呂鳳嬌，郭 悅，徐 露，施 雯，魏雨洪，孫麗丹，謝曉蘭

（泉州師范學(xué)院化工與材料學(xué)院，福建泉州 362000）

碳酸鈣是動(dòng)物貝殼、甲殼、蛋殼、牙齒以及骨頭等生物體硬組織的主要成分，在生物體內(nèi)由蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子調(diào)控下礦化形成[1?4]。碳酸鈣主要有方解石、文石、球霰石等3 種晶型，不同晶型具有不同形狀、性質(zhì)和功能[5?6]。方解石和文石是單晶體，具有熱力學(xué)穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)密實(shí)的特性，在自然界廣泛存在；球霰石是多晶體，一般是由納米級(jí)球形顆粒聚集而成的結(jié)構(gòu)松軟的多孔微球，具有密度小、比表面積大、溶解性和分散性好、良好生物安全性及可吸收利用性，被廣泛用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)領(lǐng)域[7?9]。如利用球霰石微球具有促進(jìn)骨基質(zhì)形成的特性[10]，在增加骨密度的保健食品中，碳酸鈣成為使用率最高的補(bǔ)鈣配方主成分[11]，同時(shí)也被用于人工骨和人造牙齒的制備[12]；利用其孔隙率高的特性，用作藥物、生物標(biāo)記物、生物傳感器等生物醫(yī)藥載體[13?15]。

然而球霰石熱力學(xué)不穩(wěn)定，易轉(zhuǎn)化成文石或方解石，自然界中存量稀缺，故如何合成穩(wěn)定的球霰石碳酸鈣越來越受關(guān)注[7,9]。目前球霰石碳酸鈣的合成方法主要采用碳化法和復(fù)分解法，碳化法是直接往Ca2+溶液中通入CO2反應(yīng)生成碳酸鈣，產(chǎn)品純度較高，但容易受CO2溶解速率影響導(dǎo)致球霰石產(chǎn)率較低；復(fù)分解法是利用可溶性鈣鹽和碳酸鹽混合反應(yīng)制備碳酸鈣，反應(yīng)快產(chǎn)率高，但容易引入雜質(zhì)；且非仿生體系下，兩種方法合成的產(chǎn)品穩(wěn)定性均較差，易轉(zhuǎn)化成文石與方解石導(dǎo)致產(chǎn)品純度不高[7,9]。為了提高球霰石穩(wěn)定性，近年來在碳化法和復(fù)分解法合成體系里添加糖、蛋白質(zhì)等有機(jī)分子做為晶型調(diào)控劑。仿生合成穩(wěn)定球霰石的研究報(bào)道不少[16?24]，但研究內(nèi)容基本側(cè)重于添加劑對(duì)晶型的調(diào)控，而關(guān)于添加劑對(duì)球霰石產(chǎn)率和純度的影響鮮少研究。

幾丁質(zhì)酶是一種糖苷鍵水解酶，廣泛分布在動(dòng)物、植物以及微生物等各種生物體內(nèi)，具有消化幾丁質(zhì)食物、調(diào)控形態(tài)發(fā)育、抗菌防御等功能，在食品、醫(yī)療、環(huán)保等方面具有廣泛應(yīng)用[25?26]。蝦蟹、昆蟲等甲殼動(dòng)物的幾丁質(zhì)酶主要分布在胃腸等內(nèi)臟和殼膜等組織部位，與圍食膜蛻換和周期性蛻殼生長發(fā)育密切相關(guān)[27?31]。韓曉梅等[2]報(bào)道蝦蟹殼約含15%～25%的甲殼素和50%礦物質(zhì)等化合物，其中礦物質(zhì)主要是碳酸鈣，蝦蟹殼中碳酸鈣生物合成應(yīng)該與殼膜幾丁質(zhì)酶的調(diào)控具有密切關(guān)系，但有關(guān)幾丁質(zhì)酶對(duì)碳酸鈣仿生合成調(diào)控的研究未見報(bào)道。本文優(yōu)化了鈣離子碳化合成碳酸鈣的工藝條件，并在優(yōu)化工藝條件下考察了幾丁質(zhì)酶對(duì)鈣離子碳化合成碳酸鈣的調(diào)控，通過掃描電鏡（SEM）、紅外光譜（IR）等表征分析了產(chǎn)品組成與形貌特征，研究內(nèi)容對(duì)高產(chǎn)率高純度的球霰石仿生合成和食藥級(jí)碳酸鈣的制備具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

幾丁質(zhì)酶 實(shí)驗(yàn)室自制，以凡納濱對(duì)蝦內(nèi)臟為材料，經(jīng)pH 7.5 Tris-HCl 緩沖液抽提、硫酸銨分級(jí)沉淀、透析、Sephadex G-100 和DEAE-32 柱層析制備得電泳純制劑[26]，比活力為14.15 U/mg，備用；99.95% CO2氣體 泉州市豐澤區(qū)東流焊接材料經(jīng)營部；無水氯化鈣（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（分析純）、鈣羧酸指示劑（分析純） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氨水（分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；其它試劑 均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑分析純產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水 為去離子水。

DGG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；JY3002電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；AR124CN 分析天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；FE28 pH 計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；NICOLET iS 10 紅外光譜儀 Thermo Fisher SCIENTIFIC；ZEISS MERLIN Compact 掃描電鏡 德國Zeiss 公司；STA 409 PC 熱重分析儀 NETZSCH。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 碳酸鈣碳化制備工藝 用氨水調(diào)節(jié)CaCl2溶液至合適pH，再加入適量幾丁質(zhì)酶（按不同酶鈣質(zhì)量比或不加），混勻后，在一定溫度下通入CO2，使鈣離子碳化析出晶體，抽濾、洗滌后烘干得碳酸鈣產(chǎn)品。

式中：cs，EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；V2，滴定消耗的EDTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V1，樣液體積，mL。

碳化前后溶液體積變化忽略不計(jì)，鈣離子碳化率計(jì)算公式如下：

1.2.3 碳化工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 對(duì)幾丁質(zhì)酶添加量（按不同酶鈣質(zhì)量比添加）、溫度、CaCl2濃度、pH、碳化時(shí)間等5 個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)3 次，分別考察各因素對(duì)鈣離子碳化率的影響，確定較優(yōu)工藝條件。

1.2.3.1 幾丁質(zhì)酶對(duì)鈣離子碳化率的影響 按0:1、0.001:1、0.002:1、0.004:1、0.01:1 的酶鈣質(zhì)量比，分別往30 mL pH 12.0 的1.00 mol/L 的CaCl2溶液中加入不同量的幾丁質(zhì)酶，攪拌混勻后，20 ℃下，按1 L/min 氣流速度通入CO2碳化5 min 后，過濾收集樣品，測定分析計(jì)算碳化率，考察幾丁質(zhì)酶添加對(duì)鈣離子碳化率的影響。

1.2.3.2 溫度對(duì)鈣離子碳化率的影響 分別在0、10、20、30、40、50、60 ℃等不同溫度下，按1 L/min氣流速度，往30 mL pH12.0 的1.00 mol/L 的CaCl2溶液，通入CO2碳化 5 min 后，過濾收集濾液和CaCO3產(chǎn)物，分析濾液殘余鈣離子濃度，計(jì)算碳化率，考察溫度對(duì)鈣離子碳化率影響，確定較佳碳化溫度。

1.2.3.3 CaCl2濃度對(duì)鈣離子碳化率的影響 20 ℃下，按1 L/min 氣流速度，分別往30 mL pH12.0 的0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mol/L 等不同濃度的CaCl2溶液，通入CO2碳化5 min 后，過濾收集樣品，測定分析計(jì)算碳化率，考察CaCl2濃度對(duì)鈣離子碳化率影響，確定較佳CaCl2濃度。

1.2.3.4 pH 對(duì)鈣離子碳化率的影響 20 ℃下，按1 L/min氣流速度，分別往30 mL 用氨水調(diào)節(jié)至pH 10.5、11.0、11.5、12.0、12.5 等不同pH 的1.00 mol/L 的CaCl2溶液，通入CO2碳化5 min 后，過濾收集樣品，測定分析計(jì)算碳化率，考察pH 對(duì)鈣離子碳化率影響，確定較佳pH。

1.2.3.5 碳化時(shí)間對(duì)鈣離子碳化率的影響 20 ℃下，按1 L/min 氣流速度，往30 mL pH 12.0 的1.00 mol/L的CaCl2溶液，分別通入CO2碳化1、2、3、5、7、9 min 后，過濾收集樣品，測定分析計(jì)算碳化率，考察碳化時(shí)間對(duì)鈣離子碳化率影響，確定較佳碳化時(shí)間。

1.2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化碳化工藝條件 為進(jìn)一步優(yōu)化碳化工藝條件，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取A 碳化溫度（℃）、B 碳化時(shí)間（min）、CpH、DCaCl2濃度（mol/L）等4 個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，以鈣離子碳化率為指標(biāo)，按L9（34）正交表制定正交方案并實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 幾丁質(zhì)酶對(duì)碳酸鈣晶型調(diào)控的研究 在優(yōu)化的碳化工藝條件下，分別按0:1、0.002:1、0.004:1、0.01:1 酶鈣質(zhì)量比往30 mL 的碳化體系中加入幾丁質(zhì)酶，充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅? L/min 氣體流速持續(xù)通入CO2碳化，碳化結(jié)束后過濾收集濾液和CaCO3產(chǎn)物，分析濾液殘余鈣離子濃度，計(jì)算碳化率，洗滌收集CaCO3固體，并置于105 ℃下干燥至恒重，稱重并取樣分析產(chǎn)品幾丁質(zhì)酶含量及表征產(chǎn)品形貌特征，與同等條件下不加幾丁質(zhì)酶碳化制備的CaCO3形貌比較，考察幾丁質(zhì)酶對(duì)碳酸鈣晶型的調(diào)控。

1.2.6 碳酸鈣產(chǎn)品表征

1.2.6.1 掃描電鏡形貌分析 用直接分散法處理樣品：先把裁剪好的尺寸適中的導(dǎo)電膠粘在銅片上，接著將烘干的待測樣品借外物直接散落附著于導(dǎo)電膠。進(jìn)樣，觀察各樣品在放大1000～20000 倍下的形貌，晶型及粒徑大小。

1.2.6.2 紅外光譜定性分析 按50:1～100:1 的質(zhì)量比取適量KBr 粉末和少量碳酸鈣樣品于瑪瑙研缽中，研磨后壓片，以KBr 空白片劑為參照，掃描4000～400 cm?1之間的紅外光譜，表征分析產(chǎn)物組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均做3 個(gè)平行，用Excel 2007、SPSS 18.0、Grapher 8.0 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素方差分析（ANOVA）按P<0.05 分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 幾丁質(zhì)酶對(duì)鈣離子碳化率的影響 蛋白質(zhì)類調(diào)控劑的側(cè)鏈一般都含有—COOH 等可解離基團(tuán)，會(huì)與鈣離子產(chǎn)生靜電與配位作用，影響碳化反應(yīng)。由圖 1 可見，按不同酶鈣質(zhì)量比分別往相同的碳化體系中加入不同量幾丁質(zhì)酶后，鈣離子碳化率基本在98.31%～98.54%間波動(dòng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P=0.775>0.05，說明幾丁質(zhì)酶添加對(duì)鈣離子的碳化率不具有顯著性影響。

圖1 幾丁質(zhì)酶添加量對(duì)鈣離子碳化率的影響Fig.1 Effect of chitinase addition on the rate of carbonation of calcium ion

2.1.2 溫度對(duì)鈣離子碳化率的影響 溫度會(huì)影響化學(xué)反應(yīng)速度和化學(xué)反應(yīng)平衡，溫度升高可以提升體系中離子運(yùn)動(dòng)速率促進(jìn)離子之間碰撞結(jié)合的機(jī)會(huì)，有利碳化反應(yīng)；但溫度升高也會(huì)降低CO2的溶解度，導(dǎo)致體系中CO32-離子濃度下降，不利鈣離子的碳化反應(yīng)。由圖2 可見，在固定碳化體系下，溫度低于30 ℃時(shí)，鈣離子碳化率隨著溫度升高而輕微上升；溫度高于30 ℃時(shí)，鈣離子碳化率隨溫度升高而出現(xiàn)下降趨勢；整體變化趨勢顯示，低溫體系下的鈣離子溶液碳化率優(yōu)于高溫體系；說明隨著溫度升高，CO2的溶解度對(duì)碳化率影響漸趨主導(dǎo)，在30 ℃下，具有較好的碳化效果，鈣離子碳化率達(dá)97.89%；單因素方差分析P=0.00657<0.05，說明溫度對(duì)鈣離子碳化率具有顯著性影響。

圖2 溫度對(duì)鈣離子碳化率的影響Fig.2 Effect of temperature on the rate of carbonation of calcium ion

2.1.3 CaCl2濃度對(duì)鈣離子碳化率的影響 固定碳化時(shí)間、CO2通入流速時(shí)，體系CaCl2初始濃度直接影響到CO32?/Ca2+的比例，從而影響鈣離子的轉(zhuǎn)化率。圖3 顯示，隨CaCl2濃度上升，鈣離子碳化率呈現(xiàn)先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)鈣離子濃度小于1.0 mol/L 時(shí)，體 系 局 部CO32?/Ca2+的 比 例 較 高，CO32?過飽和，碳化結(jié)束時(shí)可能導(dǎo)致碳化成的碳酸鈣少量轉(zhuǎn)化成碳酸氫鈣，從而導(dǎo)致鈣離子碳化率較低；但隨著CaCl2濃度上升，體系CO32?/Ca2+比例下降，CO32?過飽和度下降并逐漸趨于穩(wěn)定，體系鈣離子基本都碳化成碳酸鈣并穩(wěn)定存在，故鈣離子碳化率隨鈣離子濃度增大而上升，并趨于穩(wěn)定；當(dāng)鈣離子濃度為1.00 mol/L 時(shí)，就具有較佳的碳化效果，碳化率為98.37%。單因素方差分析P=4.56×10?10<0.05，說明CaCl2濃度對(duì)鈣離子碳化率的影響具有顯著性。

圖3 CaCl2 濃度對(duì)鈣離子碳化率的影響Fig.3 Effect of CaCl2 concentration on the rate of carbonation of calcium ion

2.1.4 pH 對(duì)鈣離子碳化率的影響 碳化體系的pH 直接影響二氧化碳的溶解度以及碳酸的解離趨勢（碳酸二級(jí)解離常數(shù)，pKa2=10.2），進(jìn)而影響著體系鈣離子的碳化反應(yīng)效果。實(shí)驗(yàn)采用氨水調(diào)節(jié)碳化體系pH，考察pH 對(duì)鈣離子碳化率的影響，由圖4 可知，鈣離子碳化率隨著體系pH 增大呈現(xiàn)先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢；pH<12.0，體系鈣離子碳化率隨著pH 增大快速增大；pH>12.0，鈣離子的碳化率隨pH 增大變化不明顯；當(dāng)pH=12.0 時(shí)，鈣離子碳化率為98.14%。單因素方差分析P=1.25×10?17<0.05，說明pH 對(duì)鈣離子碳化率的影響具有顯著性?？紤]強(qiáng)酸強(qiáng)堿設(shè)備成本，確定碳化體系較佳pH 為12。

圖4 pH 對(duì)鈣離子碳化率的影響Fig.4 Effect of pH on the rate of carbonation of calcium ion

2.1.5 碳化時(shí)間對(duì)鈣離子碳化率的影響 固定碳化體系下，碳化時(shí)間直接影響著鈣離子與通入的二氧化碳的碳化反應(yīng)程度。圖5 顯示，隨碳化時(shí)間延長，鈣離子碳化率呈現(xiàn)先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢。當(dāng)碳化時(shí)間小于3 min 時(shí)，碳化率隨碳化時(shí)間延長而快速上升，說明在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)，鈣離子不能達(dá)到完全的碳化效果；當(dāng)碳化時(shí)間為3、5、7、9 min，體系鈣離子碳化率分別達(dá)97.60%、98.57%、99.11%、99.22%；即碳化時(shí)間大于3 min 后，鈣離子的碳化率上升緩慢，基本趨于穩(wěn)定，說明碳化3 min 后體系大部分鈣離子已基本完成碳化反應(yīng)；單因素方差分析P=1.45×10?21<0.05，說明碳化時(shí)間對(duì)鈣離子碳化率具顯著性影響?？紤]碳化程度，確定較佳碳化時(shí)長為5 min。

圖5 碳化時(shí)間對(duì)鈣離子碳化率的影響Fig.5 Effect of reaction time on the rate of carbonation of calcium ion

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化碳化工藝條件

2.2.1 正交試驗(yàn)與結(jié)果分析 由于添加少量幾丁質(zhì)酶不影響碳化率，故確定A 碳化溫度（℃）、B 碳化時(shí)長（min）、C pH、D CaCl2濃度（mol/L）等四因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，分別在A 碳化溫度（℃）、B 碳化時(shí)長）min）、C pH、D CaCl2濃度（mol/L）等4 個(gè)因素的較佳值周邊選擇三個(gè)水平，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)組合出9 個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，以鈣離子碳化率為指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化碳化工藝條件。具體的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的SPSS 方差顯著性分析見表3。

表2 鈣離子碳化制備碳酸鈣的正交實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The schemes and results of orthogonal experiments for the preparation of calcium carbonate by calcium ion carbonization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistical analysis of variance of orthogonal test results

由表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，按A1B3C3D3組合的工藝條件，即在體系pH12.5，碳化溫度25 ℃下，對(duì)30 mL 1.1 mol/L CaCl2溶液碳化時(shí)間6 min，可取得最佳碳化效果，碳化率達(dá)99.82%。但對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果顯示最佳碳化工藝條件組合應(yīng)該為A3B3C3D2，即體系pH 為12.5、碳化溫度為35 ℃、CaCl2濃度為1 mol/L、碳化時(shí)間為6 min；通過比較R 值可知，四個(gè)因素對(duì)鈣離子碳化率的影響主次順序?yàn)椋築>C>D>A，即碳化時(shí)間>pH>CaCl2濃度>碳化溫度。表3 的SPSS 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，四個(gè)因素對(duì)鈣離子碳化率影響均具有顯著性，影響主次順序同極差分析結(jié)果基本一致。

2.2.2 鈣離子碳化最佳工藝條件驗(yàn)證 由于正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示最佳反應(yīng)條件為A1B3C3D3組合，而正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果極差分析得出的最佳反應(yīng)條件為A3B3C3D2組合，結(jié)果不一致。故在A3B3C3D2組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)三次，得鈣離子碳化率達(dá)99.88%±0.02%，比A1B3C3D3組合條件下的碳化率99.82%稍高一點(diǎn)，故確定鈣離子最佳碳化工藝條件為體系pH 為12.5、碳化溫度為35 ℃、CaCl2濃度為1 mol/L、碳化時(shí)間為6 min。

2.3 幾丁質(zhì)酶對(duì)碳酸鈣晶型的調(diào)控

在優(yōu)化的碳化工藝條件下，分別按0:1、0.002:1、0.004:1、0.01:1 的酶鈣質(zhì)量比，往35 ℃、pH 12.5、30 mL 的1 mol/L CaCl2溶液中加入幾丁質(zhì)酶，攪拌混勻后，持續(xù)通入二氧化碳碳化6 min，碳化結(jié)束分析計(jì)算鈣離子碳化率，不同體系下的碳化率在99.85%～99.92%范圍內(nèi)波動(dòng)，結(jié)果進(jìn)一步顯示幾丁質(zhì)酶的添加確實(shí)不影響鈣離子的碳化率。產(chǎn)品經(jīng)洗滌、烘干至恒重后，取適量產(chǎn)品酸溶后，根據(jù)蛋白質(zhì)的紫外特征吸收性質(zhì)，測定樣品液在280 nm 的吸光度值判斷產(chǎn)品是否夾雜幾丁質(zhì)酶，結(jié)果顯示不同酶鈣質(zhì)量比的碳化體系制備的產(chǎn)品均無夾雜幾丁質(zhì)酶。在此基礎(chǔ)上，取樣進(jìn)行掃描電鏡、紅外光譜等性能表征測試，進(jìn)一步了解幾丁質(zhì)酶對(duì)碳酸鈣晶型的調(diào)控及產(chǎn)品組成情況。

2.3.1 掃描電鏡分析 采用掃描電鏡（SEM）測定不同量幾丁質(zhì)酶調(diào)控下碳化而成的碳酸鈣的形貌和粒徑。圖6 中的a、b、c、d 分別是未加酶、按0.002:1、0.004:1、0.01:1 的酶鈣質(zhì)量比添加幾丁質(zhì)酶調(diào)控碳化形成的碳酸鈣的SEM 圖像。

由圖6a 可見，未添加幾丁質(zhì)酶調(diào)控碳化制備的碳酸鈣是由約110 nm 的球狀顆粒和少部分尺寸近1 μm的菱形塊狀自組裝形成的直徑為2 ～ 8 μm 左右的大小不一的微球。圖6b 顯示，按0.002:1 的酶鈣比添加幾丁質(zhì)酶制備得到的碳酸鈣微球尺寸變小，且菱形塊狀形貌消失，碳酸鈣基本由80 nm 的納米級(jí)球狀顆粒團(tuán)聚而成的粒徑約為2 ～ 4 μm 的大小較均勻的微球。進(jìn)一步增大幾丁質(zhì)酶加入量，由圖6c、6d 可知，碳酸鈣基本顆粒和微球粒徑隨著酶添加量增大而減小，納米球基本顆粒的團(tuán)聚由緊密趨向蓬松；按0.004:1 的酶鈣比添加酶調(diào)控，可得到70 nm 的納米顆粒團(tuán)聚組成的粒徑約為1.5 μm 的大小均勻的微球；當(dāng)比例增到0.01:1，得到60 nm 的納米顆粒團(tuán)聚組成的粒徑小于1 μm 的蓬松微球。SEM 表征結(jié)果說明幾丁質(zhì)酶的添加不僅能改變碳酸鈣基本顆粒的晶型與尺寸，還會(huì)影響碳酸鈣顆粒團(tuán)聚的緊密度與團(tuán)聚微球粒徑，這對(duì)食品、保健等輕工業(yè)新型鈣制劑的制備與應(yīng)用具有重要意義。幾丁質(zhì)酶對(duì)碳酸鈣晶型的調(diào)控效應(yīng)與高平章等[17]用胰蛋白酶調(diào)控碳酸鈣晶型的效果類似，肯定了蛋白質(zhì)類物質(zhì)對(duì)碳酸鈣的仿生制備過程具有實(shí)際的調(diào)控作用。

圖6 不同量幾丁質(zhì)酶調(diào)控制備的碳酸鈣的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscope of calcium carbonate prepared under the control of different amounts of chitinase

2.3.2 紅外光譜分析 方解石型碳酸鈣的紅外光譜特征吸收峰為876 cm?1和712 cm?1[4,32]。圖7 是未加幾丁質(zhì)酶調(diào)控CaCl2碳化形成的碳酸鈣紅外光譜圖，由圖可見，在3436、1421、875 cm?1和714 cm?1處出現(xiàn)特征吸收峰，與竹文坤等[22]以CaCl2和碳酸鈉為原料在純水體系下復(fù)合合成的方解石型碳酸鈣的紅外譜圖基本一致，均具有876 cm?1和712 cm?1的紅外特征峰，說明未加幾丁質(zhì)酶調(diào)控碳化形成的碳酸鈣為方解石型。圖中3436 cm?1是H-O 鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，表明碳酸鈣含有水分；而1421 cm?1是方解石型碳酸鈣中的C-O 鍵的伸縮振動(dòng)特征吸收峰；875 cm?1和714 cm?1是方解石型碳酸鈣中C-O鍵的彎曲振動(dòng)特征吸收峰。目前大部分實(shí)驗(yàn)制備的方解石基本是密實(shí)菱形，但電鏡圖顯示未加幾丁質(zhì)酶碳化制備的碳酸鈣為球形；實(shí)驗(yàn)結(jié)果與徐煥煥等[32]采用復(fù)分解法，用豆腐廢水調(diào)控制備出球形方解石碳酸鈣的形貌相似，表明特定條件下制備的方解石碳酸鈣并不完全是菱形。

圖7 未加幾丁質(zhì)酶的碳酸鈣紅外譜圖Fig.7 Infrared spectrum of calcium carbonate without chitinase

球霰石型碳酸鈣的紅外光譜特征吸收峰為876 cm?1和745 cm?1[4]。圖8 是按0.01:1 酶鈣質(zhì)量比加入幾丁質(zhì)酶調(diào)控CaCl2碳化形成的碳酸鈣紅外光譜圖，由圖可知，在1456～1409 cm?1之間出現(xiàn)了較寬的分裂吸收峰，1089、874 cm?1和745 cm?1處也出現(xiàn)特征吸收峰，特征峰與馬曉明等[23]在胃蛋白酶調(diào)控下水醇體系中用CaCl2和碳酸氫銨仿生合成的球霰石碳酸鈣的紅外特征吸收峰基本一致，也與王芬等[33]利用CO2碳化制備的球霰石型碳酸鈣的紅外特征峰基本吻合。圖中1456～1409 cm?1之間的分裂吸收峰是球霰石型碳酸鈣中C-O 鍵反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰；1089、874 cm?1和745 cm?1分別是球霰石型碳酸鈣中C-O 鍵的對(duì)稱伸縮振動(dòng)、面外彎曲振動(dòng)和面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰。結(jié)果說明幾丁質(zhì)酶存在影響了Ca2+碳化形成的碳酸鈣的晶型，可調(diào)控碳化形成的球霰石型碳酸鈣，紅外譜圖表征結(jié)果與SEM 觀測結(jié)果相一致。

圖8 加幾丁質(zhì)酶的碳酸鈣紅外譜圖Fig.8 Infrared spectrum of calcium carbonate with chitinase

幾丁質(zhì)酶對(duì)碳酸鈣晶型的調(diào)控機(jī)理應(yīng)該與大部分蛋白質(zhì)與氨基酸的調(diào)控機(jī)理類似，借助分子中的—COOH 實(shí)現(xiàn)，該基團(tuán)在中性或堿性條件下解離成—COO-，與Ca2+發(fā)生靜電和配位作用，提高體系局部Ca2+濃度，為碳酸鈣結(jié)晶提供成核位點(diǎn)，降低成核活化能，調(diào)控球霰石型晶體形成[5,17]。目前報(bào)道的水體系中蛋白質(zhì)調(diào)控制備的碳酸鈣晶型基本以球霰石為主，且晶體中會(huì)夾雜有水分和蛋白質(zhì)[17,22?23]，但由圖8 可見，幾丁質(zhì)酶調(diào)控制備的碳酸鈣不僅未出現(xiàn)水分子H-O 鍵的伸縮振動(dòng)峰，也沒有出現(xiàn)蛋白質(zhì)酰胺鍵的特征峰，說明幾丁質(zhì)酶雖調(diào)控碳酸鈣晶型，但在晶體生長過程中確實(shí)沒有夾雜入幾丁質(zhì)酶。

產(chǎn)品未夾雜幾丁質(zhì)酶可能是所用的幾丁質(zhì)酶雖含有較多天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸，等電點(diǎn)為5.2[26]，在碳化體系下幾丁質(zhì)酶側(cè)鏈酸性基團(tuán)基本解離成負(fù)離子，加入少量即可與鈣離子相互作用起到良好的晶型調(diào)控效果，但由于加入量少又可使結(jié)合在幾丁質(zhì)酶上的鈣離子重新被置換碳化，從而防止碳化過程中的夾雜；故按0.01:1 酶鈣質(zhì)量比加入少量幾丁質(zhì)酶調(diào)控碳化，既可制出較純的干燥的球霰石型碳酸鈣。

3 結(jié)論

以CaCl2為原料碳化合成碳酸鈣，以鈣離子碳化率為指標(biāo)，單因素考察了碳化溫度、CaCl2濃度、pH、碳化時(shí)間和幾丁質(zhì)酶添加等五個(gè)因素對(duì)鈣離子碳化率的影響，結(jié)果顯示碳化溫度、CaCl2濃度、pH、碳化時(shí)間等4 個(gè)因素對(duì)鈣離子碳化率有顯著性影響，但幾丁質(zhì)酶添加基本不影響鈣離子的碳化率。采用正交試驗(yàn)對(duì)4 個(gè)顯著影響因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳碳化工藝條件為：35 ℃下，以1 L/min 氣體流速往pH 12.5 的1.00 mol/L CaCl2溶液持續(xù)通入CO2碳化6 min，鈣離子碳化成碳酸鈣可獲最佳效果，碳化率達(dá)99.88%。極差分析與SPSS 統(tǒng)計(jì)分析均顯示四個(gè)因素對(duì)碳化率的影響主次順序?yàn)椋禾蓟瘯r(shí)間>pH>CaCl2濃度>碳化溫度，四個(gè)因素對(duì)鈣離子碳化率影響均具有顯著性。

在優(yōu)化工藝條件下，分別按0:1、0.002:1、0.004:1、0.01:1 的酶鈣質(zhì)量比往體系中加入不同量幾丁質(zhì)酶后，碳化制備碳酸鈣，考察幾丁質(zhì)酶對(duì)碳酸鈣晶型的調(diào)控。蛋白成分測定分析顯示，碳化過程未夾入幾丁質(zhì)酶；SEM 和IR 等表征結(jié)果顯示，未加幾丁質(zhì)酶時(shí)，碳化得到的是由球狀顆粒和少部分菱形塊狀組裝形成的直徑為2 ～ 8 μm 的大小不一的方解石型碳酸鈣微球；加入幾丁質(zhì)酶后，菱形塊狀形貌消失，且隨著幾丁質(zhì)酶的添加比例增大，碳酸鈣微球尺寸逐漸下降；當(dāng)酶鈣質(zhì)量比為0.01:1 時(shí)，可制備得直徑小于1 μm 的大小較均一的高純度蓬松球霰石型碳酸鈣微球。說明幾丁質(zhì)酶調(diào)控下可以改變碳酸鈣的晶型與尺寸，是高產(chǎn)率高純度碳化法制備球霰石型碳酸鈣仿生合成的良好調(diào)控劑。