周麗萍 林德菊 周斌杰 姚盼盼 余勤

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

誘導(dǎo)性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPS）是一種類似胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）的多能性干細胞，具有多向分化、自我更新等優(yōu)勢，同時能夠克服ES在臨床應(yīng)用時涉及的移植免疫排斥與倫理道德問題，現(xiàn)已成為再生醫(yī)學(xué)的研究熱點[1]。已有研究證實，iPS經(jīng)過誘導(dǎo)可分化為多種神經(jīng)細胞，如神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞[2-4]，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞移植治療的理想種子細胞。然而，目前其誘導(dǎo)分化機制仍不明確。

近年來，大量研究表明Wnt/β-catenin信號通路可調(diào)控神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元分化[5-7]，而β-連環(huán)蛋白（βcatenin）在該過程中起著關(guān)鍵作用[8-9]。因此，本研究以Wnt信號通路激活劑Wnt3a、抑制劑Dickkopf相關(guān)蛋白-1（Dickkopf-1，DKK-1）和IWR-1為干預(yù)因素，探討Wnt/β-catenin信號通路在iPS向神經(jīng)干細胞分化調(diào)控中的作用及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞 妊娠13.5d的清潔級CF1小鼠，用于小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）的獲取，購于上海市計劃生育科學(xué)研究所實驗動物經(jīng)營部[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0006]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2018-0012]。小鼠iPS由本課題組前期研究建立[10]。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、N2添加劑、B27添加劑、放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解原液、神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購于美國Thermo Fisher公司（批號：1704207、1731337、1736741、89900、1749050）；小鼠Wnt3a重組細胞因子、人DKK-1重組細胞因子均購于美國PeproTech公司（批號：96-315-20-10、96-120-30-10）；小分子抑制劑IWR-1購于美國Selleck公司（批號：S7086）；維甲酸（retinoic acid，RA） 購于美國Sigma公司（批號：R2625）；β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulin Ⅲ）、β-catenin抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗體、山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）H&L抗體均購于Abcam公司（批號：ab68193、ab32572、ab181602、ab150077）；巢蛋白（Nestin）抗體購于Novus公司（批號：NBP1-02419）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）試劑盒均購于日本Takara公司（批號：RR047A、RR420A）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 TE2000-S型倒置相差熒光顯微鏡購于日本Nikon公司；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱為美國Forma公司產(chǎn)品；3K-15型臺式高速冷凍離心機購于美國Sigma公司；Tpersongal PCR儀購于德國Analytik Jena公司；StepOneTMReal-time PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；Wes全自動蛋白表達分析系統(tǒng)為美國Protein Simple公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 體外誘導(dǎo)iPS向神經(jīng)干細胞分化 iPS的飼養(yǎng)層細胞來源于MEF，操作方法參照本課題組前期研究[10]。飼養(yǎng)層細胞制備好后，復(fù)蘇iPS，按一定比例接種培養(yǎng)。以0.25%的胰酶消化成單個細胞，更換用于擬胚體（embryoid body，EB）培養(yǎng)的培養(yǎng)基進行重懸，差速貼壁去除MEF后，將iPS接種到黏附度低的培養(yǎng)皿中進行懸浮培養(yǎng)，每2d換液。培養(yǎng)第6天時，在培養(yǎng)皿中添加工作濃度為1μmol·L-1的RA，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。第9天更換為N2B27誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，最后采用神經(jīng)分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。見圖1。

圖1 體外誘導(dǎo)iPS向神經(jīng)干細胞分化Fig.1 Differentiation of iPS into neural stem cells in vitro

1.2.2 免疫熒光法檢測Nestin和β-tubulinⅢ的表達 誘導(dǎo)iPS向神經(jīng)干細胞分化第12天，吸除培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定10min。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后加入1mL含0.5% Triton X-100的封閉液，室溫封閉40min。吸除封閉液，加入以封閉液配置的相應(yīng)一抗，4℃孵育過夜。吸除一抗，PBS搖洗3遍后加入二抗，室溫避光孵育1h。4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5min，PBS清洗后，以倒置相差熒光顯微鏡觀察蛋白表達情況。

1.2.3 實驗分組 誘導(dǎo)分化第6天，在加入RA誘導(dǎo)之前，將細胞隨機分成正常組、Wnt3a組、DKK-1組和IWR-1組共4組，各組用相應(yīng)的試劑進行處理，Wnt3a工作濃度為10μg·L-1，DKK-1為50μg·L-1，IWR-1為10μmol·L-1，正常組予以等量的PBS，處理至誘導(dǎo)分化第12天，進行后續(xù)檢測。

1.2.4 Real-time qPCR檢測Nestin、β-tubulin Ⅲ及β-catenin基因表達 收集各組細胞，依據(jù)Trizol操作說明，提取總RNA。根據(jù)試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA，再進行目的基因的擴增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共40個循環(huán)。使用StepOne Software v2.2.2軟件分析實驗數(shù)據(jù)，各個樣本中的每種基因表達水平均以內(nèi)參基因β-actin的表達量作為標(biāo)準(zhǔn)，利用相對定量法中的2-ΔΔCt法進行歸一化分析。所有引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 Western blot檢測Nestin、β-tubulin Ⅲ及βcatenin蛋白表達 收集各組細胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞。采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測總蛋白的濃度，每孔上樣量為4μg，上機檢測。 Western blot采用Wes全自動蛋白表達分析系統(tǒng)完成，操作步驟依據(jù)ProteinSimple公司W(wǎng)es檢測試劑盒（12-230kDa）說明完成。采用Compass for SW（3.3.9-0908.1603）軟件分析實驗結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參，進行歸一化分析，以得到蛋白相對表達定量結(jié)果。

1.2.6 iPS分化來源神經(jīng)干細胞的增殖情況 檢測iPS來源神經(jīng)干細胞以0.25%胰酶消化成單個細胞，800r/min離心5min，以N2B27培養(yǎng)基重懸，進行懸浮培養(yǎng)，倒置相差熒光顯微鏡下觀察其生長情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，常規(guī)進行方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步比較采用最小顯著差法（least significant difference，LSD）檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 iPS向神經(jīng)干細胞分化結(jié)果 iPS在飼養(yǎng)層細胞上呈島嶼狀分布，邊緣清晰平滑，表面光滑，結(jié)構(gòu)致密。懸浮培養(yǎng)后，單個細胞增殖為細胞團，逐漸形成具有囊腔的EB；RA誘導(dǎo)后，EB迅速變大；更換為N2B27培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)后，邊緣可見少量有突起的神經(jīng)元樣細胞；在神經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，逐漸分化為神經(jīng)元樣細胞。見圖2。免疫熒光檢測顯示，神經(jīng)干細胞的特異性標(biāo)志物Nestin表達陽性，并且早期神經(jīng)元特異性標(biāo)志物β-tubulinⅢ的表達亦為陽性。見圖3。由此提示，采用N2B27培養(yǎng)基聯(lián)合RA誘導(dǎo)法，可誘導(dǎo)iPS向神經(jīng)干細胞分化，并且得到的神經(jīng)干細胞趨向于神經(jīng)元分化。

圖2 誘導(dǎo)iPS向神經(jīng)干細胞分化過程中細胞形態(tài)變化（100×）Fig.2 Cell morphology changes during the differentiation of iPS into neural stem cells（100×）

圖3 iPS分化來源神經(jīng)干細胞表面標(biāo)志物表達情況（100×）Fig.3 Expression of surface markers on iPS-derived neural stem cells（100×）

2.2 iPS神經(jīng)分化過程中Nestin、β-tubulinⅢ及βcatenin表達 Real-time qPCR結(jié)果提示，iPS向神經(jīng)干細胞分化第12天，神經(jīng)干細胞特異性標(biāo)志物Nestin的mRNA表達較第0天和第6天均顯著升高（P＜0.05，P＜0.05）；早期神經(jīng)元特異性標(biāo)志物β-tubulinⅢ的mRNA表達在第12天較第0天顯著升高（P＜0.05）；Wnt/βcatenin信號通路關(guān)鍵因子β-catenin的mRNA表達在第12天較第6天顯著降低（P＜0.05）。 見圖4。 Western blot結(jié)果提示，Nestin的蛋白表達在第6天較第0天升高（P＜0.05），第12天較第0天和第6天均顯著升高（P＜0.01，P＜0.01）；β-tubulin Ⅲ的蛋白表達在第12天較第0天 和 第6天 均 顯 著 升 高 （P＜0.01，P＜0.01）；βcatenin的蛋白表達在第12天較第0天和第6天均顯著降低（P＜0.01，P＜0.01）。 見圖5。由此可見，在小鼠iPS向神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化過程中，Wnt/β-catenin信號通路受到抑制。

圖4 iPS神經(jīng)分化過程中Nestin、β-tubulinⅢ及β-catenin的mRNA表達Fig.4 The mRNA expression of Nestin， β-tubulin Ⅲ and β-catenin during neural differentiation of iPS

圖5 iPS神經(jīng)分化過程中Nestin、β-tubulinⅢ及β-catenin的蛋白表達Fig.5 The protein expression of Nestin， β-tubulin Ⅲ and β-catenin during neural differentiation of iPS

2.3 各組iPS來源神經(jīng)干細胞增殖能力比較 iPS來源的神經(jīng)干細胞增殖能力檢測提示，與正常組比較，Wnt3a組的類神經(jīng)球較小，DKK-1組和IWR-1組的類神經(jīng)球較大，其中IWR-1組最大，而DKK-1組的類神經(jīng)球較多。見圖6。由此可見，采用Wnt3a處理，上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路得到的神經(jīng)干細胞增殖能力較弱；而采用DKK-1和IWR-1處理，下調(diào)Wnt/βcatenin信號通路得到的神經(jīng)干細胞增殖能力較強。

圖6 iPS來源神經(jīng)干細胞增殖能力（100×）Fig.6 Proliferation ability of iPS-derived neural stem cells（100×）

2.4 各組iPS來源神經(jīng)干細胞分化標(biāo)志物表達比較Real-time qPCR檢測提示，與正常組比較，Wnt3a組Nestin、β-catenin的mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，P＞0.05）；DKK-1和IWR-1組Nestin的mRNA表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.01），β-catenin的mRNA表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.05）。 見圖7。 Western blot結(jié)果提示，與正常組比較，Wnt3a組Nestin的蛋白表達顯著降低（P＜0.01），β-catenin的蛋白表達略升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；DKK-1和IWR-1組Nestin的蛋白表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.01）、β-catenin的蛋白表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.01）。見圖8。由此可見，采用DKK-1和IWR-1下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路可促進iPS向神經(jīng)干細胞分化。

圖7 各組iPS來源神經(jīng)干細胞Nestin及β-catenin mRNA表達比較Fig.7 Comparison of mRNA expression of Nestin and β-catenin in each group of iPS-derived neural stem cells

圖8 各組iPS來源神經(jīng)干細胞Nestin及β-catenin蛋白表達比較Fig.8 Comparison of protein expression of Nestin and β-catenin in each group of iPS-derived neural stem cells

3 討論

iPS已用于多種神經(jīng)退行性疾病的治療研究，特別是阿爾茲海默病和帕金森病等一些全世界公認的疑難病癥的研究，為神經(jīng)退行性疾病的治療帶來了新的希望。本研究采用神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N2B27聯(lián)合RA進行分步程序誘導(dǎo)，獲得的細胞表達神經(jīng)干細胞標(biāo)志物Nestin，同時還表達了早期神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物β-tubulinⅢ，提示成功地將小鼠iPS定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細胞。

近年來，科學(xué)家們致力于探討iPS向神經(jīng)干細胞分化的機制，尋找提高分化效率與功能的靶點與方法[11]。研究顯示，Wnt信號通路在干細胞的神經(jīng)分化過程中發(fā)揮重要作用[12-13]，如Slawny等[14]發(fā)現(xiàn)，Wnt/βcatenin信號通路參與了調(diào)控ES向神經(jīng)細胞分化。Wnt/β-catenin信號通路是影響細胞生物學(xué)行為的重要信號通路之一，其中胞質(zhì)內(nèi)效應(yīng)分子β-catenin是關(guān)鍵因子，該通路的信號傳遞取決于胞質(zhì)中游離β-catenin的水平[8-9]。本研究提示，iPS誘導(dǎo)分化過程中β-catenin的表達水平均顯著降低，說明在分化過程中Wnt/βcatenin信號通路受到抑制。

本研究進一步探討了Wnt/β-catenin信號通路在iPS向神經(jīng)干細胞分化中的作用。Wnt3a是外源的Wnt重組蛋白，可以和細胞膜表面的Wnt受體結(jié)合，啟動Wnt信號通路。本研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a處理后，β-catenin表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與其能同時激活經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt信號通路有關(guān)[8]；同時，結(jié)果顯示W(wǎng)nt3a處理后，Nestin mRNA表達無明顯變化，而蛋白表達降低，蛋白和mRNA表達并不完全一致，可能是由于基因表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時間和位點存在差異，而且存在轉(zhuǎn)錄后加工及翻譯后修飾等多方面原因，具體機制需進一步探討。DKK-1是一種分泌型的Wnt配體拮抗劑[15]，它可以與Wnt受體之一的單跨膜受體低密度脂蛋白相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein-related proteins 5/6，LRP5/6）結(jié)合，從而競爭性抑制Wnt/βcatenin信號通路。Ren等[16]研究報道，DKK-1在胚胎發(fā)育、神經(jīng)再生、突觸發(fā)生等方面都起著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)在iPS向神經(jīng)干細胞分化過程中，DKK-1處理后β-catenin表達降低，Nestin表達增加。IWR-1可以增強β-catenin降解復(fù)合體中的Axin的穩(wěn)定性，從而起到促進β-catenin降解的作用[17]。與DKK-1作用類似，本研究中IWR-1處理后，β-catenin表達降低，Nestin表達增加。相關(guān)報道顯示，激活Wnt信號通路會誘導(dǎo)多能干細胞分化為中胚層和內(nèi)胚層的細胞[18]。例如Woll等[19]研究發(fā)現(xiàn)，激活Wnt/β-catenin信號通路可以促進人的多能干細胞分化為早期的造血祖細胞；Nakashima等[20]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路激活可促進小鼠ES和人iPS分化為胰腺β細胞，而降低向神經(jīng)細胞分化的概率。Raitano等[21]對癡呆癥患者來源的iPS進行神經(jīng)分化誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路異常激活，而加入Wnt/β-catenin信號通路抑制劑I-WP2抑制β-catenin的表達后，神經(jīng)分化有所恢復(fù)。由此說明，本研究中DKK-1和IWR-1抑制了Wnt/βcatenin信號通路，從而促進了iPS向神經(jīng)干細胞分化。

綜上所述，本研究采用N2B27培養(yǎng)基聯(lián)合RA誘導(dǎo)法，成功誘導(dǎo)了小鼠iPS向神經(jīng)干細胞分化，并證明Wnt/β-catenin信號通路在小鼠iPS向神經(jīng)干細胞誘導(dǎo)分化過程中受抑制；采用DKK-1和IWR-1下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路，可促進iPS向神經(jīng)干細胞分化，提高iPS來源神經(jīng)干細胞的增殖能力，提示W(wǎng)nt/βcatenin信號通路在小鼠iPS神經(jīng)干細胞分化過程中具有負調(diào)控的作用。