柳璇璇，張浩宇，馬月玲，劉霄蕓，張昆明，謝玉芬，俞曉燕，張光弟,,*

（1.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021；3.寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750021；4.寧夏設(shè)施園藝（寧夏大學(xué)）技術(shù)創(chuàng)新中心，寧夏銀川 750021）

薄荷，屬于唇形科薄荷屬植物（Mentha haplocalyxBriq.），分布廣泛，主要集中在北半球溫帶地區(qū)[1]，薄荷具有清熱降火，可用于風(fēng)熱感冒、發(fā)汗解熱、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、消炎抗菌等功效[2?4]。薄荷作為藥食同源的物質(zhì)，富含氨基酸、有機(jī)元素和維生素等多種營養(yǎng)成分，具有重要的營養(yǎng)和保健價值[5?7]，日本薄荷（Japanese Peppermint）經(jīng)濟(jì)效益高，主要用來提取精油，這是天然薄荷醇的主要來源。

本研究針對香檳和日本薄荷生長環(huán)境是基于魚-花（薄荷）共生的一個閉環(huán)系統(tǒng)，魚花（薄荷）共生系統(tǒng)是一種復(fù)合型生態(tài)體系，其主要表現(xiàn)為水中養(yǎng)魚、水上種花（薄荷）的立體養(yǎng)殖模式，魚的排泄物為薄荷提供營養(yǎng)，通過薄荷根系吸收水中硝態(tài)氮、吸附利用有機(jī)物，不僅具有一定的觀賞價值，而且可以凈化水質(zhì)[8?10]。目前，對于薄荷在揮發(fā)性物質(zhì)鑒別方面，大多數(shù)是利用頂空氣相色譜法（GC-MS）進(jìn)行揮發(fā)性成分的鑒別分析[11?13]，例如安秋榮等[14]利用GC-MS 法分析春、秋季薄荷油成分，發(fā)現(xiàn)春季薄荷油主要揮發(fā)性成分為薄荷酮、薄荷醇為主，秋季薄荷以薄荷酮及α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯為主。郭向陽等[15]利用GC-MS/GC-O分析，得出了薄荷葉片中的香葉醇、香茅醇及檸檬醛、香葉甲醛含量較多。氣相離子遷移譜（GC-IMS）技術(shù)是集氣相色譜和離子色譜的靈敏度高、分離程度好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)的新型分離技術(shù)[16?19]，也可進(jìn)行低溫鑒別，近年來廣泛應(yīng)用于食品加工、食品風(fēng)味分析、品質(zhì)檢測等方面，例如陳通等[20]、李淑靜等[21]利用GC-IMS 在植物油分類，鑒偽方面做了研究，表明該技術(shù)的簡便快捷、無損高效特點(diǎn)；在飲料產(chǎn)品風(fēng)味鑒別研究上，林若川等[22]應(yīng)用GC-IMS 技術(shù)鑒別綠茶風(fēng)味。此外，GC-IMS 技術(shù)在一些花卉，藥食兩用的植物揮發(fā)性成分研究中也有應(yīng)用，例如馬云等[23]對不同發(fā)育期忍冬花顏色與氣味變化的監(jiān)測就利用了該技術(shù)；林史珍等[24]用GC-IMS 監(jiān)測高溫、高濕加速破壞模擬條件下苦杏仁貯存過程中揮發(fā)性物質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)隨貯藏時間延長，苦杏仁揮發(fā)性物質(zhì)中醇類、酮類物質(zhì)總體含量呈升高趨勢，酸類、酯類、烴類物質(zhì)下降。

目前在薄荷的揮發(fā)性成分研究中，尚未見利用GC-IMS 技術(shù)對薄荷揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒別分析，本文以魚-花（薄荷）共生的一個閉環(huán)系統(tǒng)中生長的香檳薄荷和日本薄荷為原料，利用氣相色譜-離子遷移譜（GC- IMS）技術(shù)檢測薄荷揮發(fā)性組分的變化，并結(jié)合聚類熱圖和主成分分析（principal component analysis，PCA）化學(xué)計量法對兩個薄荷品種莖葉組織中揮發(fā)性成分加以區(qū)分，從而更有利于對未知薄荷樣品進(jìn)行種類鑒別，為不同薄荷品種在魚花共生系統(tǒng)條件下凈化水質(zhì)能力與魚花共生互作提供參考，同時為日本薄荷和香檳薄荷在精油提取、薄荷茶、薄荷香精香料、調(diào)味料等高質(zhì)產(chǎn)品加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香檳薄荷和日本薄荷材料 來自于寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣光明漁村魚-花（薄荷）共生的一個閉環(huán)系統(tǒng)，選取長勢優(yōu)良、無病蟲害、生長狀況一致的花前日本薄荷和香檳薄荷，取兩種薄荷相同部位的莖和葉，分別裝入EP 袋中，在?18 ℃條件下冷凍冷藏，備用。

FlavourSpec ?風(fēng)味分析儀 德國海能儀器公司； SB224 型千分之一電子天平 北京佳源興業(yè)科技有限公司。

1.2 樣品前處理

將備用不同薄荷品種葉和莖分別取出后剪碎，分別稱取葉和莖樣品各1.0 g，置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶內(nèi)，70 ℃孵育20 min 后進(jìn)樣；每個樣品平行測定3 次。

1.3 分析條件

1.3.1 氣相-離子遷移譜單元參數(shù)設(shè)置 FS-SE-54-CB-1 色譜柱（15 m× 0.53 mm，1 μm），分析時間45 min，色譜柱溫度60 ℃；載氣為高純N2（≥99.999%）；IMS 溫度 45 ℃。

1.3.2 自動頂空進(jìn)樣單元參數(shù)設(shè)置 采取自動頂空進(jìn)樣的方式，進(jìn)樣體積200 μL，孵育時間20 min，孵育溫度70 ℃，進(jìn)樣針溫度 85 ℃，孵育轉(zhuǎn)速500 r/min。

1.3.3 氣相色譜條件 離子源是正離子模式；載氣為高純氮?dú)猓?9.999%），離子傳輸管溫度45 ℃，色譜柱溫度40 ℃，進(jìn)樣口溫度85 ℃，離子傳輸管載氣流速150 mL/min，色譜柱載氣流速：0～2 min 時為2 mL/min；2～10 min 時，從2 mL/min 上升到10 mL/min；在10～20 min，流速急速上升到100 mL/min；在20～25 min 后，流速上升到150 mL/min，25 min 后，流速保持為150 mL/min 至45 min 后，分析結(jié)束。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用軟件Laboratory Analytical Viewer（LAV）、定 性 軟 件 GC×IMS Library Search（ 內(nèi) 置 NIST 2014、IMS 數(shù)據(jù)庫）對兩種薄荷莖葉組織中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性分析，用LAV 中插件Reporter 和插件Gallery Plot 進(jìn)行兩種薄荷莖和葉樣品間揮發(fā)性有機(jī)物的差異圖譜分析，通過插件Dynamic PCA 和可視化TBtools 軟件進(jìn)行樣品主成分分析，并采用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種薄荷莖葉組織揮發(fā)性物質(zhì)的二維譜圖分析

為反應(yīng)離子峰（Reaction Ion Peak，RIP）。橫坐標(biāo)代表離子遷移時間（Drift Time，DT）；縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時間（Retention Time，RT），RIP 峰兩側(cè)的每一個點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物。顏色代表物質(zhì)的濃度，顏色越深表示濃度越大。白色表示薄荷揮發(fā)性物質(zhì)濃度較低，紅色表示薄荷揮發(fā)性物質(zhì)濃度較高。

從圖1 可看出，兩種薄荷莖葉中揮發(fā)性組分之間存在較大的差異，香檳薄荷的葉莖揮發(fā)性化合物均少于日本薄荷的葉莖，兩種薄荷葉片中的揮發(fā)性物質(zhì)均多于莖中的揮發(fā)性物質(zhì)，其中日本薄荷的葉片揮發(fā)性化合物明顯多于香檳薄荷的葉片揮發(fā)性化合物，香檳薄荷莖中的揮發(fā)性物質(zhì)也少于日本薄荷莖的揮發(fā)性物質(zhì)，對于遷移時間和保留時間一致的揮發(fā)性化合物，兩種薄荷莖葉組織部分的揮發(fā)性化合物峰面積存在較大差異。

圖1 兩種薄荷莖葉組織中揮發(fā)性有機(jī)物的GC-IMS 譜圖（俯視圖）Fig.1 GC-IMS spectra of volatile organic compounds in two kinds of mint stems and leaves (top view)

2.2 兩種薄荷樣品莖葉組織揮發(fā)性有機(jī)物定性分析

在GC-IMS 中，根據(jù)氣相色譜的保留指數(shù)（RI）、保留時間（RT）、遷移時間（DT），通過軟件GC×IMS Library Search 檢索鑒定化合物，有些揮發(fā)性化合物檢測出其單體和二聚體，兩者屬于同一種揮發(fā)性化合物，表1 中按單聚體化合物進(jìn)行統(tǒng)計，在兩種薄荷的莖葉中共定性出了41 種揮發(fā)性化合物，包括11 種醇、9 種酮、5 種醛、3 種呋喃、10 種酯類、1 種萜烯及含硫類化合物2 種，具體見表1。

表1 兩種薄荷莖葉組織中揮發(fā)性化合物的定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile compounds in two kinds of mint stems and leaves

由表1 可以看出，醇、醛、酮、酯是薄荷中主要的揮發(fā)性成分，這也是薄荷在精油提取、薄荷茶飲料以及食品保健品等利用上含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)。兩種薄荷莖葉中，共檢測出了41 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中，醇類有11 種，在薄荷揮發(fā)油中，薄荷醇類含量較高，其次是酮類，這與劉莉等[25]的研究結(jié)果一致。在兩種不同薄荷莖葉中，醇含量較高的有桉葉油醇、3-辛醇、反式-2-己烯醇和L-薄荷醇，在日本薄荷莖中，含量較高的是桉葉油醇和3-辛醇，其分別為28.1%和23.0%，在葉片中，含量較高的是反式-2-己烯醇（24.5%）和L-薄荷醇（16.7%），在香檳薄荷莖中，含量高的是桉葉油醇（19.8%）和反式-2-己烯醇（37.9%），在葉片中，含量較高的成分是桉葉油醇和3-辛醇，分別為35.0%和16.1%。兩種薄荷相比，桉葉油醇在香檳薄荷中含量較高，其相對含量變化范圍為19.8%～35.0%，反式-2-己烯醇在香檳薄荷中最多，其相對含量變化范圍為14.3%～37.9%，醇類是薄荷精油提取中重要的揮發(fā)性物質(zhì)，本研究旨在為薄荷提取精油方面提供更進(jìn)一步的理論依據(jù)。

兩種薄荷莖葉中，共檢測出醛類化合物5 種，分別是異戊醛、苯甲醛、丁醛、正己醛，兩種薄荷莖葉中，含量最高的是香檳葉片中的異戊醛，其相對含量變化范圍為19.5%～49.4%，是莖中的1.8 倍，日本薄荷莖中，醛類物質(zhì)含量較高的是異戊醛、正己醛，其含量分別為34.0%和32.7%，在葉片中含量最高的是苯甲醛，含量為45.5%，比莖中苯甲醛的含量高32.8%，醛類在油脂提取方面都有被檢測出來，醛類是脂氧化的產(chǎn)物[26?27]，在其藥用價值及其食用方面研究較少；

兩種薄荷莖葉中，共檢測出酮類化合物9 種，含量較高的是日本薄荷莖中的3-辛酮，葉片中的3-羥基-2-丁酮，香檳薄荷莖中的2-庚酮，葉片中的3-羥基-2-丁酮，4 種揮發(fā)性成分的含量分別為68.7%、28.1%、33.8%和49.7%。兩種薄荷葉片中，均含有3-羥基-2-丁酮，但在日本薄荷的含量比香檳薄荷低21.6%，其中2,3-丁二酮是香檳薄荷中特有的揮發(fā)性化合物，其相對含量變化范圍為5.7%～13.7%，3-辛酮和2-壬酮是日本薄荷中獨(dú)有的揮發(fā)性化合物，3-辛酮在莖中的含量高達(dá)68.7%，2-壬酮含量相對比較低，其相對含量變化范圍為0.5%～5.7%，酮類物質(zhì)也是薄荷在精油提取中的主要揮發(fā)性物質(zhì)。

兩種薄荷莖葉中，共檢測出酯類物質(zhì)有10 種，在香檳薄荷莖葉中，酯類化合物只有2-甲基丁酸甲酯和乙酸乙酯2 種，其中2-甲基丁酸甲酯含量是酯類中最高的，其相對含量變化范圍為82.7%～88.6%，乙酸乙酯相對含量變化范圍11.4%～17.3%，在日本薄荷中，10 種酯類化合物都有，含量最高的是葉片中的乙酸乙酯，其含量為62.1%，比在莖中的含量高16.3%。

除了以上四類化合物是薄荷主要的揮發(fā)性物質(zhì)之外，其它類化合物檢出了呋喃類3 種，萜烯1 種，以及含硫化合物2 種，其中α-蒎烯在日本薄荷莖中含量為48.5%，2-正戊基呋喃是在日本薄荷中有的化合物，在香檳中沒有，這也可以作為區(qū)別兩種薄荷的依據(jù)，2-乙?；秽谙銠壉『汕o葉中含量都很高，其含量分別為94.1%～61.4%，二甲基硫在日本薄荷莖中，香檳薄荷莖葉中含量都比較高，分別是75.5%、85.9%和80.5%，甲硫醚在日本薄荷葉片的含量高達(dá)93.4%，薄荷中，甲硫醚具有抗氧化、降血壓和降血糖的作用，α-蒎烯具有抗炎、抗病毒、體外抗腫瘤等生物活性[28]。

2.3 日本薄荷和香檳薄荷莖葉組織指紋圖譜特征分析

為了更加明確日本薄荷和香檳薄荷莖葉中的差異物質(zhì)以及進(jìn)行量化，因此利用二維的指紋圖譜，鑒別不同薄荷品種莖葉的特征峰區(qū)域[29?30]，GC-IMS 指紋圖譜分為兩部分，如圖2、圖3 所示。圖中X 軸為檢測到的薄荷揮發(fā)性化合物，右側(cè)Y 軸代表薄荷品種的編號（每一行為一個薄荷品種莖葉組織的指紋圖，每個薄荷樣品做3 個平行），圖中亮點(diǎn)的顏色及深淺表示不同薄荷莖葉含量的高低。

由圖2、圖3 可看出，同一薄荷品種中檢測到莖和葉的揮發(fā)性成分有很大差別，各自的特征峰區(qū)域不同，也有共同的特征峰區(qū)域，由圖2、圖3 中可以看出，大量揮發(fā)性成分在日本薄荷葉片中的含量更高。日本薄荷葉片中，特征性揮發(fā)物質(zhì)含量較高的是3-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-甲基呋喃、3-辛酮、異丁酸乙酯、芳樟醇、丁醛、桉葉油醇、2-甲基丁酸甲酯、甲硫醚、薄荷醇、3-甲基丁醛、2-乙基呋喃、己醛、異丁醇、α-蒎烯、1-戊醇、2-丁酮、3-戊酮和反式-2-己烯-1-醇等；在日本薄荷莖中，含有的特征性揮發(fā)物質(zhì)主要有：乙酸乙酯、2-正戊基呋喃、乙酸戊酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、2-壬酮、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、1-己醇和己酸乙酯等。在香檳薄荷葉片中，含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)包括：2-乙基呋喃、丙酮、己醛、2-甲基呋喃、2-丁酮、2-己酮、3-甲硫基丙醛、芳樟醇、反式-2-己烯-1-醇、苯甲醛、3-戊酮、3-辛醇、2-甲基丁酸甲酯、α-蒎烯、2-庚酮和桉葉油醇等；在莖中含量較高的有：1-己醇、2,3-丁二酮、異丁醇、1-戊醇和二甲基三硫等，兩種荷相比較，在日本薄荷莖中的含量遠(yuǎn)高于香檳薄荷莖，比如2-壬酮、乙酸異丁薄酯、乙酸異戊酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、2-正戊基呋喃、乙酸戊酯、乙酸丁酯和己酸乙酯等；日本薄荷葉中的丙酮、薄荷醇等的含量高，分別為19.9%和16.7%，香檳薄荷葉中的2-甲基丁酸甲酯的含量達(dá)到88.6%，是日本薄荷莖中含量的5.9 倍；2-庚酮在日本薄荷葉中的含量和在香檳薄荷莖中的含量都比較高，分別達(dá)到了17.3%和33.8%；在醛類中，丁醛在香檳薄荷莖和葉中的含量比較高，分別為16.0%和28.5%；苯甲醛在日本薄荷葉中的含量比在香檳薄荷含量高32.7%；桉葉油醇、3-辛醇和1-辛烯-3-醇在日本薄荷莖中的含量遠(yuǎn)低于葉片，通過比較相互莖和葉的揮發(fā)性有機(jī)物的含量，可以看出日本薄荷中的揮發(fā)性化合物總體多于香檳薄荷，其中2,3-丁二酮是香檳薄荷中獨(dú)有的揮發(fā)性化合物，其莖中含量為5.7%，葉中含量為13.7%，而2-壬酮、3-辛酮、乙酸丁酯、乙酸異戊酯、乙酸異丁酯和乙酸丙酯是日本薄荷獨(dú)有的酯類揮發(fā)性有機(jī)物，在香檳薄荷中尚未檢出。

圖2 兩種薄荷莖葉組織中揮發(fā)性有機(jī)物的GalleryPlot 圖（左側(cè)圖）Fig.2 Gallery Plot of volatile organic compounds in menthol stem and leaf tissues ( on the left)

圖3 兩種薄荷莖葉組織中揮發(fā)性有機(jī)物的GalleryPlot 圖（右側(cè)圖）Fig.3 Gallery Plot of volatile organic compounds in menthol stem and leaf tissues ( on the right)

2.4 兩種薄荷莖葉組織熱圖

通過揮發(fā)性有機(jī)物峰體積對兩種薄荷揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行可視化熱圖聚類分析（圖4）和主成分分析（圖5），可以更直觀的看出日本薄荷和香檳薄荷莖葉組織中揮發(fā)性化合物的差異，從圖4 的聚類分析可得，兩種薄荷莖葉可聚為3 類，1-L 日本薄荷葉和2-L 香檳薄荷葉聚為一類，1-S 日本薄荷莖，2-S 香檳薄荷莖各為一類。結(jié)合表1 和圖4 可以看出，兩種薄荷葉片中揮發(fā)性成分整體高于莖，日本薄荷莖中乙酸乙酯含量最高，葉片中3-辛酮含量高，香檳薄荷莖中桉葉油醇含量高，葉片中反式-2-己烯醇含量最高，對圖5 的PCA 分析可以看出，兩種薄荷莖葉中，第一主成分PC-1 貢獻(xiàn)率為49%，第二主成分PC-2 貢獻(xiàn)率為28%，二者累計貢獻(xiàn)率為77%，兩種薄荷莖和葉距離很遠(yuǎn)，表明它們之間存在較大差異，日本薄荷中葉片的含量比莖中含量高，這是因?yàn)槿~片吸收植物光合作用及根部營養(yǎng)比莖中多。香檳薄荷莖和葉距離很遠(yuǎn)，表明它們之間存在較大差異。日本薄荷和香檳薄荷中，葉片和莖之間的揮發(fā)性成分差異很大，這與前人研究的結(jié)果相似[31?35]，可以各自聚為一類，主成分分析和系統(tǒng)聚類分析所得結(jié)果基本一致。結(jié)果表明GC-IMS 分析結(jié)果能較好地判別和區(qū)分不同薄荷品種不同部位組織中的差異。

圖5 兩種薄荷莖葉組織中揮發(fā)性有機(jī)物PCA 分析Fig.5 Analysis of volatile organic compounds in the tissues PCA two menthol stems and leaves

3 結(jié)論

在兩種薄荷莖葉組織中共檢測出了41 種揮發(fā)性成分，主要包括11 種醇、9 種酮、5 種醛、3 種呋喃、10 種酯、1 種烯烴及2 種含硫類化合物。其中莖葉中，醇和酮是主要的揮發(fā)性化合物，這兩類化合物也是薄荷精油提取中主要的揮發(fā)性物質(zhì)，除此之外，還有些像α-蒎烯等這樣的萜烯類揮發(fā)性化合物，具有一定的抗炎、抗病毒、抑菌等作用，在薄荷莖葉中含量都比較高；兩種薄荷葉片都含有部分特征性揮發(fā)有機(jī)物，例如香檳薄荷中獨(dú)特的2,3-丁二酮，日本薄荷中的2-乙基呋喃，借助于這些成分的特異性，可為鑒別薄荷品種和薄荷不同產(chǎn)地的方法提供一定的理論基礎(chǔ)，其特征性揮發(fā)性成分，也可作為某些特定食品中的天然食品添加劑，日本薄荷莖中的特征性揮發(fā)性物質(zhì)最多，例如莖中的乙酸龍腦酯、2-壬酮、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、2-正戊基呋喃、乙酸戊酯、乙酸丁酯和己酸乙酯等，日本薄荷葉片和莖相比較，葉片中所含的揮發(fā)性有機(jī)物種類更多、含量更高，而莖中也有少量揮發(fā)性有機(jī)物含量遠(yuǎn)高于葉片，香檳薄荷中的莖揮發(fā)性成分的含量也低于葉片；通過可視化熱圖和PCA 分析可知，兩種薄荷葉片中的揮發(fā)性有機(jī)物成分和含量差異很大。如果通過更多的樣品進(jìn)行建模，這一結(jié)果也將為薄荷葉片和薄荷莖在有機(jī)物區(qū)分上以及對未知薄荷樣品進(jìn)行種類鑒別提供一定的理論依據(jù)。通過以上結(jié)果，利用薄荷不同組織特征性揮發(fā)性化合物，可為將來在食品香精香料、調(diào)味品等薄荷深加工方面，提供科學(xué)、合理的建議和支撐。