肪酸的細(xì)菌可能主要是變形菌、藍(lán)細(xì)菌等。分析表明, 3-羥基脂肪酸作為全球環(huán)境演變有效的替代指標(biāo)需要更多的數(shù)據(jù)和證據(jù)支持, 未來(lái)可從海洋適用性、新指標(biāo)體系和微生物來(lái)源幾個(gè)方面展開(kāi)繼續(xù)研究。

3-羥基脂肪酸; 革蘭氏陰性細(xì)菌; 環(huán)境變化代用指標(biāo); 溫度; pH

新的環(huán)境代用指標(biāo)的發(fā)掘有利于評(píng)估海洋環(huán)境中的氣候變化和改善對(duì)過(guò)去全球氣候的理解, 微生物來(lái)源的膜脂類(lèi)化合物即為其中之一[1]。為了應(yīng)對(duì)環(huán)境變化, 微生物(細(xì)菌、古菌和一些原核生物)通過(guò)調(diào)整其細(xì)胞膜組分維持其流動(dòng)性并保證細(xì)胞膜的最佳狀態(tài), 這一內(nèi)穩(wěn)態(tài)保持機(jī)制稱(chēng)為“均黏調(diào)試”[2]。具體而言, 細(xì)菌通過(guò)改變不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值、調(diào)整支鏈脂肪酸的比值和減少碳鏈長(zhǎng)度來(lái)適應(yīng)外界溫度變化[3]。例如, 在低溫時(shí)微生物會(huì)趨向于增加磷脂脂多糖中熔點(diǎn)較低的羥基脂肪酸的含量, 從而降低膜脂的熔點(diǎn), 使其在低溫下也能夠保持較好的流動(dòng)性, 維持正常的生理代謝[4]。相反地, 在pH較低的條件下微生物會(huì)降低支鏈脂肪酸的含量, 從而降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性來(lái)阻止氫離子的脅迫滲入, 維持細(xì)胞內(nèi)部接近中性的pH[5]。微生物類(lèi)脂物結(jié)構(gòu)和組成相對(duì)穩(wěn)定, 其完整的分子骨架能保存在地質(zhì)樣品中, 并靈敏地響應(yīng)地質(zhì)環(huán)境條件的變化[1]。因此基于微生物類(lèi)脂物結(jié)構(gòu)變化的環(huán)境代用指標(biāo)可以迅速、高分辨地記錄古環(huán)境變遷, 具有良好的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有的微生物環(huán)境代用指標(biāo)各有優(yōu)缺點(diǎn), 準(zhǔn)確估測(cè)基于生物標(biāo)志物的古溫度或古環(huán)境面臨巨大的挑戰(zhàn)[6]。近年來(lái), 細(xì)菌源的支鏈甘油雙烷基甘油四醚(brGDGTs)作為少數(shù)能夠用來(lái)重建陸地溫度和pH的有機(jī)生物標(biāo)志物成為研究熱點(diǎn)[7]。然而, 其甲基化指數(shù)僅在10～25 ℃范圍內(nèi)與溫度呈良好的相關(guān)性, 基于其重建的溫度數(shù)據(jù)在干旱等極端環(huán)境下存在較大偏差[1], 且生物合成來(lái)源不明確[8], 因此基于brGDGT的古環(huán)境數(shù)據(jù)須謹(jǐn)慎理解?；诠啪吹念?lèi)異戊二烯甘油雙烷基甘油四醚(iGDGTs)的溫度指標(biāo)TEX86已廣泛應(yīng)用于全球海洋[9]。然而, 基于TEX86的溫度估算結(jié)果會(huì)受到季節(jié)變化和其他與溫度無(wú)關(guān)的因素影響而產(chǎn)生偏差[9-10], 在受陸源輸入影響較大的邊緣海用TEX86重建古溫度需慎重。另外, 不同有機(jī)生物標(biāo)志物提供的環(huán)境信息可能存在沖突, 獨(dú)立的指標(biāo)能夠保證古環(huán)境重建的可靠性, 因此尋找能夠示蹤環(huán)境變化的獨(dú)立指標(biāo)十分必要。

細(xì)菌3-羥基脂肪酸(3-hydroxy fatty acids, 3-OH- FAs), 也稱(chēng)為β-羥基脂肪酸, 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜外膜(細(xì)胞壁)上的脂多糖中類(lèi)脂A的主要成分[11]。3-羥基脂肪酸最初主要是作為內(nèi)毒素的特征標(biāo)志物廣泛地應(yīng)用于人或哺乳動(dòng)物醫(yī)藥研究和臨床生物標(biāo)志物發(fā)掘[12], 近年來(lái)逐漸應(yīng)用于環(huán)境健康和環(huán)境監(jiān)測(cè)[13-14]、植物識(shí)別病原菌的免疫通路[15]等方面。通過(guò)對(duì)3-羥基脂肪酸的定量, 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境和臨床樣本中細(xì)菌內(nèi)毒素和革蘭氏陰性細(xì)菌的檢測(cè)和定量[16]。

本文從結(jié)構(gòu)與分布特征、微生物來(lái)源、指示環(huán)境變化的原理和優(yōu)勢(shì)及其在不同生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用等方面歸納總結(jié)了一個(gè)新的微生物來(lái)源的環(huán)境變化指示指標(biāo)3-羥基脂肪酸的研究概況。

1 3-羥基脂肪酸的基本特征

1.1 3-羥基脂肪酸的結(jié)構(gòu)與組成

環(huán)境中占主導(dǎo)地位的3-羥基脂肪酸包括10到18個(gè)碳原子并在距離羧基的第三個(gè)碳原子位置上有一個(gè)羥基(表1, 圖1), 通過(guò)酯鍵或酰胺鍵與大分子結(jié)合, 因而不易降解, 能夠較為完好的保存在地質(zhì)環(huán)境中[17]。3-羥基脂肪酸的前體物質(zhì)是革蘭氏陰性菌, 在變形菌黃桿菌屬[18]、浮游態(tài)藍(lán)細(xì)菌[19]、新型隱球菌[20]、酵母菌[21]、分枝桿菌[22]等細(xì)菌中都能檢測(cè)到。此外, 革蘭氏陽(yáng)性乳桿菌也能夠產(chǎn)生碳鏈長(zhǎng)度為C10到C18的3-羥基脂肪酸[23]。隨著碳數(shù)增加, 熔點(diǎn)逐漸升高, 低碳數(shù)的脂肪酸呈無(wú)色液體, 有刺激性氣味, 而高碳數(shù)的脂肪酸是蠟狀固體, 無(wú)明顯氣味。人工合成的3-羥基脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品呈無(wú)色粉末狀固體, 室溫儲(chǔ)存, 其中C10至C16的3-羥基脂肪酸均可溶于有機(jī)溶劑正己烷, 而C17和C18僅溶于甲醇。

表1 3-羥基脂肪酸的種類(lèi)

圖1 3-羥基脂肪酸的結(jié)構(gòu)式(n=6～14)

支鏈脂肪酸(Branched-chain fatty acids, BCFA)是一類(lèi)碳骨架上帶有一個(gè)或多個(gè)支鏈(主要是甲基)的脂肪酸, 由于特定的支鏈結(jié)構(gòu), 使其區(qū)別于直鏈脂肪酸具有一些特殊的理化性質(zhì), 如較低的凍點(diǎn)、良好的熱穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。在一些微生物(芽孢桿菌等)中約90%的膜脂脂肪酸是BCFA, 可使細(xì)胞膜具有良好的流動(dòng)性[24]。末端甲基位置對(duì)單甲基BCFA分子構(gòu)型非常重要: 甲基位于脂肪酸分子碳鏈骨架倒數(shù)第2個(gè)碳原子上形成的結(jié)構(gòu)稱(chēng)為異構(gòu)型(iso), 甲基位于脂肪酸碳鏈骨架倒數(shù)第3個(gè)碳原子上形成的結(jié)構(gòu)稱(chēng)為反異構(gòu)型(anteiso)。不同構(gòu)型BCFA性質(zhì)相差較大, 相同碳鏈長(zhǎng)度的BCFA反異構(gòu)型熔點(diǎn)遠(yuǎn)低于異構(gòu)型。微生物通過(guò)降低細(xì)胞膜中iso/anteiso-BCFA的比例適應(yīng)外部環(huán)境溫度的變化, 保持細(xì)胞膜的功能性和流動(dòng)性[25-26]。

1.2 3-羥基脂肪酸在環(huán)境中的分布特征

3-羥基脂肪酸在環(huán)境中普遍存在且含量豐富。研究表明, 來(lái)自坦桑尼亞不同氣候帶的39個(gè)土壤樣品中總3-羥基脂肪酸的含量為0.8～24.2 μg/g(干重)[27]。北太平洋西海岸邊緣海的45個(gè)表面沉積物樣品中檢測(cè)到, 總3-羥基脂肪酸的濃度為1.0～36.0 μg/g(干重)[10]。黑海的研究[28]發(fā)現(xiàn), 3-羥基脂肪酸約占黑海顆粒態(tài)有機(jī)物中總羥基脂肪酸的100%, 約占沉積物中羥基脂肪酸的60%。赤道太平洋、墨西哥灣和北海中超濾可溶有機(jī)物(高分子量溶解有機(jī)物)的研究[29]表明, 短鏈的3-羥基脂肪酸占海水超濾可溶有機(jī)物的6%～91%, 這表明細(xì)菌細(xì)胞膜來(lái)源的類(lèi)脂化合物或許是海洋溶解態(tài)有機(jī)物質(zhì)的重要組成成分之一。黑海的研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn), 3-羥基脂肪酸的濃度在30 m的表層水中含量較高, 并隨著深度增加而降低。表層水同時(shí)具有最高的革蘭氏陰性菌豐度和3-羥基脂肪酸含量, 因而推測(cè)海洋沉積物中3-羥基脂肪酸可能主要來(lái)自于表層水[28]。

神農(nóng)架的26個(gè)土壤樣品包括異構(gòu)的C11, C13, C15, C16, C17和反異構(gòu)的C13, C15, C173-羥基脂肪酸, 但以正構(gòu)C143-羥基脂肪酸為主碳峰[5]。來(lái)自湖北和尚洞一根2.5 m的石筍以-C10、-C12、-C14、-C16和-C183-羥基脂肪酸的含量最高[30]。最近有研究報(bào)道了酸性礦坑水樣品中3-羥基脂肪酸的分布特征以-C12和-C16為主, 這是首次對(duì)極端酸性環(huán)境中3-羥基脂肪酸分布的報(bào)道[31]。類(lèi)似的, 坦桑尼亞跨緯度跨氣候帶的39個(gè)土壤樣品也以偶數(shù)的正構(gòu)同系物為主, 其中尤以-C14、C16和C18為最豐富的3-羥基脂肪酸[27]。北太平洋西海岸邊緣海的表層沉積物中3-羥基脂肪酸組成主要包括偶數(shù)的C12、C14和C16正構(gòu)同系物和奇數(shù)的C15反異構(gòu)同系物[10]。比較分析發(fā)現(xiàn), 海洋表層沉積物中具有較多的反異構(gòu)3-羥基脂肪酸, 土壤中則含有較多的正構(gòu)和異構(gòu)高分子量3-羥基脂肪酸(C15–C18)。實(shí)際上, 無(wú)論是土壤[5]還是海洋表層沉積物[10],-C14都是3-羥基脂肪酸主要的同系物。一般來(lái)說(shuō), 3-羥基脂肪酸主要的同系物都屬于C12、C14或C16之一。與此不同的是, 海南尖峰嶺土壤樣品經(jīng)過(guò)皂化處理使得通過(guò)酯鍵結(jié)合的游離態(tài)脂肪酸能夠被儀器檢測(cè)到, 獲得了主峰碳為C18的3-羥基脂肪酸, 這與酸解獲得的3-羥基脂肪酸分布模式不同, 這是由于皂化不能打斷酰胺鍵, 因此通過(guò)酰胺鍵結(jié)合的C14或C16含量較少[32]。

1.3 3-羥基脂肪酸的微生物來(lái)源

對(duì)于微生物環(huán)境代用指標(biāo)而言, 細(xì)菌膜脂的不同來(lái)源可能混淆或掩蓋其反映的環(huán)境信息, 判別細(xì)菌生物標(biāo)志物準(zhǔn)確的生物合成來(lái)源非常必要?；谖⑸镱?lèi)脂物的生物標(biāo)志物和微生物群落都能夠反映其所在的環(huán)境地球化學(xué)條件的變化[33], 二者的耦合關(guān)系是現(xiàn)有研究判別3-羥基脂肪酸微生物來(lái)源的主要依據(jù)。

由于不同的環(huán)境條件影響革蘭氏陰性菌及其膜脂的組成成分(也就是3-羥基脂肪酸), 目前的研究結(jié)果隨生態(tài)系統(tǒng)的不同而變化。多數(shù)研究認(rèn)為, 以洞穴土壤、滴水和石筍為代表的陸地生態(tài)系統(tǒng)中, 3-羥基脂肪酸的生產(chǎn)者是-變形菌假單胞菌屬[30]。楊毅等在北太平洋西海岸邊緣海的研究[10]探索和比較了海洋沉積物和土壤中不同的3-羥基脂肪酸和微生物分布, 推測(cè)海洋沉積物中3-羥基脂肪酸的生產(chǎn)者可能是-及-變形菌, 而土壤中可能是-、-、-、-變形菌和酸桿菌的混合來(lái)源。然而在地下水和河口次表層沉積物中盡管-C16: 0 3-OH-FA占其磷脂脂多糖脂肪酸的16.9%, 卻未能在定向培養(yǎng)的4個(gè)Gammaproteobacterium菌株中被檢測(cè)到, 說(shuō)明-變形菌不是該環(huán)境條件下沉積物中3-羥基脂肪酸的來(lái)源[34]。黑海的系列研究根據(jù)革蘭氏陰性菌和3-羥基脂肪酸在海洋水柱中一致的分布格局(表層富集, 且隨深度下降)推測(cè)黑海中3-羥基脂肪酸的生物合成起源可能是微藻、藍(lán)細(xì)菌類(lèi)脂物和一些厭氧甲基營(yíng)養(yǎng)的細(xì)菌[28]。然而, 在2°S的赤道太平洋未能觀測(cè)到超濾溶解有機(jī)物中3-羥基脂肪酸濃度隨深度變化的現(xiàn)象[29]。

不同的微生物屬/種也能夠產(chǎn)生不同組分的3-羥基脂肪酸。對(duì)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品系的研究指出, 大腸桿菌中只含有3-羥基十四烷酸, 且大腸桿菌型別對(duì)3-羥基脂肪酸種類(lèi)無(wú)影響, 認(rèn)為只要出現(xiàn)3-羥基十四烷酸以外的3-羥基脂肪酸即可斷定含有非腸道菌[35]。有研究指出, 有10、12或14個(gè)碳原子的3-羥基脂肪酸主要來(lái)自不同的假單胞菌屬[36], 而在擬桿菌屬和梭桿菌屬中最豐富的同系物是C14或C163-羥基脂肪酸[37]。菌株培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Deltaproteo-bacterium地桿菌屬中以3-OH-14: 0和3-OH-16: 0為主要同系物[38]。另一個(gè)菌株培養(yǎng)研究卻發(fā)現(xiàn)-C15: 0 3-OH-FA或-C17: 0 3-OH-FA才是脫硫弧菌屬細(xì)胞膜磷脂脂多糖中最主要的羥基脂肪酸[39]。赤道太平洋、墨西哥灣和北海中超濾可溶有機(jī)物的研究發(fā)現(xiàn), C12: 0 3-羥基脂肪酸是革蘭氏陰性假單胞菌屬中羥基酸的主要同系物; 聚球藻屬中的3-14: 0和3-16: 0 3-羥基脂肪酸占總脂肪酸的10%, 支鏈(異構(gòu)和反異構(gòu))3-15: 0和3-17: 0 3-羥基脂肪酸僅占總脂肪酸的5%; 束毛藻屬sp中僅僅包含痕量的(約為1%)C12: 0 3-羥基脂肪酸和C14: 0 3-羥基脂肪酸; 而革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌屬則幾乎不存在羥基脂肪酸[29]。

目前關(guān)于3-羥基脂肪酸生產(chǎn)者的研究尚未達(dá)成一致結(jié)論, 僅可推測(cè)其生物合成來(lái)源可能以變形菌和藍(lán)細(xì)菌門(mén)為主?，F(xiàn)有研究的判別依據(jù)主要是環(huán)境中3-羥基脂肪酸與特定微生物群落的空間耦合, 或者定向菌株培養(yǎng)實(shí)驗(yàn), 前者不能提供直接強(qiáng)有力的證據(jù), 結(jié)果并不可靠, 后者費(fèi)時(shí)費(fèi)力, 目標(biāo)靶向性較弱。

1.4 3-羥基脂肪酸的檢測(cè)分析

3-羥基脂肪酸的前處理流程主要包括: 酸解-萃取-濃縮-甲酯化-柱層析-衍生化等步驟, 內(nèi)標(biāo)法判定回收率, 外標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。3-羥基脂肪酸經(jīng)過(guò)甲酯化和硅烷化后的脂肪酸甲酯的特征離子峰為175 m/z (圖2), 為第3個(gè)和第4個(gè)碳原子之間的鍵斷裂造成, 是3-羥基脂肪酸區(qū)別于其他脂肪酸質(zhì)譜最重要的特征?；鶞?zhǔn)峰為平均分子質(zhì)量減去1個(gè)甲基(15 Da)。內(nèi)標(biāo)為DL-3-羥基十四烷酸, 其特征離子峰為m/z 178, 包括離子碎片中有3個(gè)氘原子。

圖2 C16 3-羥基脂肪酸衍生化甲酯的質(zhì)譜圖[5]

Blyth等[40]首次提出, 酸解法可提高從石筍中獲取脂肪酸和3-羥基脂肪酸的效率。在此基礎(chǔ)上, Wang等[41]優(yōu)化了從石筍中獲取高產(chǎn)3-羥基脂肪酸的酸解法, 通過(guò)對(duì)比不同的HCl濃度、加熱溫度和加熱時(shí)間, 得到最優(yōu)的酸解條件為3 mol/L的鹽酸、130 ℃加熱和3 h的加熱時(shí)間, 并提出5 g石筍/土壤樣品、10 g海洋沉積物即足夠用來(lái)脂類(lèi)提取和分析檢測(cè)。Yang等[42]比較了酸解和皂化兩種提取方法對(duì)土壤中3-羥基脂肪酸分布模式和濃度的影響, 得出酸解法提取效率顯著高于皂化的結(jié)論, 這是由于3-羥基脂肪酸的主要分子都是通過(guò)酰胺鍵與大分子相結(jié)合, 而酰胺鍵很難通過(guò)皂化斷裂。

目前, 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatographic- mass spectrometry, GC-MS)是最常用的細(xì)菌3-羥基脂肪酸檢測(cè)方法[5, 10, 13, 27, 30, 43], 典型的GC-MS譜圖見(jiàn)圖2和圖3?？茖W(xué)家們也嘗試了其他的檢測(cè)儀器, 如, 氣相色譜-四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用與氣相色譜-串聯(lián)離子阱質(zhì)譜聯(lián)用相結(jié)合(quadrupole GC-MS and ion trap GC- MS/MS)[44]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chroma-tography coupled to tandem mass spectrometry: LC- MS/MS)[16]等。Larsson等[45]比較了GC-離子阱MC (GC-MS/MS)和傳統(tǒng)的四級(jí)桿GC-MS檢測(cè)復(fù)雜樣品中3-羥基脂肪酸的能力, 發(fā)現(xiàn)GC-MS/MS能夠獲得全部標(biāo)志物的子離子色譜, 其靈敏度接近GC-MS的檢出限, 因此GC-MS/MS作為一個(gè)化學(xué)標(biāo)志物分析技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。也有研究比較了四級(jí)桿GC-MS和GC-MS/MS檢測(cè)室內(nèi)降塵的效果[44]發(fā)現(xiàn), GC-MS/MS優(yōu)異的分選特性使其能夠呈現(xiàn)清晰可辨的圖譜, 而GC-MS獲得的圖譜由于較高的背景值和混合析出的化合物而難以解讀, 因此GC-MS/ MS優(yōu)于GC-MS。針對(duì)目前報(bào)道的3-羥基脂肪酸GC-MS/MS分析方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)與其同分異構(gòu)體2-羥基脂肪酸的分離, 可能導(dǎo)致共流出的2-羥基脂肪酸干擾其定量這一問(wèn)題, 傅博強(qiáng)等[46]通過(guò)優(yōu)選毛細(xì)管色譜柱實(shí)現(xiàn)了二者在色譜柱上的基線分離。盡管如此, 基于GC-MS的3-羥基脂肪酸檢測(cè)方法仍然存在樣品準(zhǔn)備階段甲酯化和衍生化耗時(shí)費(fèi)力, 且衍生化會(huì)導(dǎo)致多源和多峰現(xiàn)象影響定量結(jié)果的問(wèn)題[16]。近年, 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/ MS)以其高靈敏度和分選特征開(kāi)始應(yīng)用于3-羥基脂肪酸的檢測(cè)。Uhlig等[16]利用高分辨LC-MS/MS (ultraper-formance LC-MS/MS, UPLC- MS/MS)的方法檢測(cè)到環(huán)境中11種3-羥基脂肪酸。他們最新的研究基于結(jié)構(gòu)依賴(lài)的保留時(shí)間預(yù)測(cè)模型, 利用UPLC-MS/MS建立了全球通用的判別3-羥基脂肪酸與其同分異構(gòu)體2-羥基脂肪酸的測(cè)定方法[47], 顯示了巨大的應(yīng)用潛力。

圖3 南海、黃海、白令海、北太平洋表層沉積物和土壤中3-羥基脂肪酸萃取離子質(zhì)譜圖(特征離子峰m/z 175)的典型分布[10]

2 3-羥基脂肪酸與環(huán)境變化的關(guān)系

2.1 3-羥基脂肪酸指示環(huán)境變化

由于脂肪酸的支鏈能夠增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性[26]和滲透性[48], 細(xì)菌可以通過(guò)改變細(xì)胞膜上3-羥基脂肪酸等不同脂類(lèi)的甲基支鏈數(shù)來(lái)響應(yīng)環(huán)境變化[49]。

3-羥基脂肪酸指示環(huán)境中pH變化主要是通過(guò)其支鏈比(異構(gòu)和反異構(gòu)3-羥基脂肪酸之和/正構(gòu)3-羥基脂肪酸之和)與pH的顯著正相關(guān)關(guān)系反演環(huán)境中的pH(表2)。在pH較低的條件下支鏈比降低反映了化學(xué)滲透耦聯(lián)這一內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制, 即, 細(xì)菌產(chǎn)生具有較少支鏈的同系物從而降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性來(lái)抗衡細(xì)胞膜內(nèi)外較大的氫離子濃度差, 目的是為了維持細(xì)胞內(nèi)部接近中性的pH。細(xì)胞內(nèi)自由態(tài)的氫離子能損害DNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成等過(guò)程并抑制酶活性。細(xì)菌細(xì)胞膜兩側(cè)氫離子濃度差的存在和維持, 通過(guò)影響那些存在于細(xì)胞膜核心脂上、傳遞氫離子的水分子, 對(duì)細(xì)胞的能量供應(yīng)至關(guān)重要[50], 其大小取決于周?chē)h(huán)境中的氫離子濃度。細(xì)菌適應(yīng)較低pH環(huán)境的通常策略為: 一方面累積鈉離子平衡細(xì)胞膜兩側(cè)的濃度梯度, 一方面降低3-羥基脂肪酸的支鏈比, 使得細(xì)胞膜組裝得更加致密厚實(shí), 建立氫離子化學(xué)滲透屏障, 阻止氫離子的被動(dòng)滲透[31]。同時(shí), 細(xì)胞膜滲透性降低可在細(xì)胞水平上降低能量流失, 從而幫助微生物在極端酸性條件下幸存。

表2 基于3-羥基脂肪酸的環(huán)境代用指標(biāo)及其優(yōu)勢(shì)[5]

注: 其中,(normal-)代表所有正構(gòu)3-羥基脂肪酸的和,(iso-)代表所有異構(gòu)3-羥基脂肪酸的和,(anteiso-)代表所有反異構(gòu)3-羥基脂肪酸的和。MAAT代表年均氣溫(℃)

3-羥基脂肪酸指示環(huán)境中溫度的變化主要是通過(guò)其C15和C17同系物的反異構(gòu)/正構(gòu)之比(RAN15和RAN17)與年均溫的顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系反演環(huán)境中的溫度(表2)。3-羥基脂肪酸C15和C17同系物的反異構(gòu)/正構(gòu)之比隨溫度的降低而增加, 即在低溫時(shí)細(xì)菌合成更多的反異構(gòu)同系物。反異構(gòu)3-羥基脂肪酸具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì), 能夠在低溫條件下維持微生物細(xì)胞膜的液晶狀態(tài), 使其保持較好的流動(dòng)性。反異構(gòu)脂肪酸具有比正構(gòu)脂肪酸較低的熔點(diǎn), 其固液相轉(zhuǎn)變溫度顯著低于異構(gòu)脂肪酸[51]。當(dāng)溫度較低時(shí), 細(xì)菌為了維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性、保持正常的生理代謝, 需要增加反異構(gòu)3-羥基脂肪酸(RAN指數(shù))。異構(gòu)與正構(gòu)3-羥基脂肪酸之比則未能表現(xiàn)出同樣的響應(yīng)特征, 這是由異構(gòu)和反異構(gòu)脂肪酸不同的物理化學(xué)性質(zhì)造成的。反異構(gòu)的甲基支鏈位于距離甲基終端第3個(gè)碳原子上, 異構(gòu)的甲基支鏈位于距離碳鏈末端的第2個(gè)碳原子上, 因而反異構(gòu)支鏈脂肪酸具有相比異構(gòu)支鏈脂肪酸更高的流體化學(xué)性質(zhì)和不同的官能團(tuán)破壞次序[25]。此外, 反異構(gòu)脂肪酸具有相比正構(gòu)飽和脂肪酸和異構(gòu)脂肪酸更大的橫截面積, 能夠分散緊密排列的脂肪酰基鏈, 增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性。

2.2 3-羥基脂肪酸指示環(huán)境變化的優(yōu)勢(shì)

相比其他生物標(biāo)志物, 3-羥基脂肪酸在指示環(huán)境變化和重建古氣候方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)(表2)。

所有基于3-羥基脂肪酸的pH代用指標(biāo)都不受溫度、氣壓、降水和濕度的影響, 是獨(dú)立的微生物環(huán)境代用指標(biāo)。其中RIAN建立了與pH的線性關(guān)系, 簡(jiǎn)潔明了, 降低了計(jì)算難度; 支鏈指數(shù)在0～1變化, 這是其他pH指標(biāo)不具備的優(yōu)勢(shì); RIN指標(biāo)僅涉及正構(gòu)和異構(gòu)同系物, 不需要測(cè)定一般環(huán)境中含量最少的反異構(gòu)同系物, 降低了測(cè)定難度和復(fù)雜度。有研究比較了3-羥基脂肪酸與其他生物指標(biāo)在重建古pH時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)[52], 認(rèn)為相比硅藻組合、δ11B、B/Ca、brGDGTs等指標(biāo), 3-羥基脂肪酸的反演結(jié)果不受溫度、壓力等環(huán)境因素的影響, 然而作為一種新的生物標(biāo)志物其成熟度不夠, 需要分析較多的樣品和多角度數(shù)據(jù)的支持。

3-羥基脂肪酸在反演過(guò)去環(huán)境中的溫度時(shí)獨(dú)立于pH, 在pH劇烈變化或者可能存在多個(gè)混雜變量的環(huán)境中存在強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)[5]。有研究比較了基于3-羥基脂肪酸的RAN13與基于GDGT的溫度指標(biāo)TEX86[10], 發(fā)現(xiàn)在高溫(>25 ℃)的熱帶區(qū)域RAN13與溫度的擬合更靈敏, 低溫時(shí)TEX86對(duì)溫度不敏感, 而RAN13即使在<6 ℃的極地低溫情況也與溫度有強(qiáng)相關(guān)。此外, 通過(guò)測(cè)定一個(gè)較短的柱狀沉積物中3-羥基脂肪酸反演過(guò)去58 a的溫度[10], RAN13記錄了1959年至2017年長(zhǎng)期的增溫現(xiàn)象, 二十世紀(jì)七十至八十年代有4 ℃左右的強(qiáng)烈波動(dòng), 以及自二十世紀(jì)九十年代之后的持續(xù)增溫。相比之下, TEX86既不能重建長(zhǎng)期增溫趨勢(shì), 又無(wú)法精確地捕獲到二十世紀(jì)七十至八十年代的溫度振蕩[53]。這些都證明了RAN13是重建海洋古溫度的穩(wěn)健的指標(biāo), 即使在西太平洋邊緣海不斷的季節(jié)性陸源輸入也未能掩蓋或疊加3-羥基脂肪酸及其溫度指標(biāo)對(duì)海洋環(huán)境溫度的敏感響應(yīng)[10]。

3 3-羥基脂肪酸指示環(huán)境變化的研究進(jìn)展

過(guò)去3-羥基脂肪酸作為環(huán)境中革蘭氏陰性細(xì)菌的生物標(biāo)志物, 在土壤[54]、生物膜[55]、大氣氣溶膠[56]、石筍[57]和新鮮雪水[58]等不同的地質(zhì)體中檢測(cè)到。近年來(lái), 王燦發(fā)等首次建立了3-羥基脂肪酸對(duì)pH和溫度的響應(yīng)公式, 定義了基于3-羥基脂肪酸的環(huán)境代用指標(biāo)體系, 并將其應(yīng)用于陸地環(huán)境(土壤和石筍等)中[5, 30]。神農(nóng)架26個(gè)土壤樣品的研究發(fā)現(xiàn), 3-羥基脂肪酸的相對(duì)豐度與溫度和pH都存在顯著相關(guān)。具體地, 異構(gòu)反異構(gòu)3-羥基脂肪酸之和與總正構(gòu)3-羥基脂肪酸之和的比值(即RIAN指數(shù))、異構(gòu)反異構(gòu)3-羥基脂肪酸之和與總3-羥基脂肪酸的比值(即支鏈指數(shù)), 均與土壤pH顯著相關(guān); 3-羥基脂肪酸C15和C17化合物的異構(gòu)與正構(gòu)之比(分別為RAN15和RAN17指數(shù))與年均氣溫MAAT顯著負(fù)相關(guān)[5]。MAAT與RAN15和RAN17相關(guān)度相對(duì)較弱(表2), 將來(lái)的研究應(yīng)進(jìn)一步采集溫度差異顯著的不同地區(qū)土壤樣品, 加大樣本量, 進(jìn)一步確定MAAT和RAN15、RAN17間的相互關(guān)系。不久前華中地區(qū)和尚洞石筍的研究首次將基于3-羥基脂肪酸的環(huán)境代用指標(biāo)應(yīng)用在古氣候重建中, 利用RAN15指數(shù)重建了全新世溫度, 結(jié)果與儀器監(jiān)測(cè)的溫度及δ18O的記錄相吻合; 根據(jù)有效降水與pH之間的關(guān)系, 將pH指標(biāo)RIAN作為定性水文指標(biāo)重建了過(guò)去9 Ka BP的水文變化, 結(jié)果與全球模型和區(qū)域古氣候記錄吻合[30]。這些結(jié)果證實(shí)了3-羥基脂肪酸作為環(huán)境代用指標(biāo)的可靠性。Huguet等[27]將基于3-羥基脂肪酸的環(huán)境代用指標(biāo)推廣到國(guó)外, 驗(yàn)證了其在坦桑尼亞西南部跨越溫帶和熱帶的39個(gè)土壤樣品中的適用性。結(jié)果表明, RAN15和RAN17隨著溫度降低而相對(duì)增加, 但由于坦桑尼亞(半濕潤(rùn))和神農(nóng)架(濕潤(rùn))不同的濕度條件RAN15需要區(qū)域校正, RAN17則在0～25 ℃范圍之內(nèi)得以通用。然而, RIAN和pH之間僅存在中等的相關(guān)度, 且離散度較大。因此, 基于RIAN重建環(huán)境中pH在pH<5和>8的情況下存在估算偏差, 需謹(jǐn)慎使用。

基于3-羥基脂肪酸的環(huán)境代用指標(biāo)在海洋環(huán)境中的應(yīng)用剛剛起步。最近的研究首次將3-羥基脂肪酸應(yīng)用于海洋環(huán)境, 發(fā)現(xiàn)海洋沉積物中的溫度指標(biāo)(RAN15和RAN17)與海洋表面溫度不相關(guān)[10]。鑒于此, 楊毅等利用北太平洋西部邊緣海的表層沉積物數(shù)據(jù), 首次建立并校正了一個(gè)基于3-羥基脂肪酸的能夠獨(dú)立指代海水表層溫度的新指標(biāo)RAN13(反異構(gòu)和正構(gòu)C133-OH-FAs之比), 并利用它重建了海洋沉積物中古溫度信息。結(jié)果表明, 該指標(biāo)與古海洋溫度呈現(xiàn)顯著的指數(shù)關(guān)系[10]。同樣地, 陸地生態(tài)系統(tǒng)基于3-羥基脂肪酸的pH指標(biāo)(支鏈比、支鏈指數(shù)、RIAN和RIN)也不能適用于海洋環(huán)境, 而3-羥基脂肪酸指示海洋環(huán)境中pH變化的成功應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。作為一項(xiàng)重要的細(xì)菌脂類(lèi)生物標(biāo)志物, 3-羥基脂肪酸在海洋環(huán)境中的研究還有待繼續(xù)開(kāi)發(fā)和深入拓展。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

探究示蹤全球環(huán)境變化的微生物代用指標(biāo)意義重大, 3-羥基脂肪酸作為溫度和pH變化的代用指標(biāo)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力, 本文總結(jié)歸納了細(xì)菌源3-羥基脂肪酸的研究進(jìn)展及其在指示環(huán)境變化中的應(yīng)用。然而其在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的研究剛剛起步, 區(qū)域研究需要參數(shù)校正, 具體的細(xì)菌分類(lèi)學(xué)來(lái)源尚不確定。未來(lái)的研究可從以下幾個(gè)方面進(jìn)一步深入探究:

(1) 3-羥基脂肪酸指示海洋環(huán)境變化指標(biāo)體系的構(gòu)建。3-羥基脂肪酸作為溫度代用指標(biāo)在陸地和邊緣海環(huán)境中都有良好的應(yīng)用, 然而作為海洋環(huán)境中的pH替代指標(biāo)其應(yīng)用尚未取得進(jìn)展。實(shí)際上, 國(guó)際上目前尚未有成功應(yīng)用有機(jī)生物標(biāo)志物指標(biāo)重建海水pH的先例, 3-羥基脂肪酸的研究提供了可能性。陸地和近海的環(huán)境指標(biāo)不適用于深海大洋, 海洋緩沖體系的存在使得海洋環(huán)境中pH可以在一個(gè)較小的范圍內(nèi)(7.7～8.3)保持穩(wěn)定, 在如此小的變化范圍內(nèi)將3-羥基脂肪酸應(yīng)用于重建海水pH變化產(chǎn)生極大的挑戰(zhàn), 需要大量模擬實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和外海調(diào)查案例的支持和驗(yàn)證。推廣和校正3-羥基脂肪酸指示海洋環(huán)境變化的研究, 在此基礎(chǔ)上探索基于3-羥基脂肪酸的環(huán)境代用指標(biāo)在何種程度上能成為全球性的環(huán)境代用指標(biāo), 成為下一步工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

(2) 基于3-羥基脂肪酸的新指標(biāo)、新方法和新應(yīng)用。3-羥基脂肪酸指示環(huán)境變化的研究存在所需數(shù)據(jù)量較大、最低樣品量較多及前處理時(shí)間較長(zhǎng)等不足, 未來(lái)應(yīng)繼續(xù)改進(jìn)前處理方法、探索更加靈敏的檢測(cè)方法, 使其作為環(huán)境代用指標(biāo)更加經(jīng)濟(jì)高效。基于GDGT和3-羥基脂肪酸的環(huán)境代用指標(biāo)各有利弊, 二者相互驗(yàn)證可提高結(jié)果的可靠性。隨著氣相色譜-質(zhì)譜分離技術(shù)的提高, 已有指標(biāo)新的計(jì)算和反演方法、新環(huán)境下的參數(shù)校正、可能指示的新的環(huán)境參數(shù)或生態(tài)意義以及新指標(biāo)的構(gòu)建和應(yīng)用, 依然是相關(guān)研究重要的突破方面。3-羥基脂肪酸在缺氧海水相對(duì)于含氧水體的顆粒物中較高的濃度, 以及沉積物中更高的濃度, 表明其可能由厭氧細(xì)菌產(chǎn)生, 3-羥基脂肪酸指示大洋缺氧水體的潛力可能成為其應(yīng)用于海洋生態(tài)系統(tǒng)的突破口。

(3) 3-羥基脂肪酸的微生物來(lái)源判別。不同環(huán)境中3-羥基脂肪酸的生物合成來(lái)源存在很大的不確定性, 可能混淆或掩蓋其反映的環(huán)境信息, 判別細(xì)菌生物標(biāo)志物準(zhǔn)確的生物合成來(lái)源非常必要。目前已有的將3-羥基脂肪酸及細(xì)菌群落的空間關(guān)系耦合和定向菌株培養(yǎng)的方法分別存在巨大的缺陷, 如何限定更加具體的細(xì)菌屬/種來(lái)源, 對(duì)新的技術(shù)手段提出了要求, 也是下一步工作的難點(diǎn)。對(duì)微生物生理生態(tài)和代謝過(guò)程的理解有助于判別特定生態(tài)環(huán)境下的限制性因子, 彌補(bǔ)微生物環(huán)境代用指標(biāo)在應(yīng)用中的不足。弄清3-羥基脂肪酸所參與的生物化學(xué)過(guò)程和代謝路徑可能幫助厘清其生物合成來(lái)源, 技術(shù)上與高通量測(cè)序相結(jié)合仍是相關(guān)研究的重要手段, 微生物宏基因組和代謝組學(xué)可能能夠提供新的視角。

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Bacterial 3-hydroxy fatty acids as a biomarker of environ-mental change

SUN Qi-qi1, 2, 3, SONG Jin-ming1, 2, 3, 4, YUAN Hua-mao1, 2, 3, 4, LIXue-gang1, 2, 3, 4

(1. Key laboratory of marine ecology and environmental sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3.Center for Ocean Meta-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

3-hydroxy fatty acids; Gram-negative bacteria; environmental proxies; temperature; pH

The bacteria-derived 3-hydroxy fatty acid (C10–C18) has a good application prospect as a biomarker of environmental changes, but the related research is still not systematic, and its application in the marine environment has just started. 3-hydroxy fatty acid is mainly used for the reconstruction of the pH and temperature in the environment, through the significant postitive correlation between its branching ratios ( the ratios of the sum ofandto the total3-hydroxy fatty acids ) and pH to inverse the pH in the environment, through the significant negative correlations between the average annual atmospheric temperature and the ratios of theto3-hydroxy fatty acids of the C15or C17homologues (RAN15and RAN17) to inverse the temperature in the environment. 3-hydroxyl fatty acids have significant advantages over environmental proxies based on glycerol dialkyl glycerol tetraethers (GDGT) or other biomarkers. However, the environmental proxies based on 3-hydroxy fatty acids in terrestrial ecosystems are not applicable to the marine environment. A new marine temperature index (RAN13) based on 3-hydroxy fatty acids has been proposed in the latest research. However, the successful application of 3-hydroxy fatty acids as a proxy of pH in the marine environment has not been reported to the best of our knowledge. According to strain culture experiments or coupling of 3-hydroxy fatty acids and specific bacterial communities, the bacterial 3-hydroxy fatty acids presumably originated from bacteria such asand. The analysis shows that more data and evidence are needed to support 3-hydroxy fatty acids as effective proxies of global environmental change, and further research can be carried out from the aspects of marine applicability, new indicator system and microbial sources of 3-hydroxy fatty acids in the future.

Sep. 16, 2020

the Key Deployment Projects of Ocean Meta-Science Center, Chinese Academy of Sciences, No. COMS2019Q12; the Key Special Projects of Marine Science and Technology Funds of Shandong Province, No. 2018SDKJ0504-1; The Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, No. XDA23050501]

孫棋棋(1989—), 女, 山東惠民人, 博士, 主要從事海洋環(huán)境化學(xué)研究, E-mail: sunshine19890707@163.com; 宋金明(1964—), 男,通信作者, 河北棗強(qiáng)人, 博士, 研究員, 主要從事海洋生物地球化學(xué)方面的研究, E-mail: jmsong@qdio.ac.cn; 袁華茂(1975—), 男, 通信作者, 江蘇南通人, 博士, 研究員, 主要從事海洋生物地球化學(xué)研究, E-mail: yuanhuamao@qdio.ac.cn

O623

A

1000-3096(2021)08-0098-11

10.11759/hykx20200916001

2020-09-16;

2020-10-23

中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心重點(diǎn)部署項(xiàng)目 (COMS2019Q12); 山東省重大科技創(chuàng)新工程專(zhuān)項(xiàng)(2018SDKJ0504-1); 中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略先導(dǎo)性專(zhuān)項(xiàng)(XDA 23050501)

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)