張秉麗 霍成英 李有連 朱海宏

1.青海仁濟醫(yī)院 西寧 810000 2.青海省人民醫(yī)院

腸易激綜合征是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，可分為便秘型、腹瀉型、混合型、未定型等多種類型，其中腹瀉型最常見，可引發(fā)腹痛、腹部不適、排便習(xí)慣改變等癥狀，影響患者生活質(zhì)量[1]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)量增多、功能激活在腹瀉型腸易激綜合征發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，可引發(fā)細胞損傷、炎癥反應(yīng)[2-3]。防風(fēng)為傳統(tǒng)中藥材，其成分多糖、揮發(fā)油、色原酮等具有一定抗氧化活性，且可減輕炎癥反應(yīng)，緩解胃腸道功能紊亂[4-5]，但目前關(guān)于防風(fēng)提取物對腹瀉型腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜肥大細胞的影響及具體機制仍無定論。研究證實，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）可參與腦-腸軸功能調(diào)節(jié)，在腸易激綜合征發(fā)生中有重要作用[6]。本研究擬開展動物實驗，分析防風(fēng)提取物對腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸黏膜肥大細胞的影響，并著重探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級SD新生期大鼠60只，1d齡，體質(zhì)量4.80～5.50g；清潔級SD哺乳期母鼠60只，7周齡，體質(zhì)量260～280g，均購于中國醫(yī)藥研究開發(fā)中心有限公司[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（京）2018-0030]，產(chǎn)地為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所[實驗動物生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（京）2019-0011]，飼養(yǎng)于青海大學(xué)[實驗動物使用許可證號碼：SYXK（青）2020-0001]。所有大鼠實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)3d，室溫（22±2）℃，相對濕度45%～60%，光照周期12h/12h，自由飲水、進食。本研究經(jīng)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：IACUC-2019-005）。

1.2 藥物、試劑和儀器 防風(fēng)購于北京同仁堂股份有限公司（批號：180214）；昂丹司瓊（純度＞98%）購于美國LGM Pharma公司（批號：200418）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：151123）；二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）蛋白試劑盒購于湖北武漢富鑫遠科技有限公司（批號：200316）；甲苯胺藍染色試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司（批號：190517）；5-HT、5-HT3受體（5-HT3 receptor，5-HT3R）、5-HT4受體（5-HT4 receptor，5-HT4R）、色氨酸羥化酶1（tryptophan hydroxylase 1，TPH1）酶聯(lián)免疫吸附檢測（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒均購于上海將來實業(yè)股份有限公司 （批號：180521、181206、190411、170414）； 兔抗大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1一抗及山羊抗兔IgG二抗均購于英國Abcam公司（批號：180507、120516、150417、180223）。 DG5031型酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀購于華東電子醫(yī)療公司；MIQAS型醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)及軟件為上海求為生物科技有限公司產(chǎn)品；BX51型顯微鏡購于日本奧林巴斯株式會社。

1.3 模型制備及分組 在60只新生期大鼠中隨機選10只作為A組（空白對照組），其余50只新生期大鼠建立腹瀉型腸易激綜合征大鼠模型[7]，具體如下：第2～21日齡期間，每日上午8:00～11:00將新生期大鼠與哺乳期母鼠分開3h。第22日齡斷奶，完成母嬰分離后，各組大鼠均給予正常飼料、飲水，喂養(yǎng)至第49日齡。第50～60日齡時，每日上午9:00～11:00給予束縛應(yīng)激刺激2h，束縛前上肢、前肩及下肢，避免搔抓頭面部，可允許少量前后活動。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：建模后出現(xiàn)食欲減退、精神不佳、嗜睡、體質(zhì)量減輕、腹瀉等表現(xiàn)，并參考文獻[8]的方法計算腹瀉指數(shù)（稀便率×稀便級），腹瀉指數(shù)高于建模前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），即為建模成功。50只大鼠中建模成功46只，成功率為92.00%，將建模成功大鼠隨機分為B、C、D、E組，各組分別有11、11、12、12只大鼠。A組大鼠以上述方法喂養(yǎng)至第49日齡，此后不予束縛應(yīng)激刺激，繼續(xù)以常規(guī)飼料、飲水喂養(yǎng)至第60日齡，10只大鼠均納入研究。

1.4 動物干預(yù) 干預(yù)前取100g防風(fēng)根，粉碎成細粉，加8倍體積蒸餾水，回流提取，重復(fù)3次，每次30 min。3次提取液合并，取1/2提取液濃縮，70℃烘干、粉碎，獲得提取物備用。大鼠建模成功后24h開始給藥，按照《藥理實驗方法學(xué)》[9]中的換算公式，將各組藥物換算成大鼠等效劑量，具體換算公式為：大鼠給藥劑量（mg·kg-1）=成 人 臨 床 劑 量 （mg·kg-1）×70kg×0.018/0.2kg。 A組、B組灌胃5 mL蒸餾水；C組灌胃5-HT信號抑制劑昂丹司瓊2.6mg/（kg·d）（溶于5 mL蒸餾水）；D組分別灌胃昂丹司瓊2.6mg/（kg·d）（溶于2.5 mL蒸餾水）+防風(fēng)提取物6.3mg/（kg·d）（溶于2.5 mL蒸餾水）；E組灌胃防風(fēng)提取物6.3mg/（kg·d）（溶于5 mL蒸餾水），所有大鼠均給藥1次/d，連續(xù)14d。

1.5 方法

1.5.1 精神心理行為評估 治療結(jié)束后3d進行曠場實驗[10]，觀察各組大鼠精神心理行為變化。大鼠在實驗環(huán)境內(nèi)適應(yīng)10min后，打開自主行為裝置，將大鼠置于敞箱中間，觀察并記錄大鼠入箱5min內(nèi)的水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)（兩前肢同時離地豎起為1次）。其中水平運動次數(shù)可評估大鼠興奮程度，垂直運動次數(shù)可評估大鼠對周圍環(huán)境不確定性及危險性的好奇程度。

1.5.2 排便糞點數(shù)、直腸內(nèi)玻璃小球排出時間檢測 完成精神心理行為評估后，大鼠禁食24h，以2%戊巴比妥鈉50mg·kg-1腹腔注射麻醉，沿大鼠肛門，在距肛門3cm的直腸內(nèi)放入一枚3mm玻璃小球。大鼠蘇醒后，立即將其轉(zhuǎn)移至籠內(nèi)，常規(guī)喂食、飲水，以清潔濾紙鋪墊在籠中。束縛2h后記錄各組大鼠束縛期間排便糞點數(shù)及直腸內(nèi)玻璃小球排出時間。

1.5.3 結(jié)腸黏膜的取材及處理 完成以上檢測后，將大鼠腹腔注射麻醉，斷頭處死，取距離肛門3～5cm處遠端結(jié)腸組織，分為4份，一部分置于4%多聚甲醛固定，以備HE染色，一部分置于10%中性甲醛固定，余下兩部分液氮保存。

1.5.4 結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化觀察 取4%多聚甲醛固定的結(jié)腸組織，0.9%氯化鈉注射液沖洗，磷酸緩沖液浸泡10～12h，脫水，石蠟包埋，4μm切片，烤干后二甲苯透明，脫蠟，水洗，先后行蘇木精和伊紅染色，光鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化。

1.5.5 結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)、陽性面積檢測 取10%中性甲醛固定的結(jié)腸組織，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4μm切片，脫蠟后1%甲苯胺藍染色1min，加1%鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。各組隨機選6張切片，各切片取3個視野，計數(shù)每個視野下的肥大細胞數(shù)，計算3個視野的平均值。隨機選取3個視野，以MIQAS型醫(yī)學(xué)圖像定量分析系統(tǒng)計算肥大細胞陽性面積。肥大細胞胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕褐色顆粒即為染色陽性。

1.5.6 結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相對表達量檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）法檢測。取液氮保存的結(jié)腸組織，Trizol法提取總RNA含量，以紫外分光光度計檢測純度、濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。進行PCR反應(yīng)，應(yīng)用GeneBank基 因 庫 內(nèi) 大 鼠 5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA基因序列，引物設(shè)計及合成在生工生物工程（上海）股份有限公司完成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃ 10min，預(yù)變性；95℃ 15s，變性；57℃ 60s，共40個循環(huán)。反應(yīng)完成后，電腦自動繪制各目標(biāo)基因熔解、擴增曲線，獲得閾值循環(huán)數(shù)。以β-actin為內(nèi)參，以2-△△CT法計算5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.7 結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白相對表達量檢測 采用Western blot法檢測。取液氮保存的結(jié)腸組織，磷酸緩沖液清洗2次，冰上裂解30min，4℃下12 000r/min離心10min，離心半徑8cm，取上清液。以BCA蛋白試劑盒進行蛋白定量，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1h。 加入兔抗大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1一抗（稀釋比例：1∶1 000），4℃搖床孵育過夜。 含吐溫的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（Tris buffer solution Tween，TBST）洗膜后加入二抗（稀釋比例：1∶2 500），室溫孵育2h。TBST洗膜后加入電化學(xué)發(fā)光檢測試劑，成像儀曝光成像。以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值計算目的蛋白相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用最小顯著差異法 （least significance difference，LSD）-t檢驗。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠精神心理行為比較 各組間總體比較，水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與A組比較，B、C、D、E組水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)減少（P＜0.05）；與B組比較，C組水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)減少，D、E組水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)增加（P＜0.05）；與C組比較，D、E組水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)增加（P＜0.05）；與D組比較，E組水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)增加（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)比較（±s，次）Tab.2 Comparison of the number of horizontal and vertical movements in each group（±s， times）

表2 各組大鼠水平運動次數(shù)、垂直運動次數(shù)比較（±s，次）Tab.2 Comparison of the number of horizontal and vertical movements in each group（±s， times）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，ΔP＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05Note:Compared with group A， *P＜0.05;compared with group B， #P＜0.05;compared with group C， ΔP＜0.05;compared with group D，▲P＜0.05

組別 n 水平運動次數(shù) 垂直運動次數(shù)A 組 10 1 605.52±104.15 160.52±21.52 B 組 11 1 215.55±118.52* 70.05±10.52*C 組 11 1 025.35±102.81*# 58.75±10.55*#D 組 12 1 375.54±105.51*#Δ 88.95±11.24*#Δ E 組 12 1 516.52±107.85*#Δ▲ 125.42±13.42*#Δ▲35.731 97.246＜0.001 ＜0.001 F值P值

2.2 各組大鼠排便糞點數(shù)及直腸內(nèi)玻璃小球排出時間比較 各組間總體比較，糞點數(shù)、直腸內(nèi)玻璃小球排出時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與A組比較，B、C、D、E組糞點數(shù)增多，直腸內(nèi)玻璃小球排出時間減少（P＜0.05）；與B組比較，C組糞點數(shù)增多，直腸內(nèi)玻璃小球排出時間減少，D、E組糞點數(shù)減少，直腸內(nèi)玻璃小球排出時間增加（P＜0.05）；與C組比較，D、E組糞點數(shù)減少，直腸內(nèi)玻璃小球排出時間增加（P＜0.05）；與D組比較，E組糞點數(shù)減少，直腸內(nèi)玻璃小球排出時間增加（P＜0.05）。 見表3。

表3 各組大鼠糞點數(shù)及直腸內(nèi)玻璃小球排出時間比較（±s）Tab.3 Comparison of fecal count and excretion time of vitreous bulb in rectum among groups（±s）

表3 各組大鼠糞點數(shù)及直腸內(nèi)玻璃小球排出時間比較（±s）Tab.3 Comparison of fecal count and excretion time of vitreous bulb in rectum among groups（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，ΔP＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05Note:Compared with group A， *P＜0.05;compared with group B， #P＜0.05;compared with group C， ΔP＜0.05;compared with group D， ▲P＜0.05

組別 n 糞點數(shù)（個） 直腸內(nèi)玻璃小球排出時間（min）A 組 10 2.99±0.42 22.58±3.21 B 組 11 5.01±0.73* 16.98±1.75*C 組 11 5.72±0.82*# 15.21±1.35*#D 組 12 4.12±0.75*#Δ 18.02±1.22*#Δ E 組 12 3.43±0.61*#Δ▲ 19.85±2.12*#Δ▲28.924 20.627＜0.001 ＜0.001 F值P值

2.3 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化比較 HE染色顯示，A組結(jié)腸黏膜形態(tài)無異常，上皮完整連續(xù)，腺體規(guī)則排列，結(jié)構(gòu)較清晰，細胞形態(tài)正常。B、C組結(jié)腸黏膜上皮與腺體破壞，間質(zhì)內(nèi)未見炎性細胞、紅細胞。與B、C組比較，D、E組結(jié)腸黏膜上皮較完整，腺體排列較整齊，間質(zhì)未見炎性細胞、紅細胞，其中E組改善更顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)變化（HE染色，400×）Fig.1 Histopathological changes of colonic mucosa in each group(HE staining， 400×)

2.4 各組大鼠結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)、陽性面積比較各組間總體比較，肥大細胞數(shù)、陽性面積差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。 與A組比較，B、C、D、E組肥大細胞數(shù)、陽性面積增高（P＜0.05）；與B組比較，C組肥大細胞數(shù)、陽性面積增高，D、E組降低（P＜0.05）；與C組比較，D、E組肥大細胞數(shù)、陽性面積降低（P＜0.05）；與D組比較，E組肥大細胞數(shù)、陽性面積降低（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)變化（甲苯胺藍染色，200×）Fig.2 Changes of mast cells in colonic mucosa in each group（toluidine blue staining， 200×）

表4 各組大鼠結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)、陽性面積比較（±s）Tab.4 Comparison of mast cell number and positive area in colonic mucosa in each group（±s）

表4 各組大鼠結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)、陽性面積比較（±s）Tab.4 Comparison of mast cell number and positive area in colonic mucosa in each group（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，ΔP＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05Note:Compared with group A， *P＜0.05;compared with group B， #P＜0.05;compared with group C， ΔP＜0.05;compared with group D， ▲P＜0.05

組別 n 肥大細胞數(shù)（個/HP） 肥大細胞陽性面積（μm2）A 組 10 3.58±0.32 53.08±3.54 B 組 11 6.05±0.66* 70.01±4.45*C 組 11 6.58±0.71*# 74.15±5.01*#D 組 12 4.35±0.45*#Δ 68.47±4.88*#Δ E 組 12 4.05±0.35*#Δ▲ 61.25±4.04*#Δ▲68.209 36.999＜0.001 ＜0.001 F值P值

2.5 各組大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA表達比較 各組間總體比較，5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與A組比較，B、C、D、E組5-HT3R、TPH1 mRNA相對表達量升高，5-HT4R mRNA相對表達量降低（P＜0.05）；與B組比較，C組5-HT3R、TPH1 mRNA相對表達量升高，5-HT4R mRNA相對表達量降低，D、E組5-HT3R、TPH1 mRNA相對表達量降低，5-HT4R mRNA相對表達量升高（P＜0.05）； 與C組比較，D、E組5-HT3R、TPH1 mRNA相對表達量降低，5-HT4R mRNA相對表達量升高（P＜0.05）；與D組比較，E組5-HT3R、TPH1 mRNA相對表達量降低，5-HT4R mRNA相對表達量升高（P＜0.05）。 見表5。

表5 各組大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相對表達量比較（±s）Tab.5 Comparison of relative expression of 5-HT3R， 5-HT4R and TPH1 mRNA in each group（±s）

表5 各組大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相對表達量比較（±s）Tab.5 Comparison of relative expression of 5-HT3R， 5-HT4R and TPH1 mRNA in each group（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，ΔP＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05Note:Compared with group A， *P＜0.05;compared with group B， #P＜0.05;compared with group C， ΔP＜0.05;compared with group D， ▲P＜0.05

組別 n A組 10 B組 11 C組 11 D組 12 E組 12 F值P值5-HT3R 5-HT4R TPH1 0.47±0.21 1.39±0.23 0.82±0.25 1.61±0.28* 0.85±0.15* 1.71±0.25*1.82±0.23*# 0.62±0.13*# 1.92±0.21*#1.32±0.22*#Δ 1.05±0.22*#Δ 1.54±0.18*#Δ 0.92±0.25*#Δ▲ 1.25±0.22*#Δ▲ 1.24±0.14*#Δ▲54.139 26.932 45.005＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各組大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白表達比較 各組間總體比較，結(jié)腸組織5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白相對表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與A組比較，B、C、D、E組5-HT3R、TPH1蛋白相對表達量升高，5-HT4R蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與B組比較，C組5-HT3RT、TPH1蛋白相對表達量升高，5-HT4R蛋白相對表達量降低，D、E組5-HT3RT、TPH1蛋白相對表達量降低，5-HT4R蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與C組比較，D、E組5-HT3R、TPH1蛋白相對表達量降低，5-HT4R蛋白相對表達量升高（P＜0.05）； 與D組比較，E組5-HT3R、TPH1蛋白相對表達量降低，5-HT4R蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見圖3、表6。

表6 各組大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白相對表達量比較（±s）Tab.6 Comparison of relative expression of 5-HT3R， 5-HT4R and TPH1 protein in each group（±s）

表6 各組大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白相對表達量比較（±s）Tab.6 Comparison of relative expression of 5-HT3R， 5-HT4R and TPH1 protein in each group（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05；與C組比較，ΔP＜0.05；與D組比較，▲P＜0.05Note:Compared with group A， *P＜0.05;compared with group B， #P＜0.05;compared with group C， ΔP＜0.05;compared with group D， ▲P＜0.05

組別 n A組 10 B組 11 C組 11 D組 12 E組 12 F值P值5-HT3R 5-HT4R TPH1 0.22±0.03 0.85±0.08 0.21±0.03 0.61±0.09* 0.18±0.05* 0.51±0.06*0.82±0.08*# 0.14±0.02*# 0.75±0.08*#0.48±0.06*#Δ 0.39±0.05*#Δ 0.42±0.04*#Δ 0.31±0.04*#Δ▲ 0.57±0.05*#Δ▲ 0.28±0.03*#Δ▲150.071 326.475 183.408＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖3 各組大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白表達比較Fig.3 Comparison of 5-HT3R，5-HT4R and TPH1 protein expression in each group

3 討論

腹瀉型腸易激綜合征是多種因素綜合作用的結(jié)果，其中肥大細胞異常具有重要作用[11]。胃腸道內(nèi)肥大細胞活化可引發(fā)腸道黏膜上皮、神經(jīng)肌肉功能紊亂，增加內(nèi)臟敏感性，導(dǎo)致胃腸道運動模式改變[12]。另外，肥大細胞不僅可將外界刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)信息向神經(jīng)系統(tǒng)傳遞，還可接受神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控，將刺激信息反饋給靶器官，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，故其可能是腹瀉型腸易激綜合征發(fā)病機制中一個重要調(diào)節(jié)點[13]。因此，采取積極措施減少結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)量，成為控制腹瀉型腸易激綜合征病情、改善患者預(yù)后的治療方向。西醫(yī)治療腹瀉型腸易激綜合征多以對癥處理為主，如止瀉、止痛、抗焦慮等，但部分患者整體療效仍然欠佳[14]。

中藥防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)的干燥根，具有清熱解毒、勝濕止痛、解表祛風(fēng)等功效，其化學(xué)成分包括多糖、揮發(fā)油、有機酸、色原酮等，具有清除自由基、抗氧化、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、解熱、免疫調(diào)節(jié)等功效[15-16]，但目前關(guān)于防風(fēng)提取物對腹瀉型腸易激綜合征的療效及其機制尚無定論。臨床上所使用的防風(fēng)提取物多為水提取物或水提醇沉提取物，研究發(fā)現(xiàn)，相較于防風(fēng)水提醇沉提取物，防風(fēng)水提取物毒性更小，更符合用藥合理性，符合臨床上利用藥物“偏性”合理安全發(fā)揮療效的要求[17]，因此本研究將防風(fēng)水提取物應(yīng)用于動物實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)提取物可減輕腹瀉型腸易激綜合征大鼠精神心理行為異常變化，減少排便糞點數(shù)，改善直腸內(nèi)玻璃小球排出時間，有效改善結(jié)腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)等，還可減少結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)和陽性面積，提示防風(fēng)提取物對腹瀉型腸易激綜合征大鼠病情緩解有益，可減少結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)，療效顯著。郭軍雄等[18]發(fā)現(xiàn)在“痛瀉要方”基礎(chǔ)上配伍防風(fēng)，能夠減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠外周血炎癥因子水平，改善腸蠕動，減輕結(jié)腸黏膜病變，與本研究結(jié)果一致。屈映等[19]也證實防風(fēng)可減輕潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)及結(jié)腸病理改變評分，促進腸黏膜修復(fù)。

5-HT是一種吲哚芳香族化合物，人體內(nèi)95%左右存在于胃腸道，與消化道運動、分泌、吸收等密切相關(guān)[20]。胃腸道受到各種刺激時，可激活肥大細胞，促使其脫顆粒并釋放5-HT，作用于臨近的神經(jīng)纖維，引發(fā)感覺神經(jīng)纖維興奮，進行信號傳遞。5-HT主要是與特異性受體，特別是5-HT3R、5-HT4R結(jié)合，從而發(fā)揮生理作用。5-HT3R在腸道內(nèi)多表達于黏膜層細胞、黏膜下層細胞及肌間神經(jīng)叢上神經(jīng)細胞，可參與腸道蠕動、分泌、內(nèi)臟感覺等自主神經(jīng)功能[21]。5-HT4R多表達于腸黏膜下層細胞，參與胃腸道運動及分泌，且可調(diào)節(jié)胃腸道蠕動反射，影響腸道感覺功能[22]。趙魯卿等[23]發(fā)現(xiàn)，中藥方治療腹瀉型腸易激綜合征大鼠能夠獲得理想療效，其作用機制可能與降低5-HT3R和提高5-HT4R表達有關(guān)。另外，研究發(fā)現(xiàn)5-HT信號通路中，TPH1能直接對5-HT生物合成產(chǎn)生影響，參與腸道局部5-HT水平的調(diào)節(jié)[24]。以上研究均提示，5-HT信號軸可能在腹瀉型腸易激綜合征發(fā)病中具有重要作用。昂丹司瓊是一種高選擇性5-HT信號抑制劑，可參與及調(diào)控機體炎性反應(yīng)、氧化反應(yīng)等過程，臨床多用于預(yù)防放化療所致惡心、嘔吐及術(shù)后急性嘔吐，本研究采用昂丹司瓊作為5-HT抑制劑，觀察防風(fēng)提取物對5-HT軸的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)提取物可提升結(jié)腸組織中5-HT3R、TPH1 mRNA及蛋白表達量，降低5-HT4R mRNA及蛋白表達量，并通過5-HT抑制劑昂丹司瓊驗證了這一結(jié)果，故推測防風(fēng)提取物改善腹瀉型腸易激綜合征大鼠癥狀的作用機制，可能與調(diào)節(jié)結(jié)腸黏膜肥大細胞的5-HT信號軸有關(guān)。

綜上所述，防風(fēng)提取物可減少腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸黏膜肥大細胞，其作用機制可能與調(diào)節(jié)5-HT信號軸有關(guān)。本研究仍有不足之處，如實驗動物樣本量較少，觀察周期短等，而且防風(fēng)提取物對結(jié)腸黏膜肥大細胞的影響是否還有其他途徑參與，仍有待進一步研究。