方瑤雁，趙莘芷，徐大倫，楊文鴿

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江寧波 315211）

食物過敏是機體暴露于某種食品后可重復發(fā)生的有害健康的特定免疫反應，其典型癥狀表現(xiàn)為皮膚、呼吸道和胃腸道的紊亂以及心血管異常，嚴重時可導致危及生命的低血容量性休克[1]。根據(jù)其免疫反應特點，食物過敏分為免疫球蛋白E（Immunoglobulin E, IgE）和非IgE 介導或這兩種混合型，其中主要以IgE 介導的超敏反應為主，其發(fā)病機制如圖1 所示，主要分為2 個階段：在初始敏化階段，食物中的致敏原被胃腸道消化吸收，經(jīng)抗原遞呈細胞攝取后呈遞給T 細胞，激活后分化的Th2 型細胞產(chǎn)生白細胞介素IL-4、IL-13 等細胞因子，激活B 細胞分泌產(chǎn)生抗原特異性的IgE 抗體，并與肥大細胞上的高親和力IgE 受體結合；在激發(fā)效應階段，相同的抗原再次進入體內(nèi)激活該反應，肥大細胞結合的IgE 被抗原交聯(lián)，導致肥大細胞活化，并迅速釋放各種新合成的介質(zhì)，進一步誘發(fā)過敏炎癥反應。IgE 介導的食物過敏反應程度可從輕微的局部癥狀到嚴重的全身性反應，臨床表現(xiàn)為蕁麻疹、呼吸困難、嘔吐、腹痛、心血管衰竭等[2]。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)170 多種致敏食物，其中90%以上屬于八大類食物，分別是牛奶、雞蛋、魚、甲殼類動物、花生、大豆、小麥和堅果[3]。食物過敏的發(fā)生率與年齡密切相關。大部分兒童隨著年齡增長，出現(xiàn)對牛奶、大豆、雞蛋以及小麥的耐受，但對水產(chǎn)品、花生、堅果等的過敏卻持續(xù)存在[4]。導致機體發(fā)生過敏的抗原簡稱為致敏原，它們大多數(shù)是具有酸性等電點的糖蛋白，且分子量一般在10～80 kDa[5]。由于食物配料的多樣化及組成的復雜性，加上食物生產(chǎn)、流通和消費模式的改變，使其更容易引起過敏反應，這給食品過敏的預防帶來很大困難。對于食物過敏患者來說，避免進食相關的致敏原是預防過敏最安全有效的措施，但這使過敏患者不能隨心享受各種食品，同時有可能造成營養(yǎng)成分失衡。因此，只有降低或消除致敏原的致敏性，才能有效防止食物過敏。

圖1 IgE 介導的致敏蛋白免疫發(fā)病機制Fig.1 Immunopathogenesis of IgE-mediated sensitization protein

水產(chǎn)品營養(yǎng)豐富、味道鮮美，近年來消費人群不斷壯大，因而由此產(chǎn)生的水產(chǎn)品過敏事件也逐漸增多，消減水產(chǎn)品的致敏性迫在眉睫。目前，許多水產(chǎn)品致敏原的結構特征已被確定，有關水產(chǎn)品致敏蛋白的鑒定、檢測及其脫敏技術的研究報道也越來越多，這些工作對水產(chǎn)品過敏的預防和控制意義重大。鑒此，本文主要闡述了水產(chǎn)品致敏蛋白的主要種類、抗原表位、檢測方法及其脫敏技術，旨在為深入研究水產(chǎn)品致敏原、開發(fā)低致敏或無致敏性水產(chǎn)品提供指導，最終保障水產(chǎn)品消費者的健康。

1 水產(chǎn)品致敏蛋白的主要種類

魚類、甲殼類和軟體動物是主要的水產(chǎn)品致敏類食品。水產(chǎn)品中的致敏蛋白，主要分為鈣結合蛋白和原肌球蛋白兩大類[6]，此外還有精氨酸激酶、肌球蛋白輕鏈、血藍蛋白、膠原蛋白、磷酸丙糖異構酶等其他類致敏蛋白[7]。

1.1 鈣結合蛋白

鈣結合蛋白（Calcium-binding proteins, CBP）具有典型的螺旋-環(huán)-螺旋結構域（EF hand domain,EF 手型結構域），該結構域是由氨基酸殘基形成的鈣結合循環(huán)和2 個相鄰的α-螺旋組成的保守區(qū)域[8]。CBP 能在特定區(qū)域結合Ca2+，參與細胞間信號的運輸，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外Ca2+的濃度[9]。CBP 主要包括小清蛋白和肌質(zhì)鈣結合蛋白。

1.1.1 小清蛋白 小清蛋白（Parvalbumin, PV）是一種存在于鱈魚、鮭魚和鯉魚等魚類肌肉組織中的小型鈣結合蛋白，是魚類的主要致敏蛋白[10?11]，最早由Aas 等[12]從鱈魚中發(fā)現(xiàn)并取名為 Gad c 1。PV 的分子量通常為10～13 kDa，等電點介于4.1～5.2 之間[13]，具有易溶于水、耐高溫及不容易變性等特點。PV 包含三個典型的EF 手型結構域，它們對鈣離子具有高親和力，其中兩個能夠結合Ca2+，這使得PV 在調(diào)節(jié)肌肉的收縮和放松、鈣緩沖和信號轉(zhuǎn)導中起著非常重要的作用[14]。來自鱈魚、鮭魚和鯉魚等的小清蛋白被證明是導致70%～100%的魚類和魚制品過敏反應的原因[15]。PV 有兩種類型分別為：α-PV 和β-PV，但絕大多數(shù)的致敏性PV 屬于β-PV，這種致敏蛋白在不同種類的魚類中高度保守，并能導致過敏的交叉反應。有研究表明，某些PV 易受熱變性，說明這些魚的PV 可能具有構象表位，在熱處理后會失去抗體反應活性[15]。Kubota 等[16]對太平洋鯖魚的小清蛋白致敏性進行了研究，發(fā)現(xiàn)當魚肉組織被加熱到140 ℃時，小清蛋白的IgE 反應活性降低。近年來，學者也開始著手研究重組小清蛋白，如Sun 等[17]采用梯度硫酸銨分級法從日本牙鲆中提取了小清蛋白，然后通過克隆表達，在大腸桿菌中產(chǎn)生高度純化的重組小清蛋白，為進一步分析小清蛋白的結構與致敏性的關系提供了重要的基礎。

1.1.2 肌質(zhì)鈣結合蛋白 肌質(zhì)鈣結合蛋白（Sarcoplasmic calcium binding protein, SCP）存在于甲殼類動物肌漿蛋白中，是甲殼類動物的致敏蛋白之一。SCP 有四個EF 手型結構域（螺旋-環(huán)-螺旋），其中兩個或三個EF 手型結構域分別包含一個Ca2+結合位點[18]。SCP的相對分子質(zhì)量約為20 kDa，等電點為5.0。SCP 存在多態(tài)性，分別為：SCP-I、SCP-II 和SCP-III。Chen等[19]用柱層析法純化小龍蝦SCP，然后使用甲殼類過敏患者血清比較SCP 多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)相較于SCP-I和SCP-III，SCP-II 具有較弱的IgE 結合活性。

1.2 原肌球蛋白

原肌球蛋白（Tropomyosin, TM）存在于無脊椎動物肌肉和非肌肉細胞中，是甲殼類動物的主要致敏蛋白，尤其是蝦的主要熱穩(wěn)定性致敏原。TM 是由兩個相同的α-螺旋結構相互交織形成的同型二聚體，主要功能是促進肌鈣蛋白和肌動蛋白在橫紋肌細胞中的相互作用，調(diào)節(jié)肌肉收縮[20]。TM 是相對分子質(zhì)量約為34～38 kDa 的酸性糖蛋白，甲殼類動物TM的氨基酸序列同源性較高，相互之間具有很高的交叉反應[8]。有學者研究發(fā)現(xiàn)19 例患者中有10 例對鱈魚和長鰭金槍魚原肌球蛋白的具有IgE 反應[21]。近年來，國內(nèi)外學者對TM 純化方法進行了改進，減少了復雜、耗時的層析步驟。Chinnappan 等[22]利用硫酸銨沉淀法從黑虎對蝦和牡蠣中純化了原肌球蛋白；傅玲琳[23]等用硫酸銨沉淀、結合等電點、加熱的方法純化了南美白對蝦原肌球蛋白，并用喹啉酸法測定其質(zhì)量濃度最高可達43 μg/μL。

1.3 新型致敏蛋白

隨著對水產(chǎn)品致敏性研究的不斷深入，致敏蛋白的發(fā)現(xiàn)也越來越多。精氨酸激酶（Arginine kinase,AK）是無脊椎動物中一種重要的磷酸轉(zhuǎn)移酶，能可逆催化精氨酸磷酸化反應，在ATP 的貯藏和利用、細胞能量代謝中發(fā)揮重要作用。AK 的結構主要由一個N 端的球形結構域和一個C 端結構域組成，且在2 個結構域中有2 個高度保守的環(huán)，N 端結構域全部由α-螺旋組成，而C 端結構域則是由7 個α-螺旋包繞8 個反平行的β-折疊組成。在蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)品中，AK 也是一種重要的蛋白過敏原，分子量約為40 kDa，等電點在6.0～6.5 之間[24?26]。研究發(fā)現(xiàn)AK的熱穩(wěn)定較差，熱處理和酸堿處理均可降低AK 的致敏性[27]。由此可以認為，熱加工可以降低水產(chǎn)品因精氨酸激酶所引起的致敏性。

肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain, MLC）是組成肌球蛋白大分子復合物的一部分，也是一種較新型的過敏原，相對分子質(zhì)量約為18～20 kDa[13]。MLC分為約18 kDa 的基本輕鏈（MLC1）和約20 kDa 的調(diào)節(jié)性輕鏈（MLC2），等電點約為4.67，含有兩個Ca2+結合位點的結構域。Ayuso 等[28]從凡納濱對蝦中鑒定并克隆了MLC，并證實其具有致敏性，同時發(fā)現(xiàn)僅在煮熟的斑節(jié)對蝦蝦肉粗提物中檢測到MLC2的IgE 結合活性，而加熱后凡納濱對蝦MLC2 的IgE結合活性降低，認為不同種類的蝦肉MLC2 的熱穩(wěn)定性存在差異。

血藍蛋白（Hemocyanin）是甲殼類動物血淋巴中的一種氧轉(zhuǎn)運蛋白，占血淋巴總蛋白含量的75%～95%[25]。在自然狀態(tài)下，血藍蛋白往往由單個亞基組成的六聚體或多聚體，分子量約為60～80 kDa，等電點為5.27，是一種具有IgE 結合活性的高分子量致敏蛋白。近年來在無脊椎動物中多有發(fā)現(xiàn)，如鋸緣青蟹中分子量為14.3 kDa 的血藍蛋白亞基和克氏原螯蝦中分子量分別為68、72、76、82、84、88 kDa 等六聚體的血藍蛋白，均可被甲殼類過敏患者血清特異性識別，并且是一類具有熱穩(wěn)定性的糖蛋白[29]。

膠原蛋白（Collagen）是一種含大量甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸的纖維型蛋白質(zhì)，分子量約300 kDa，難溶于水，在水中僅出現(xiàn)膨脹狀態(tài)，溶于稀酸。膠原蛋白具有三股螺旋結構，這種獨特的結構賦予膠原蛋白支持和保護的功能。根據(jù)結構的不同，膠原蛋白大約可以分成20 類，動物體內(nèi)主要存在的I 型膠原蛋白是由2 條α1 亞基與1 條α2 亞基組成的三股螺旋結構[30]。Hamada 等[31]首次發(fā)現(xiàn)金槍魚膠原蛋白具有免疫結合活性，提出魚I 型膠原蛋白可能是一種新型過敏原，隨后發(fā)現(xiàn)鯉魚、日本鰻鱺、虹鱒魚等膠原蛋白也具有致敏性，并認為日本50%左右的魚過敏患者對I 型膠原蛋白過敏。目前對魚膠原蛋白的研究主要集中在制備及其功能開發(fā)方面，其致敏性的研究相對較少。

磷酸丙糖異構酶（Triosephosphate isomerase,TIM）是糖酵解過程中的重要酶類，催化磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛之間的可逆轉(zhuǎn)化。TIM 是由249個氨基酸組成、分子量約為28 kDa 的糖蛋白，主要以α-螺旋和不規(guī)則折疊為主，天然狀態(tài)下以穩(wěn)定的二聚體形式存在[8]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)鯖魚、克氏原螯蝦、擬穴青蟹等TIM 能夠與血清IgE 結合，因此被認為是一種新型過敏原[32]，并發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹TIM不耐熱、不耐酸堿，耐受胰蛋白酶消化但不耐受胃蛋白酶消化。

2 水產(chǎn)品致敏蛋白的抗原表位

過敏原的致敏性往往取決于它所包含的抗原表位。致敏蛋白的抗原表位通常由5～17 個氨基酸殘基組成，氨基酸殘基種類、數(shù)目及其構型決定了抗原的特異性。對致敏蛋白抗原表位的預測及定位，不但有助于進一步研究不同物種間抗原的交叉反應性，還對低過敏產(chǎn)品的開發(fā)和食品過敏的免疫診斷提供依據(jù)。目前，致敏蛋白抗原表位分析的主要方法有生物信息學預測、重疊肽庫技術、對苯二酚交換質(zhì)量串聯(lián)分析、定點突變基因工程和噬菌體展示技術。

Elsayed 等[33]通過重疊肽庫技術鑒定出鱈魚小清蛋白的胰蛋白酶降解片段殘基33～44、殘基65～74 和殘基88～96 具有免疫活性。Zhang 等[34]對西伯利亞淡水對蝦原肌球蛋白（Exo m 1）的抗原結合表位進行了定位，發(fā)現(xiàn)Exo m1 的氨基酸序列與其它蝦的原肌球蛋白具有高度的相似性，但不完全一致，它們分別是表位43～59、85～105、131～164、187～201和243～280。按與細胞結合類型，表位可分為B 細胞表位和T 細胞表位。按結構類型，表位可分為線性表位和構象表位。一般情況下，線性表位存在于T 細胞表位和部分B 細胞表位，構象表位僅存在于B 細胞表位[8]?；谥丿B肽庫技術，表位21～40 被鑒定為日本鯖小清蛋白Sco J 1 的主要線性表位區(qū)[35]。華?，|等[36]采用生物信息學預測法，對日本沼蝦原肌球蛋白的表位進行預測，認為其可能的B 細胞線性表位有21～34 RADTLEQQNKEANN、37～52 EKTEEEIRTTQKKMQQ、71～77 LEEKEKA、99～107 LERSEERLN、119～125 AADESER、134～140 SLSDEER、158～164 ADRKYDE、177～186 ERAEERAETG、210～223 SEEKANQREEAYKE、262～268 NEKEKYK，可能的T 細胞表位有82～95 EGEVAALNRRIQLL、 105～117 RLNTATTKLAEAS、 165～177 VARKLAMVEADLE、195～208 EELRVVGNNLKSLE、222～235 EQIKTLTNKLKAA。抗原表位是抗原分子中決定其特異性的化學基團，是與人體產(chǎn)生的抗體發(fā)生特異性結合的免疫活性區(qū)。對抗原表位的系統(tǒng)認識是揭示致敏蛋白在水產(chǎn)品致敏反應中作用的關鍵，也是消除食品致敏性的結構基礎。目前，對水產(chǎn)品致敏蛋白抗原表位的研究主要集中在常見的致敏原，對新型致敏原抗原表位的研究較少，關于構象表位的研究也大多局限于通過生物信息學軟件的預測。

3 水產(chǎn)品致敏蛋白的檢測方法

對水產(chǎn)品過敏患者來說，即使是攝入含微量致敏原的水產(chǎn)品，也往往會產(chǎn)生嚴重的過敏反應。為保障過敏患者的健康，已有許多國家強制性要求對食物標簽中的致敏原進行規(guī)范標識[37]。目前，國內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)了多種水產(chǎn)品致敏原檢測技術，雖然這些檢測及量化致敏原的技術各有優(yōu)缺點，但對規(guī)范標注食物致敏原標簽、食物過敏風險評估及風險管理均具有十分重要的意義。因此，對水產(chǎn)品致敏原進行精準、高效的定量檢測顯得尤其重要。根據(jù)檢測目標物的不同，可分為以致敏蛋白為基礎的酶聯(lián)免疫吸附法、質(zhì)譜法、生物傳感器法及以致敏蛋白DNA 為基礎的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附技術

酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是檢測食品致敏原的金標準，也是應用最廣泛的定量分析方法。它具有操作簡便、靈敏度高、標準化及自動化高等特點，適用于一種或多種致敏原的檢測，主要包括競爭ELISA 法和夾心ELISA法。如Cai 等[38]使用單克隆抗體（B2-E1）與銀鯉魚過敏原小清蛋白競爭，該競爭ELISA 法對小清蛋白的檢測限為0.04 mg /kg；Zhang 等[39]采用特異性單克隆抗體CE7B2，建立夾心ELISA 法測定日本對蝦過敏原原肌球蛋白，檢測限達0.09 ng/mL；Yu 等[40]利用夾心ELISA 法對兩種來自不同物種的原肌球蛋白特異性多克隆抗體進行配對，檢測限為 6.8 ng/ mL，可有效檢測可疑食物來源中的原肌球蛋白。目前，市場上已有檢測小清蛋白和甲殼類蛋白的ELISA 試劑盒，其檢出限分別為1 mg /kg 和2 mg /kg，這些試劑盒可以在30 min 內(nèi)實現(xiàn)定性或半定量檢測。ELISA檢測也存在一些缺陷，如加熱、加壓等食品加工處理會影響致敏蛋白抗原表位的結構，從而導致抗體結合位點的轉(zhuǎn)移或減少，此外特異性抗血清、特異性單克隆抗體較難獲得，一定程度上也限制了ELISA 在檢測致敏蛋白中的應用。

3.2 質(zhì)譜法

近年來，質(zhì)譜技術在蛋白質(zhì)組學領域取得了重大的飛躍，包括食品致敏原的鑒定、表征和測定，特別是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS）已被用于食品致敏原的定量分析，其主要流程是從食品中提取的致敏蛋白經(jīng)還原、烷基化、酶解成多肽，然后通過液相色譜分離以及質(zhì)譜鑒定，最后定量分析其蛋白表位構象[41]。Korte 等[42]建立了多反應監(jiān)測的質(zhì)譜分析方法，用于檢測復雜食物基質(zhì)中蝦和龍蝦的致敏蛋白，檢測限可降至0.1%；Stella 等[43]通過液相色譜-高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜從四種致敏原中選擇標記肽，建立了一種能夠同時檢測牛奶、雞蛋、甲殼類動物和大豆致敏蛋白的定量方法；Sun 等[44]開發(fā)了一種用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用多反應監(jiān)測定量食物基質(zhì)中魚類主要致敏原小清蛋白的方法，其中比目魚的β-小清蛋白的檢測限達到0.10 mg/g，這種基于蛋白質(zhì)組學的高精密度檢測方法，對食品中小清蛋白含量的測定提供了技術支持。LC-MS 法具有特異性強、靈敏度高、高通量等優(yōu)點，特別適用于加工過程中對構象蛋白表位不敏感的水產(chǎn)品過敏原的定量。但與免疫分析法和基于核酸檢測的方法相比，LC-MS 法成本更高、耗時更長、技術更復雜。

3.3 生物傳感器技術

生物傳感器是快速檢測水產(chǎn)品致敏原的新型方法之一，它利用固定在芯片表面的傳感器，將致敏蛋白與分子識別元件之間的特異性反應轉(zhuǎn)化為與致敏蛋白濃度成正比的可測量的光、電信號。分子識別元件可以是蛋白、細胞、DNA 等生物大分子。Chinnappan 等[22]開發(fā)的用于檢測蝦主要致敏原原肌球蛋白的適配體生物傳感器，檢測限為2 nmol/L；Wang 等[45]研制了一種基于納米金聚合物手性組裝的貝類原肌球蛋白檢測及定量的生物傳感器，檢測限為21 pg/mL，定量限為70 pg/mL；Zhou 等[46]通過表面等離子體共振傳感器與金紋生物芯片，檢測和定量貝類中的原肌球蛋白，其檢測限和定量限分別為1.0、2.5 mg/mL。生物傳感器檢測法具有微型化、高靈敏度、低成本、自動化程度高等優(yōu)點，但對樣品預處理的要求很高，一定程度上限制了它的廣泛應用。

3.4 實時熒光定量PCR

PCR 技術可對食品中經(jīng)基因修飾的成分進行檢測，即利用已知致敏蛋白的基因序列對致敏原進行檢測。目前水產(chǎn)品致敏蛋白檢測中應用較多的是實時熒光定量PCR，通過實時監(jiān)測目標蛋白特異性核酸片段擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號的積累情況，對目標蛋白進行分析，熒光的產(chǎn)生主要依靠核酸結合染料或熒光探針。Fernandes 等[47]開發(fā)了一種實時PCR 定量方法檢測調(diào)味醬中甲殼類動物的潛在致敏原，該方法在0.0001%～50%的范圍內(nèi)表現(xiàn)出了高性能的定量分析，并通過校準曲線參數(shù)得到了有效的盲混合驗證。Fernandes 等[48]又設計出了兩種實時PCR 用于檢測調(diào)味醬中魚類致敏成分，一種基于EvaGreen染料，一種基于TaqMan 探針，兩種方法都具有較強的靈敏性，能使魚的DNA 檢測限達到0.01 pg，且基于TaqMan 探針比基于EvaGreen 染料的相對靈敏度高，范圍廣。Eischeid 等[49]建立了一種實時PCR分別檢測豬肉餃子、通心粉、沙拉中的蟹類過敏原，該方法利用了群特異性引物和探針對多種蟹類進行了檢測，其檢測范圍在0.1～105 ppm 之間。與傳統(tǒng)的PCR 技術相比，實時熒光定量PCR 具有高靈敏度、檢測快速、特異性強等優(yōu)點，同時可用于復雜食品基質(zhì)中致敏原的檢測。但于其它檢測方法相比，由于PCR 不是對致敏原進行直接檢測，所以檢測結果并不能評價食物真正的致敏性。

總體來說，由于食品成分復雜、多樣，又要克服致敏原檢測預處理繁瑣、樣品中被測物含量低等問題，未來水產(chǎn)品致敏蛋白的檢測將會朝著樣品用量少、分離效率高、分析速度快、經(jīng)濟、高靈敏、環(huán)保的方向發(fā)展，以期實現(xiàn)水產(chǎn)食品中潛在微量致敏原的檢測。

4 水產(chǎn)品致敏蛋白的消減技術

雖然大多數(shù)過敏原及其抗原決定簇在一定程度上可以耐受各種形式的食品加工方法，但許多研究表明，特定的處理和加工仍然會影響水產(chǎn)品致敏蛋白的活性。這些特定的方法包括物理（熱處理、輻照、超高壓）、化學（糖基化修飾）、生物（酶解）等方法，它們主要通過引起蛋白質(zhì)大分子的空間結構和理化性質(zhì)的改變，破壞、掩蓋和修飾蛋白質(zhì)的致敏表位，導致蛋白變性、聚集或凝膠化，從而影響其致敏性。

4.1 物理法

通過物理方法如熱、電、磁和機械能來加工食品，能在一定程度上改變致敏性蛋白質(zhì)的高級結構，從而影響食品的致敏性，該類方法具有作用時間短、毒副作用小等優(yōu)點，常見的方法包括熱處理、輻照、超高壓等。

4.1.1 熱處理 熱處理是食品加工中常見的方式，一般來說，其模式有濕熱（煮沸、高壓蒸汽）和干熱（微波、超聲波）兩種。熱處理可以破壞蛋白質(zhì)的三維結構，降低致敏蛋白與人IgE 的結合活性，從而降低或消除其致敏性。Ozawa 等[50]對蝦仁塊進行121 °C，20 min 煮沸處理，發(fā)現(xiàn)蝦原肌球蛋白免疫活性降低。但值得注意的是，熱處理也可能使致敏蛋白產(chǎn)生新的表位或使掩藏的表位暴露，從而使致敏蛋白的致敏性增加。如Fang 等[51]對牡蠣主要過敏原Cra g1（原肌球蛋白）進行了煮沸和焙烤（180 °C）處理，發(fā)現(xiàn)加熱后的Cra g1 比不加熱的會產(chǎn)生更高的IgE 反應活性，原因可能是加熱導致蛋白聚合物生成和變性。Kamath 等[52]研究了加熱對貝殼原肌球蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)熱處理后 IgE 結合能力增加，致敏性增強。可見，熱處理對致敏原的免疫活性影響不同，這主要與熱處理的時間、溫度、加熱方式、致敏原種類有關。此外，許多致敏原都有很強的耐熱性，熱處理對這些熱穩(wěn)定性強的致敏原的免疫原性影響不顯著，而且長時間的加熱還會對食物品質(zhì)造成不利的影響。

4.1.2 輻照 食品輻照技術是利用電離輻射源60Co或137Cs 產(chǎn)生的g-射線、機械源產(chǎn)生的X 射線或電子束對食品進行電離輻射的過程[53]。輻照對蛋白質(zhì)會產(chǎn)生復雜的作用，主要通過誘導蛋白分子間脫氨、脫羧、氨基酸氧化、斷裂或二硫鍵形成，以及蛋白質(zhì)分子中肽鏈的降解或交聯(lián)來改變蛋白質(zhì)分子的高級結構及其聚集方式[54]，從而影響致敏蛋白的致敏性。Muanghorn 等[55]以60Co為輻照源，對羅氏沼蝦進行處理，發(fā)現(xiàn)在10 kGy 和15 kGy 輻照劑量下，原肌球蛋白條帶密度明顯降低；官愛艷等[56]采用電子束輻照處理中華管鞭蝦蝦仁及提取的原肌球蛋白，發(fā)現(xiàn)輻照處理能引起原肌球蛋白分子中的α-螺旋含量降低，改變原肌球蛋白構象，從而降低蝦仁及原肌球蛋白的免疫原性；Li 等[57]研究發(fā)現(xiàn)電子束輻照能引發(fā)魚類小清蛋白羰基化，降低大菱鲆魚肉的致敏性，且在10 kGy 與人血清的IgE 結合特性下降最明顯。較高的輻照劑量在降低過敏原致敏性的同時也會對食品的品質(zhì)造成一定程度的破壞，也有研究者采用輻照協(xié)同加熱處理法，如牟慧[58]采用蛋白免疫印跡和間接ELISA 法，通過探究原肌球蛋白表位，發(fā)現(xiàn)輻照與加熱協(xié)同作用時，脫敏效果較單獨輻照或加熱處理更明顯，達到了可以利用較低輻照劑量消減食品致敏性的效果。因此，在保持食品品質(zhì)的同時，通過合適的輻照劑量改變致敏蛋白的分子構象，破壞其免疫原性和致敏性，從而降低食品致敏性。

4.1.3 超高壓 超高壓又稱高靜壓，一般介質(zhì)為水或油脂，通過室溫在一定時間內(nèi)對密封在容器中的樣品持續(xù)施加100～1000 MPa 的壓力[59]。作為一種非熱加工技術，超高壓被認為是一種新的脫敏處理方法。Jin 等[60]發(fā)現(xiàn)在200～600 MPa 超高壓的作用下，新鮮魷魚原肌球蛋白的α-螺旋含量降低，600 MPa 時約有53%的α-螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，同時結合體外消化，發(fā)現(xiàn)600 MPa 和400 MPa 組魷魚原肌球蛋白的致敏性比200 MPa 組低，原因在于超高壓導致致敏蛋白化學鍵斷裂，抗原表位被破壞；柳瀾昱[61]用超高壓處理南美白對蝦蝦仁，通過測定蝦仁蛋白溶出量和過敏原消減程度，發(fā)現(xiàn)壓力低于300 MPa時蝦仁致敏性的消減主要與其蛋白溶出相關，而高于300 MPa 時致敏性的消減則與致敏蛋白變性有關?？梢?，超高壓可以通過破壞蛋白質(zhì)的化學鍵，改變蛋白質(zhì)的空間結構，導致致敏蛋白變性或失活，同時還能影響蛋白質(zhì)的溶出，最終達到消減食品致敏性的效果。但由于超高壓設備的限制，利用超高壓消減食品過敏原及其致敏性仍難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應用。

4.2 化學法

通過化學手段影響蛋白質(zhì)分子中的酰胺鍵、氨基、羧基、羥基、巰基等基團，能夠改變蛋白質(zhì)的靜電荷、疏水基團及其空間結構，從而影響致敏蛋白的致敏性，其中糖基化修飾（包括美拉德反應）是常見的消減致敏性的一種化學法。如藺海鑫等[62]發(fā)現(xiàn)當與核糖的糖基化反應達到4 h 后，能夠有效改變菲律賓蛤仔原肌球蛋白的結構，從而降低其免疫活性；Zhao 等[63]研究了美拉德反應對魚主要過敏原小清蛋白結構和免疫特性的影響，采用重組銀鯉的小清蛋白，用葡萄糖在60 °C 下培養(yǎng)72 h，發(fā)現(xiàn)重組銀鯉小清蛋白的IgG和IgE 結合特性均減弱；Song 等[64]研究了美拉德反應對蝦原肌球蛋白構象及與IgE 結合能力的影響，認為丙二醛誘導的原肌球蛋白構象變化可顯著影響原肌球蛋白的致敏性。糖基化消減致敏性的程度主要取決于過敏原和所用還原糖的種類，另外許多致敏蛋白屬于分子量為10～80 kDa 的糖蛋白，其糖基結構在抗原決定簇的形成中起著重要作用[8]，因此通過降低致敏蛋白分子中糖鏈的數(shù)量、改造糖鏈的結構等也是減少糖蛋白免疫原性的一個手段，有關這方面的研究仍需進一步深入。

4.3 生物法

隨著近幾年食品生物技術的發(fā)展，越來越多的生物技術也用于食物致敏蛋白的消減。酶解法是一種應用廣泛的降低水產(chǎn)品致敏性的生物變性方法，尤其對致敏蛋白線性表位的消除有著很大的作用。酶解可以通過改變致敏原表位的三級結構，或通過斷裂酰胺鍵，破壞致敏蛋白的空間結構和構象，從而降低致敏蛋白的免疫活性。酶解通常在中性pH 和40～60°C 條件下進行，相對于酸堿水解，酶解反應較溫和，還可以對作用位點進行定向選擇。如張弛[65]用堿性蛋白酶、胃蛋白酶等7 種酶水解蝦過敏原，結果表明堿性蛋白酶處理對蝦過敏原致敏性的降低最為顯著；Zhang 等[66]通過酸和蛋白酶處理，分析對重組牡蠣原肌球蛋白（Cra g1）構象和IgE 結合能力的影響，也發(fā)現(xiàn)酸和酶結合處理能更有效降低原肌球蛋白的致敏性。雖然有大量研究證明酶解可降低致敏性，但酶處理對食品品質(zhì)影響較大，同時大多會產(chǎn)生苦味肽而不利于食品的風味。因此，選擇合適的酶以及酶解條件，對開發(fā)低致敏性水產(chǎn)品十分重要。

5 總結與展望

隨著水產(chǎn)品消費人群的增加和對過敏性疾病的重視，水產(chǎn)品過敏原的研究越來越深入，但仍存在較多的問題，還需要進一步研究和應用。目前，有關水產(chǎn)品過敏原的致敏性還沒有標準的評價體系，現(xiàn)有技術雖然可應用于評估水產(chǎn)品過敏原的致敏性，但仍有一些劣勢，未來可以正確應用動物模型，結合其他評價方法，有效地檢測和評價水產(chǎn)品的致敏性。對于水產(chǎn)品過敏的免疫發(fā)病機制，從細胞和分子水平上闡明基因和環(huán)境因素如何改變正常的口服耐受過程，從而產(chǎn)生水產(chǎn)品特異性Th2 反應，這方面的研究還需要進一步深入。此外，盡管目前有多種方法用于消減過敏原的致敏性，但在實際應用中仍有一定的局限性，一方面水產(chǎn)品加工對其過敏原的影響具有不確定性，不易測量和控制，消減食品過敏原致敏性仍主要停留在研究階段，實際生產(chǎn)中由于對食品感官、營養(yǎng)及其加工品質(zhì)等的影響較大而限制了化學法及生物法消減食品過敏原的應用；由于超高壓和輻照設備的限制，這些物理法消減食品過敏原及其致敏性仍未實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應用。如何結合多種加工手段達到消除過敏原，同時又能最大限度保留水產(chǎn)品的風味和營養(yǎng)品質(zhì)等問題將是未來全面了解水產(chǎn)品過敏原以及開發(fā)高質(zhì)量低致敏性水產(chǎn)品的熱門研究方向。