丁玉峰，馬艷莉,2,*，李素萍，席曉麗，孫劍鋒，劉亞瓊，牟建樓

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071000；2.南陽理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽 473000）

食用酵素是以動(dòng)物、植物、菌類等為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產(chǎn)品[1]。近年來，由于人們保健意識(shí)加強(qiáng)，越來越多的酵素產(chǎn)品受到消費(fèi)者的歡迎。葡萄（Vitis vinifera），屬葡萄科，落葉藤本植物，是世界栽培面積最大的水果，也是世界上產(chǎn)量?jī)H次于柑橘的第二大水果，遍及亞洲，歐洲和美洲[2]。作為季節(jié)性較強(qiáng)的漿果，葡萄貯藏期短，需進(jìn)行深加工。目前市場(chǎng)上葡萄制品主要有鮮食葡萄、葡萄酒、葡萄汁、葡萄干和葡萄果醋等。因此，開發(fā)新型葡萄酵素有利于豐富葡萄深加工產(chǎn)品類型，延長葡萄產(chǎn)業(yè)鏈。葡萄富含膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、酚酸、類黃酮和花青素等，將葡萄通過微生物發(fā)酵制成葡萄酵素，基質(zhì)中的糖類、維生素和花色苷等營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿踊钚晕镔|(zhì)如有機(jī)酸、酶類和單體酚，不僅保留了天然果香還增加了營養(yǎng)密度[3?4]。

酵素中微生物由于酵素原料的不同，在發(fā)酵過程中微生物類型也不相同，果蔬酵素的微生物主要是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌[5?7]。乳酸菌，作為益生菌被廣泛的研究，對(duì)維持人體腸道菌群平衡、提高免疫力具有重要作用。除了益生功能，乳酸菌在酵素發(fā)酵過程中主要包括同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵，同型乳酸發(fā)酵通過分解糖類產(chǎn)生乳酸，而異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)物除了乳酸之外還有乙醇、乙酸、琥珀酸和二氧化碳等，通過發(fā)酵，乳酸菌產(chǎn)生大量乳酸，使得發(fā)酵液pH 降低，較高的酸度能抑制微生物的增長，保護(hù)發(fā)酵液不腐敗變質(zhì)，延長保質(zhì)期。此外，乳酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味更加柔和、不酸澀，且也產(chǎn)生的一些醇、醛、酮等物質(zhì)，使得發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味更加濃郁[8?9]。

目前，酵素在日本和臺(tái)灣地區(qū)研究較多，我國大陸地區(qū)處于初始發(fā)展階段，相關(guān)研發(fā)企業(yè)還比較少，市場(chǎng)上的酵素產(chǎn)品大多采用自然發(fā)酵，但該方法耗時(shí)長，微生物群落不穩(wěn)定，發(fā)酵過程不易控制，易污染雜菌，其所導(dǎo)致的產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[10?11]。因此本文以葡萄為原料，通過跟蹤監(jiān)測(cè)不同的乳酸菌對(duì)葡萄酵素發(fā)酵過程中總糖、總酸、pH、可溶性固形物、超氧化物歧化酶（SOD）活力、β-葡萄糖苷酶活力和有機(jī)酸的變化情況來研究乳酸菌對(duì)葡萄酵素發(fā)酵的影響，旨在篩選出適合葡萄酵素發(fā)酵的乳酸菌，以期為葡萄酵素的開發(fā)提供相關(guān)理論依據(jù)，這對(duì)葡萄的深加工具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏黑葡萄（Summer Black） 購于河南省南陽市某超市；植物乳桿菌ATCC 14917（Lactobacillus plantarumATCC 14917） 、 植 物 乳 桿 菌 ACCC 11095（Lactobacillus plantarumACCC 11095）、植物乳桿菌GDMCC 1.380（Lactobacillus plantarumGDMCC 1.380）、干酪乳桿菌ATCC 334（Lactobacillus caseiATCC 334）、類干酪乳桿菌CICC 20109（Lactobacillus paracasei）、短乳桿菌GDMCC 1.288（Lactobacillus brerisGDMCC 1.288） 北京微生物保藏中心；果膠酶（酶活力500 U/mg） 諾維信有限公司；草酸、酒石酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸 色譜純，美國Sigma 公司；磷酸 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對(duì)硝基苯酚、鄰苯三酚、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 分析純，麥克林生化科技有限公司；乳酸菌通用培養(yǎng)基（MRS）、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

Neofuge 15R 高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器有限公司；SPX 生化培養(yǎng)箱 寧波東南儀器有限公司；PHS-3C 精密酸度計(jì) 杭州齊威儀器有限公司；UV752N 紫外可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；QL-861 渦旋機(jī) 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；1260 安捷倫高效液相色譜（配備有四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD 檢測(cè)器） 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄酵素的制備 取20 μL 保藏在甘油管的乳酸菌菌液于MRS 固體平板上，培養(yǎng)2～3 d，待長出單菌落后，挑取單菌落于已滅菌的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，即得到菌種活化液[12]。

挑選完好無破損的葡萄洗凈、晾干，并用攪拌機(jī)打漿。用鹽酸調(diào)pH 為3.6，加入75 mg/mL 的果膠酶酶解40 min，之后進(jìn)行巴氏滅菌（60 ℃滅菌30 min）。待滅菌后的原料冷卻，分別接3%的培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的乳酸菌于葡萄基質(zhì)中，30 ℃下發(fā)酵5 d[13]。每隔1 d 取樣，對(duì)發(fā)酵液的還原糖、可溶性固形物、pH、可滴定酸、β-葡萄糖苷酶、SOD 酶、有機(jī)酸、活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 乳酸菌生長曲線的測(cè)定 將活化好的6 株乳酸菌菌的菌液（菌液濃度>106cfu/mL）以3%的接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h取樣，測(cè)定OD600nm值，以不加菌的MRS 培養(yǎng)液為空白對(duì)照。

1.2.3 pH 對(duì)乳酸菌生長的影響 根據(jù)食用酵素生化指標(biāo)規(guī)定，食用酵素pH 不應(yīng)高于4.0[14]，因此需要考察pH 對(duì)不同乳酸菌生長的影響。活化后的菌液以（菌液濃度>106CFU/mL） 1%的接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基（分別用鹽酸調(diào)配pH 至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）中，混合均勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測(cè)定OD600nm，以不加菌的各pH 的MRS 培養(yǎng)液為空白對(duì)照。

1.2.4 不同乳酸菌發(fā)酵性能測(cè)定 還原糖采用3, 5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定[15]，即取稀釋一定倍數(shù)的樣品1 mL 與1.5 mL 的DNS 混合，沸水浴顯色5 min，待冷卻后將體積定容到10 mL，550 nm 處測(cè)定吸光值，以1 mL 蒸餾水做空白對(duì)照?？扇苄怨绦挝锏臏y(cè)定參照NY/T 2637-2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測(cè)定》，結(jié)果以Brix°表示。使用pH 計(jì)測(cè)定葡萄酵素發(fā)酵過程中樣品的pH，可滴定酸含量的測(cè)定參照GB/T 12456-2008，結(jié)果以乳酸質(zhì)量濃度計(jì)。

1.2.5 SOD 和β-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定 SOD 活力按照鄰苯三酚自氧化法GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定》操作；β-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)中的方法[16]。

1.2.6 有機(jī)酸含量的測(cè)定 取2.5 mL 的樣品于50 mL的容量瓶中，加入1 mL10.6%的亞鐵氰化鉀溶液和1 mL 30%的硫酸鋅溶液，用去離子水定容，靜置30 min，之后取上清液離心，離心后的液體經(jīng)0.45 μm膜和C18柱過濾，上HPLC 分析。

檢測(cè)條件：色譜柱Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.02 mol/L 磷酸二氫鈉，用磷酸調(diào)pH 至2.1；流速：0.9 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：210 nm；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器[17]。

1.2.7 活菌數(shù)的測(cè)定 為了考察不同乳酸菌在葡萄基質(zhì)中的生長情況，對(duì)乳酸菌在基質(zhì)中發(fā)酵5 d 后的活菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定按照平板計(jì)數(shù)法GB 4789.35-2016 操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin軟件進(jìn)行圖形繪制，利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（Duncan’s test），P<0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌的生長曲線

采用比濁法對(duì)6 株不同的乳酸菌的生長進(jìn)行了測(cè)定并繪制生長曲線，確定菌株的最佳接種時(shí)間，生長曲線如圖1 所示。

由 圖1 可 知GDMCC 1.288 和ATCC 334 在6 h 左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，菌株生長較為平緩，且都在20 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長穩(wěn)定期。ATCC 14917、GDMCC 1.380、ACCC 11095 和CICC 20109 在4 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，隨后菌數(shù)呈指數(shù)上升。GDMCC 1.380、ATCC 14917 和ACCC 11095 在22 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長穩(wěn)定期，而CICC 20109 在18 h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長穩(wěn)定期。

圖1 不同乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of different strains of lactic acid bacteria

2.2 pH 對(duì)乳酸菌生長的影響

通過測(cè)定6 株乳酸菌在不同pH 條件下的OD600nm，考察乳酸菌在不同pH 條件下的生長情況，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 pH 對(duì)乳酸菌生長的影響Fig.2 Effect of pH value on the growth of lactic acid bacteria

由圖2 可知，pH 越低，6 種菌株的生長情況越差，不同菌株在同一pH 的條件下生長情況存在顯著差異（P<0.05），且低pH（3.0、3.5、4.0）顯著抑制了菌體生長（P<0.05），GDMCC 1.288 的抑制作用尤為明顯。當(dāng)pH 為3 時(shí)，ATCC 14917 的生長情況相對(duì)較好，OD600nm最大，為0.172。隨著pH 的增大，不同菌株的OD600nm有不同程度的增加，ACCC 11095的增長趨勢(shì)最大。CICC 20109 和ATCC 14917 在不同pH 條件下變化趨勢(shì)基本一致，ATCC 334 和GDMCC 1.380 的生長情況也基本相似。因此6 株乳酸菌中耐酸性較好的是ACCC 11095，其次為CICC 20109 和ATCC 14917，然后是ATCC 334 和GDMCC 1.380，最后是GDMCC 1.288。

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵葡萄酵素理化性質(zhì)變化

2.3.1 還原糖動(dòng)態(tài)變化 通過測(cè)定6 株乳酸菌發(fā)酵過程中的還原糖含量，考察不同菌株的糖代謝能力，如圖3 所示。

圖3 不同菌株發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.3 Changes of reducing sugar content of different strains during fermentation

由圖3 可知，6 株乳酸菌發(fā)酵過程中還原糖的含量呈逐漸下降趨勢(shì)，表明6 株菌均有代謝糖的能力。初始葡萄汁中的還原糖含量為32.06 g/L，發(fā)酵第1 d，不同菌株的發(fā)酵液還原糖含量降低了55%～68%，存在顯著差異（P<0.05），發(fā)酵第2 d，GDMCC 1.288 的殘?zhí)橇口呌?，ACCC 11095 殘?zhí)橇繛?3.32 g/L，其余菌株殘?zhí)橇吭?.11～3.58 g/L 之間，ACCC 11095 顯著高于其它菌株（P<0.05），發(fā)酵3 d 后除ACCC 11095 之外，其余菌株還原糖含量趨于0。綜上所述，GDMCC 1.288 降解糖的能力最強(qiáng)，CICC 20109、ATCC 334、ATCC 14917 和GDMCC 1.380 降解糖的能力類似，其次是ACCC 11095。

2.3.2 可溶性固形物動(dòng)態(tài)變化 由圖4 可知，不同菌株發(fā)酵過程中的可溶性固形物呈逐漸下降的趨勢(shì)，最后趨于5 左右，這與陳華麗等[18]的研究結(jié)果類似。葡萄基質(zhì)中初始可溶性固形物為15.43 Brix°，發(fā)酵1 d 后，ACCC 11095 降低了4%，其余菌株降低了15%～20%，發(fā)酵第2 d，ACCC 11095 降低了26.6%，其余菌株下降了34%～59%，發(fā)酵第3 d，ACCC 11095 發(fā)酵液的可溶性固形物為6.23 Brix°，其余菌株下降至5 Brix°左右，隨后保持穩(wěn)定，不同菌株發(fā)酵過程中可溶性固形物存在顯著差異。

圖4 不同菌株發(fā)酵過程中可溶性固形物的變化Fig.4 Changes of Brix°of different strains during fermentation

2.3.3 pH 動(dòng)態(tài)變化 pH 在一定程度上可以反映微生物是否正常生長。不同菌株發(fā)酵過程中pH 的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)如圖5 所示，發(fā)酵過程中pH 呈先降低再升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，不同菌株發(fā)酵過程中pH 差異顯著（P<0.05）。由圖5 可知，初始pH3.6，發(fā)酵第1 d，pH 迅速下降，ATCC 14917 發(fā)酵液顯著降低（P<0.05），為3.37，發(fā)酵第2 d，所有菌株發(fā)酵液的pH 持續(xù)降低，ATCC 14917 的發(fā)酵液達(dá)到了最低值，為3.28，其次是GDMCC 1.380，發(fā)酵第3～4 d，不同菌株發(fā)酵液的pH 呈上升趨勢(shì)，這可能是由于微生物的作用，發(fā)酵基質(zhì)發(fā)生了物質(zhì)轉(zhuǎn)變，如酚類物質(zhì)[19]，發(fā)酵第4～5 d，不同菌株發(fā)酵液pH 逐漸趨于平穩(wěn)。ATCC 14917、ACCC 11095 和GDMCC 1.380 發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH 為3.33～3.35，而CICC 20109、ATCC 334 和GDMCC 1.288 發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH 為3.51～3.58，表明前者產(chǎn)酸能力比后者更強(qiáng)。

圖5 不同菌株發(fā)酵過程中pH 的變化Fig.5 Changes of pH value of different strains during fermentation

2.3.4 總酸含量的動(dòng)態(tài)變化 總酸在一定程度上可以反映微生物生長代謝情況，由圖6 可知，總酸含量為11.07～12.74 g/L，與pH 變化趨勢(shì)相反，不同菌株發(fā)酵過程中總酸含量呈先升高后降低的趨勢(shì)。發(fā)酵第1 d，不同菌株發(fā)酵液總酸含量由5.69 g/L 上升到5.78～8.40 g/L，這是由于基質(zhì)中碳源充足，乳酸菌迅速消耗碳源生成乳酸。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌經(jīng)歷對(duì)數(shù)平穩(wěn)期到衰亡期，基質(zhì)中的總酸含量緩慢上升，發(fā)酵第2～4 d，總酸含量略有下降，到發(fā)酵后期，乳酸菌逐漸衰亡，酸度趨于穩(wěn)定。由圖6 可知，不同菌株產(chǎn)酸能力存在顯著差異（P<0.05），其中ACCC 11095產(chǎn)酸能力顯著高于其它菌株（P<0.05）。

圖6 不同菌株發(fā)酵過程中總酸含量變化Fig.6 Changes of total acidity in different strains during fermentation

2.4 不同乳酸菌發(fā)酵葡萄酵素酶活力變化

2.4.1 SOD 活力的動(dòng)態(tài)變化 由于食用酵素是一個(gè)多元復(fù)雜發(fā)酵體系，原料經(jīng)過微生物發(fā)酵后，獲得一些代謝產(chǎn)物，如功能性酶類物質(zhì)，目前研究最多的主要是SOD，它是一種以超氧陰離子為底物的金屬酶，是體內(nèi)O2-的天然清除劑[20?21]。因此對(duì)葡萄酵素發(fā)酵過程中的SOD 活力進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，考察乳酸菌是否對(duì)SOD 活力有影響，不同菌株發(fā)酵過程中SOD 活力的變化如表1 所示。

由表1 可知，CICC 20109、ATCC 334 和ACCC 11095 的發(fā)酵液在發(fā)酵過程中SOD 活力呈先波動(dòng)上升后下降的趨勢(shì)，這與之前的報(bào)道趨勢(shì)相近[22?23]。而ATCC14917、GDMCC 1.380 和GDMCC 1.288這三個(gè)發(fā)酵組在發(fā)酵過程中SOD 活力呈先上升后下降最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。不同菌株發(fā)酵過程中的SOD 活力存在顯著差異（P<0.05）。未接種前，葡萄汁中的SOD 活力為9.68 U/mL，發(fā)酵第1 d，CDMCC 1.380 的發(fā)酵液SOD 活力最先達(dá)到了最大值為58.33 U/mL，發(fā)酵第2 d，ATCC 14917 和GDMCC 1.288 的發(fā)酵液SOD 活力達(dá)到了最大值，分別為46.94 和17.79 U/mL。發(fā)酵第3 d，ACCC 11095 和ATCC 334 的發(fā)酵液SOD 活力達(dá)到了最大值，分別為37.50 和19.17 U/mL，發(fā)酵第4 d，接種CICC 20109 的酵素SOD 活力達(dá)到了最大值，為37.50 U/mL，由于菌株產(chǎn)酸能力不同，因此SOD 活力達(dá)到最高點(diǎn)所需時(shí)間不同，且后期乳酸的積累，達(dá)不到SOD 的最適pH，導(dǎo)致酶活力有不同程度的降低。乳酸菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)，GDMCC 1.380 的發(fā)酵液酶活最高，為37.50 U/mL，其次是ATCC 14917，為30.00 U/mL。

表1 不同菌株發(fā)酵過程中SOD 活力的變化（U/mL）Table 1 Changes of SOD activity of different strains during fermentation(U/mL)

2.4.2β-葡萄糖苷酶活力的動(dòng)態(tài)變化β-葡萄糖苷酶能催化烷基糖苷、芳基糖苷、纖維素和纖維低聚糖等結(jié)合于糖鏈末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵水解，使其釋放出具有香氣的游離糖苷配體[24?25]，因此β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄酵素的香氣形成有重要的作用。Marta 等[26]報(bào)道了乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬可以通過β-葡萄糖苷酶水解蔬菜中的β-糖苷，這種酶也被認(rèn)為是酚類化合物結(jié)構(gòu)中糖苷鍵斷裂的第一步，而葡萄中含有豐富的酚類物質(zhì)，因此有必要考察不同乳酸菌對(duì)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生的影響。

由表2 可知，除GDMCC 1.288 外，其它菌株的發(fā)酵液在發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，而接種GDMCC 1.288 的發(fā)酵液β-葡萄糖苷酶僅在最后1 d 被檢測(cè)到，為10.52 μU/mL。不同菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶在10.52～501.29 μU/mL之間，曾子毅等人比較了5 株植物乳桿菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的特性，結(jié)果表明植物乳桿菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶在4.630～14.168 U/g[27]。這可能是由于菌株及生長基質(zhì)的差異。在發(fā)酵第2 d，ATCC 14917，β-葡萄糖苷酶活力顯著高于其它菌株（P<0.05），為501.29 μU/mL，發(fā)酵結(jié)束后，ACCC 11095 發(fā)酵液的β-葡萄糖苷酶活力最高，為400.70 μU/mL。

表2 不同菌株發(fā)酵過程中β-葡萄糖苷酶活力的變化（μU/mL）Table 2 Changes of β-glucosidase activity of different strains during fermentation (μU/mL)

2.5 不同乳酸菌發(fā)酵葡萄酵素有機(jī)酸含量變化

益生菌可以通過發(fā)酵分解糖，形成有機(jī)酸，這些有機(jī)酸是許多微生物屬在食品發(fā)酵過程中大量繁殖的重要二級(jí)碳源[28]。不同菌株發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化如表3 所示。乳酸的產(chǎn)生是發(fā)酵是否成功的標(biāo)志。不同菌株發(fā)酵后乳酸含量都有不同程度的增加，發(fā)酵后乳酸的含量在0.38～11.72 g/L,這與之前的報(bào)道相一致[29]。其中ACCC 11095 發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸含量最多，是其它菌株的1.2～30 倍，其次是ATCC 14917、 GDMCC 1.380 和 CICC 20109， GDMCC 1.288 發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸含量最少。乳酸和低酸堿度會(huì)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，改變膜電位和主動(dòng)運(yùn)輸，從而導(dǎo)致能量消耗和細(xì)胞死亡，因此產(chǎn)乳酸能力較高的乳酸菌對(duì)酵素的保存可能是有利的[30]。

表3 不同菌株發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化Table 3 Changes of organic acid of different strains during fermentation

蘋果酸是乳酸菌發(fā)酵過程中重要的有機(jī)酸，因?yàn)樘O果酸也可被代謝為乳酸。發(fā)酵結(jié)束后，與未發(fā)酵的基質(zhì)相比，蘋果酸含量下降了5%～100%，尤其是ATCC 14917、ACCC 11095 和ATCC 334 完全轉(zhuǎn)化了蘋果酸，Markkinen 等[31]用乳酸菌發(fā)酵火龍果、沙棘中也有類似的結(jié)果。這主要是在蘋果酸脫羧酶的作用下，乳酸菌能夠依賴NAD+和Mn2+通過脫羧作用代謝蘋果酸[32]。

檸檬酸是葡萄漿果中重要的有機(jī)酸，第0 d 時(shí)，檸檬酸含量為0.55 g/L，不同菌株發(fā)酵過程中檸檬酸波動(dòng)變化。除ATCC 334 外，發(fā)酵第2 d 檸檬酸含量突然增多，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，檸檬酸含量有不同程度的下降，但是發(fā)酵結(jié)束后檸檬酸累積，含量為1.4～2.4 g/L。檸檬酸和蘋果酸都可以用作第二碳源被乳酸菌利用，通常，檸檬酸的代謝與糖或其它能源的消耗相結(jié)合，在本研究中使用的乳酸菌似乎更傾向于使用蘋果酸，焦媛媛等[33]用干酪乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵梨汁中也有類似的結(jié)果。

酒石酸是葡萄中的特征酸，未接種時(shí)，酒石酸含量為2.56 g/L，Xu 等[28]用益生菌發(fā)酵果蔬汁初始酒石酸濃度為3.09 g/L，這主要是由于原料的差異。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，不同菌株的酒石酸含量略有降低，但是發(fā)酵結(jié)束時(shí)酒石酸含量與初始含量相比，沒有顯著的降低，含量為1.89～3.82 g/L。只有兩種乳酸桿菌（植物乳桿菌和短乳桿菌）可將酒石酸代謝為乳酸、乙酸、琥珀酸和二氧化碳[34]。然而在本研究中，發(fā)酵結(jié)束后，酒石酸沒有被代謝。乙酸在所有樣品中都未檢測(cè)到，表明這幾株乳酸菌均進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵，減少乙酸的產(chǎn)生對(duì)最終酵素產(chǎn)品的風(fēng)味也有重要的作用。

2.6 不同菌株發(fā)酵葡萄酵素前后活菌數(shù)的變化

酵素發(fā)酵到后期pH 較低，而乳酸菌達(dá)到一定的數(shù)量級(jí)才可發(fā)揮益生功能，因此需要考察接種發(fā)酵后乳酸菌的活菌數(shù)。經(jīng)過5 d 的發(fā)酵后，不同乳酸菌的活菌數(shù)如圖7 所示。

圖7 不同菌株發(fā)酵前后活菌數(shù)的變化Fig.7 Changes of viable count of different strains before and after fermentation

由圖7 可知，接種發(fā)酵后不同菌株的生長情況存在顯著差異（P<0.05）。ACCC 11095 和GDMCC 1.380 在發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)增加，且二者沒有顯著差異（P<0.05），分別為（8.42±0.11）、（8.51±0.01）lg cfu/mL，表明這兩株菌能很好地適應(yīng)發(fā)酵基質(zhì)。表明這兩株菌對(duì)外界的應(yīng)激影響小于其它菌株。ATCC 14917、CICC 20109 和ATCC 334 在接種發(fā)酵后，活菌數(shù)分別降低了1、1 lg cfu/mL 和0.66 lg cfu/mL，這可能歸因于低pH 和酚類物質(zhì)的影響[35]。而GDMCC 1.288 在發(fā)酵前后總菌數(shù)基本一致。

3 結(jié)論

通過比較6 株乳酸菌發(fā)酵葡萄果漿的發(fā)酵特性、代謝產(chǎn)物及生長情況后得出，植物乳桿菌ACCC 11095 能很好地適應(yīng)發(fā)酵基質(zhì)，耐酸能力強(qiáng)，接種發(fā)酵啟動(dòng)速度快，發(fā)酵1 d 后，還原糖和可溶性固形物迅速降低，并于第5 d 葡萄糖消耗完畢；發(fā)酵結(jié)束后細(xì)胞總數(shù)上升，能夠產(chǎn)生豐富的SOD 和β-葡萄糖苷酶；產(chǎn)酸能力強(qiáng)，能夠累積大量的乳酸和檸檬酸，完全消耗蘋果酸，不產(chǎn)生乙酸，表明該菌株具有提升葡萄酵素的功能及改善其風(fēng)味潛力；綜上，確定植物乳桿菌ACCC 11095 為葡萄酵素發(fā)酵的優(yōu)選菌株，這為葡萄酵素的制備提供了理論基礎(chǔ)，對(duì)葡萄的深加工有重要意義。