唐云佳 黃幸鴿 顏曉寧 袁小鳳

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.，F(xiàn).thunbergii）為浙江省道地藥材“浙八味”之一，主產(chǎn)于寧波，其鱗莖具有清熱化痰、止咳、開(kāi)郁、散結(jié)之功，臨床用量極大[1]。 貝母素甲（C27H45NO3）及貝母素乙（C27H43NO3）都屬于生物堿，是浙貝母的藥效指標(biāo)之一，2020版《中國(guó)藥典》規(guī)定，干品浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的含量不能低于0.080%[2]。一般來(lái)說(shuō)，生物堿含量會(huì)隨著季節(jié)性因素產(chǎn)生相應(yīng)的改變[3]，然而浙貝母生物堿的含量變化情況迄今未知。

植物的特性主要與其生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)，尤其是對(duì)于根莖類藥材，根際微環(huán)境對(duì)于其生理狀態(tài)的塑造具有重要作用[4]。由于根際微生物在碳氮循環(huán)方面的作用，使得根際微環(huán)境對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)、健康以及質(zhì)量具有重要意義[5]。已有研究表明，根際微生物的存在能夠引導(dǎo)植物生物堿的合成，如將織片草螺菌接種于狗尾草根部后，固定菌株定植的根中參與吲哚生物堿合成的化合物增多[6]；罌粟的細(xì)胞培養(yǎng)物無(wú)法組成性地積累生物堿，而是依賴于某些微生物所提供的酶類或輔因子[7]。這些均表明，微生物對(duì)于植物生物堿的積累具有重要價(jià)值。

浙貝母作為一種傳統(tǒng)中藥材，其藥物潛力被不斷發(fā)掘并應(yīng)用，為了提高藥物質(zhì)量，對(duì)于浙貝母有效成分生物堿的質(zhì)量控制十分必要。因此，本研究以浙貝母根際土壤中的微生物為研究對(duì)象，借助高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)浙貝母根際土壤微生物組成的多樣性，分析其變化規(guī)律；以分光光度法及高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)分析（high performance liquid chromatography-evaporative lightscattering detection，HPLCELSD）分別檢測(cè)浙貝母不同生長(zhǎng)期生物堿及單體堿的含量；并結(jié)合土壤理化性質(zhì)，探討浙貝母整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤微生物多樣性變化與生物堿含量之間的相關(guān)性，為道地藥材浙貝母的科學(xué)生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集 選擇江蘇南通、浙江寧波和磐安為浙貝母種植基地，每個(gè)基地均用同樣的土壤種植3個(gè)種源（南通種源、寧波種源、磐安種源），于10月開(kāi)始種植，次年1月25日左右開(kāi)始出苗，分別于浙貝母苗期、花期和收獲期按5點(diǎn)取樣法采集土壤及鱗莖，每個(gè)樣品重復(fù)取樣3次，樣品具體代碼見(jiàn)表1。所有新鮮土壤過(guò)20目篩，去掉其中的石頭和動(dòng)植物殘?jiān)?，裝入無(wú)菌收集管中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存?zhèn)溆?；所得到的鱗莖，帶回洗凈后生曬切片，烘干待用。

表1 樣品代碼及含義Tab.1 Sample code and meaning

1.2 試劑和儀器 浙貝母藥材由浙江省中藥研究所俞旭平教授鑒定，為百合科植物浙貝母（F.thunbergii）的鱗莖。貝母素甲和貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢所（批號(hào)：110750-200608、110751-200608）；E.Z.N.A.?Soil DNA Kit購(gòu)于Omega公司（批號(hào)：00M56350 20000C02Q003）；Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Life公司（批號(hào)：1759393）；Agencourt AMPure XP磁珠購(gòu)于Beckman公司（批號(hào)：14403400）；其他無(wú)機(jī)鹽和有機(jī)溶劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。PHS 3C型氫離子濃度指數(shù)（hydrogen ion concentration，pH）計(jì)為鄭州寶晶電子科技有限公司產(chǎn)品；S22PC型可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于上海棱光技術(shù)有限公司；Agilent 1100型液相色譜儀為Agilent Technologies有限公司產(chǎn)品。

1.3 土壤樣品理化性質(zhì)測(cè)定 以pH計(jì)檢測(cè)質(zhì)量體積比1:2.5的土壤與水溶液的pH值，通過(guò)重鉻酸鹽消化測(cè)定有機(jī)質(zhì)含量，以磷酸苯二鈉比色法測(cè)定土壤磷酸酶的活性[8]，以靛酚比色法測(cè)定土壤脲酶活性[9]。

1.4 鱗莖總生物堿及單體堿含量的測(cè)定 取浙貝母樣品粉末約2.000g，按藥典方法制備供試品溶液[2]。采用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度（absorbance，A）值，根據(jù)所得線性方程計(jì)算樣品中總生物堿的含量。

貝母素甲和貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品以0.05%鹽酸甲醇溶液溶解，分別制成對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液6、10、15μL，供試品溶液5～15μL，以液相色譜儀檢測(cè)。用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程分別計(jì)算貝母素甲、貝母素乙的含量[2]。

1.5 土壤基因組DNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及測(cè)序 作為道地產(chǎn)區(qū)的寧波，其土壤理化性質(zhì)具有一定的代表性，也賦予了浙貝母得天獨(dú)厚的生長(zhǎng)環(huán)境，因此本研究以道地產(chǎn)區(qū)寧波為代表，研究浙貝母根際微生物。使用Omega E.Z.N.A.?Soil DNA Kit試劑盒提取土壤基因組DNA。 上游引物5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’， 下游引物5’-GCCTCCCTCGCGCATCAGNNNNNNNNNNCATGCTGCC TCCCGTAGGAGT-3’。以土壤基因組DNA為模板，對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用0.6倍的磁珠純化回收DNA，以Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒精確定量DNA[10]。依照既往研究的方法，提取土壤真菌基因組DNA，并按照其反應(yīng)體系和條件對(duì)真菌進(jìn)行擴(kuò)增[11]。每個(gè)樣品DNA量取10ng，上機(jī)進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

1.6 數(shù)據(jù)處理 采用焦磷酸測(cè)序方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類和豐度分析。運(yùn)算的分類單元（operational taxonomic units，OTUs）、Chao1指數(shù)、基于豐度的覆蓋率估計(jì)值（abundance-based coverage estimator，ACE）是生境內(nèi)菌群豐度的評(píng)估指標(biāo)，Shannon指數(shù)是生境內(nèi)菌群多樣性的評(píng)估指標(biāo)。具體處理方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Excel及Origin 8.0軟件作圖。 計(jì)量資料以±s表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同生長(zhǎng)期浙貝母根際土壤理化性質(zhì)的變化 為研究土壤因子與生物堿的關(guān)系，將3個(gè)種源用同一類型的土壤培養(yǎng)，研究不同發(fā)育期之間土壤理化性質(zhì)的差異。見(jiàn)圖1。南通的根際土壤pH均在7.36～8.21之間，偏堿性；而浙江兩地的pH均在7.0以下，偏酸性。盡管不同時(shí)期的pH動(dòng)態(tài)變化規(guī)律不同，但隨著浙貝母的生長(zhǎng)，土壤pH均逐漸上升。見(jiàn)圖1A。有機(jī)質(zhì)含量表現(xiàn)為先下降后上升，整體呈上升趨勢(shì)，只有寧波種源在本地種植表現(xiàn)為先升后降。見(jiàn)圖1B。脲酶活性在浙貝母的生長(zhǎng)過(guò)程中呈下降的趨勢(shì)。見(jiàn)圖1C。磷酸酶活性的動(dòng)態(tài)變化均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，與脲酶活性的變化趨勢(shì)基本相同。見(jiàn)圖1D。總的來(lái)說(shuō)，隨著浙貝母的生長(zhǎng)，土壤pH逐漸上升；有機(jī)質(zhì)含量先下降后上升；而脲酶和磷酸酶活性則先上升后下降。作為道地產(chǎn)區(qū)，寧波的脲酶活性和磷酸酶活性均最高，表現(xiàn)出較好的土壤肥力。三個(gè)產(chǎn)區(qū)比較，浙江兩地的土壤理化性質(zhì)也更為相似。

圖1 不同發(fā)育期的浙貝母土壤理化性質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化圖Fig.1 Dynamic changes of soil physical and chemical properties of F.thunbergii in different developmental stages

2.2 不同生長(zhǎng)期浙貝母總生物堿及單體堿含量變化 隨著浙貝母的生長(zhǎng)，總生物堿及單體堿的含量均明顯下降，收獲期達(dá)到最低水平，種源、產(chǎn)地和生長(zhǎng)期的不同均不會(huì)改變浙貝母總生物堿含量的變化趨勢(shì)。在浙貝母的生長(zhǎng)早期，貝母素乙所占的比重大于貝母素甲，然而隨著鱗莖的生長(zhǎng)貝母素甲的絕對(duì)含量雖然下降，但其相對(duì)含量卻逐漸增加最終超過(guò)貝母素乙，表明貝母素乙比貝母素甲損失得更快。見(jiàn)圖2。

圖2 浙貝母生長(zhǎng)期內(nèi)總生物堿及單體堿含量柱狀圖Fig.2 Histogram of total alkaloid and monomer alkaloid content during the growth period of F.thunbergii

2.3 部分土壤理化性質(zhì)與生物堿含量的相關(guān)性分析 對(duì)土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量、脲酶和磷酸酶活性與總生物堿、單體堿含量進(jìn)行相關(guān)性分析。研究發(fā)現(xiàn)，貝母素甲與貝母素乙、貝母素甲與貝母素甲乙之和、貝母素乙與貝母素甲乙之和、貝母素甲與總生物堿含量、貝母素乙與總生物堿含量、貝母素甲乙之和與總生物堿含量均呈正相關(guān)（r=0.51、0.76、0.95、0.60、0.89、0.90，P＜0.01），說(shuō)明浙貝母中其他的單體堿與貝母素甲和貝母素乙的合成同步。此外，貝母素乙與有機(jī)質(zhì)含量、總生物堿與有機(jī)質(zhì)含量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.63、-0.53，P＜0.01）；土壤中脲酶與磷酸酶的活性呈正相關(guān)（r=0.47，P＜0.05），有機(jī)質(zhì)含量與脲酶活性、pH與磷酸酶活性呈負(fù)相關(guān)（r=-0.45，P＜0.05；r=-0.78，P＜0.01）。 見(jiàn)表2。說(shuō)明在浙貝母生長(zhǎng)初期土壤中酶活性越高，微生物活動(dòng)越頻繁，從而導(dǎo)致土壤pH及有機(jī)質(zhì)含量下降。

表2 土壤理化性質(zhì)與生物堿含量的Pearson相關(guān)性分析Tab.2 Pearson correlation analysis of soil physical and chemical properties and alkaloid content

2.4 浙貝母土壤微生物多樣性分析 從浙貝母際土壤樣本中共檢測(cè)到39 157條序列，分類和豐度分析見(jiàn)表3，其中83%屬于細(xì)菌，17%屬于真菌，表明浙貝母根際土壤中細(xì)菌的豐度遠(yuǎn)高于真菌。不同時(shí)期根際細(xì)菌的豐度顯示，OTUs、Chao1指數(shù)、ACE差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著浙貝母生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，表明根際細(xì)菌豐度和種類隨浙貝母的生長(zhǎng)而下降。而Shannon指數(shù)的排序結(jié)果與以上的豐度排序完全吻合，說(shuō)明根際土壤中菌群多樣性和均勻度水平也隨浙貝母的生長(zhǎng)而下降。根際真菌豐度和多樣性隨浙貝母的生長(zhǎng)均呈現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)，但Shannon指數(shù)卻總體上升，表明根際土壤中真菌豐度雖然減少，但多樣性反而增加。值得注意的是，在苗期和花期并無(wú)檢測(cè)到曲霉屬的存在，而在收獲期檢測(cè)到了曲霉屬，且其豐度排名為優(yōu)勢(shì)屬前20。

表3 浙貝母各生長(zhǎng)期根際土壤微生物多樣性分析Tab.3 Microbial diversity in rhizosphere soil of F.thunbergii in different growth stages

2.5 微生物群落的動(dòng)態(tài)變化及優(yōu)勢(shì)菌群分析 在所有浙貝母根際土壤樣本中共檢測(cè)到32門細(xì)菌。見(jiàn)圖3A。優(yōu)勢(shì)菌群分析發(fā)現(xiàn)，浙貝母土壤中主要包括變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門及綠彎菌門，它們占土壤細(xì)菌近90%。隨著浙貝母的生長(zhǎng)，變形菌門及酸桿菌門在根際土中的優(yōu)勢(shì)逐漸削弱，而放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門的優(yōu)勢(shì)則逐漸增強(qiáng)，尤其在收獲期這些門的種類增加比較顯著。相比之下，綠彎菌門的變化不太明顯，再次證明浙貝母的生長(zhǎng)對(duì)根際微生物有著重要影響。

在所有樣本中共檢測(cè)到10門真菌。見(jiàn)圖3B。其中子囊菌門是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)門（87%～90%），而其他真菌如毛霉亞門、壺菌門以及擔(dān)子菌門等真菌僅占10%～13%。在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，子囊菌門的豐度持續(xù)上升，毛霉亞門以及壺菌門豐度先下降后升高，而擔(dān)子菌門以及Fungi_incertae_sedis豐度則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。

圖3 浙貝母生長(zhǎng)期內(nèi)根際土壤微生物門水平群落結(jié)構(gòu)組分圖Fig.3 Composition map of horizontal community structure of microbial phyla in rhizosphere soil during the growth period of F.thunbergii

利用焦磷酸測(cè)序共檢測(cè)到了浙貝母土壤中694個(gè)屬，在排名前20的優(yōu)勢(shì)屬中Nitrosomonadaceae-uncultured、Gemmatimonadaceae-uncultured 及 Methylocystaceae-uncultured隨著浙貝母的生長(zhǎng)其種類逐漸減少，這些細(xì)菌種類的變化趨勢(shì)與生物堿含量的變化趨勢(shì)完全相同，說(shuō)明它們可能與生物堿合成密切相關(guān)。

2.6 生物堿與微生物多樣性的相關(guān)性分析 對(duì)浙貝母3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的土壤理化性質(zhì)、生物堿含量、微生物豐度指數(shù)Chao1以及微生物多樣性指數(shù)Shannon進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果表明，總生物堿含量和單體堿含量與細(xì)菌Chao1指數(shù)呈正相關(guān)（r=0.92、0.87，P＜0.01），但與真菌Chao1指數(shù)無(wú)相關(guān)關(guān)系（r=0.22、0.46，P＞0.05）；總生物堿含量和單體堿含量與細(xì)菌Shannon指 數(shù)也呈正相關(guān)（r=0.96、0.87，P＜0.01），但與真菌Shannon指數(shù)無(wú)相關(guān)關(guān)系（r=0.17、0.11，P＞0.05）。 見(jiàn)表4。以上結(jié)果表明根際細(xì)菌的確與生物堿合成有著密切聯(lián)系，甚至直接影響總生物堿及單體堿合成。此外，有機(jī)質(zhì)含量與細(xì)菌及真菌Chao1指數(shù)均呈正相關(guān)（r=0.68、0.70，P＜0.05），表明真菌和細(xì)菌對(duì)土壤養(yǎng)分起著活化作用，通過(guò)有機(jī)質(zhì)含量的改變間接影響著生物堿的含量。

表4 浙貝母生物堿與微生物多樣性之間相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between alkaloids of F.thunbergii and microbial diversity

3 討論

為了探索土壤微環(huán)境對(duì)浙貝母生長(zhǎng)和品質(zhì)的影響，本研究從分子微生態(tài)學(xué)角度分析不同產(chǎn)區(qū)、不同種源及不同生長(zhǎng)時(shí)期的浙貝母土壤理化性質(zhì)與根際微生物及生物堿合成的關(guān)系。研究結(jié)果表明，將不同種源的浙貝母種植在同一種土壤中，隨著浙貝母的生長(zhǎng)，土壤pH逐漸上升，有機(jī)質(zhì)含量先下降后上升，而脲酶和磷酸酶活性則先上升后下降。浙貝母的土壤性質(zhì)均表現(xiàn)出產(chǎn)區(qū)差異及種源差異，產(chǎn)區(qū)間差異遠(yuǎn)大于種源內(nèi)差異，這表明產(chǎn)區(qū)的外環(huán)境對(duì)浙貝母的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生直接的影響。與土壤性質(zhì)表現(xiàn)出產(chǎn)區(qū)、種源差異不同，浙貝母生長(zhǎng)期內(nèi)總生物堿及單體堿含量呈一致的減少趨勢(shì)，這與藜蘆中甾體生物堿含量的變化相似[12]，表明種源、產(chǎn)地和生長(zhǎng)期均不會(huì)影響浙貝母總生物堿含量的變化趨勢(shì)。土壤理化性質(zhì)與生物堿Pearson相關(guān)性分析顯示，浙貝母中其他單體堿與貝母素甲和貝母素乙的合成同步，其合成皆與土壤有機(jī)質(zhì)含量密切相關(guān)。浙貝母生長(zhǎng)初期，土壤中酶活性越高，微生物活動(dòng)越頻繁，導(dǎo)致有機(jī)質(zhì)含量下降。由此推測(cè)，土壤有機(jī)質(zhì)含量的下降導(dǎo)致了總生物堿及單體堿含量減少。

研究發(fā)現(xiàn)，隨著浙貝母的生長(zhǎng)，生物堿含量、細(xì)菌豐度及多樣性指數(shù)均呈下降趨勢(shì)。Pearson相關(guān)性分析顯示，細(xì)菌多樣性與浙貝母總生物堿及單體堿含量呈正相關(guān)，說(shuō)明生物堿含量與土壤細(xì)菌群落密切相關(guān)，和前期研究結(jié)果一致[13]。研究表明，細(xì)菌能夠引導(dǎo)生物堿的合成[14]。Caputi等[15]用生物合成法合成兩種酶，前二酮乙酸酯合成酶（precondylocarpine acetate synthase，PAS）和二氫前骨節(jié)心蛤堿合成酶（dihydroprecondylocarpine synthase，DPAS），從而實(shí)現(xiàn)了馬達(dá)加斯加長(zhǎng)春花中抗癌藥物長(zhǎng)春堿的生物合成。以上研究證明植物生長(zhǎng)過(guò)程中缺少一些必需酶類，影響生物堿合成，而細(xì)菌可以提供這些必需酶類，使得生物堿合成代謝能夠正常進(jìn)行。本研究中根際細(xì)菌多樣性的減少，可能使得浙貝母中依賴于細(xì)菌的生物堿合成途徑受阻，導(dǎo)致生物堿含量持續(xù)減少，具體還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。值得注意的是，優(yōu)勢(shì)屬中Nitrosomonadaceae-uncultured、Gemmatimonadaceae-uncultured及Methylocystaceae-uncultured的變化趨勢(shì)與生物堿含量的變化趨勢(shì)完全相同，而這些優(yōu)勢(shì)菌分別具有硝化作用[16]、幾丁質(zhì)降解作用[17]和甲烷氧化作用[18]，這些優(yōu)勢(shì)屬的減少導(dǎo)致相關(guān)生物學(xué)作用的減弱，從而影響生物堿的合成。貝母中單體堿合成需要氮元素，而含氮有機(jī)物大多需要經(jīng)過(guò)細(xì)菌的分解才能被植物利用。因此，單體堿含量的下降以及有機(jī)質(zhì)代謝減緩很可能與浙貝母根際酸桿菌門以及變形桿菌門等氮元素代謝相關(guān)細(xì)菌含量的減少有關(guān)。

研究顯示，真菌是生物堿合成的重要因素之一[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著浙貝母的生長(zhǎng)，根際土壤中真菌豐度和多樣性均呈現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)，而Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明生物堿含量與土壤真菌多樣性之間無(wú)相關(guān)性。值得注意的是，在苗期和花期并無(wú)檢測(cè)到曲霉屬真菌的存在，而在收獲期檢測(cè)到了曲霉屬，且其豐度占據(jù)優(yōu)勢(shì)屬前20。前期研究已證實(shí)，曲霉屬真菌是浙貝母中的主要內(nèi)生真菌[20]。正如鐮刀菌屬真菌等是川貝母鱗莖中產(chǎn)生生物堿的內(nèi)生真菌一樣[21]，曲霉屬真菌在收獲期根際土中出現(xiàn)，可能與浙貝母生物堿的合成存在一定的關(guān)系，其內(nèi)在聯(lián)系還需進(jìn)一步研究。

由于本研究?jī)H使用道地產(chǎn)區(qū)寧波產(chǎn)區(qū)的浙貝母根際土壤進(jìn)行微生物多樣性分析，樣品批次偏少，存在著一定的局限性，但結(jié)合早期研究結(jié)果[13]，本研究仍能說(shuō)明隨著浙貝母的生長(zhǎng)，細(xì)菌多樣性與浙貝母生物堿含量之間呈正相關(guān)。此外，Pearson相關(guān)性分析以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析結(jié)果暗示了根際細(xì)菌對(duì)于浙貝母生物堿合成的促進(jìn)作用，提示可以通過(guò)添加菌肥，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量及細(xì)菌多樣性來(lái)增加浙貝母生物堿的含量，從而提高浙貝母品質(zhì)，接下來(lái)的研究重點(diǎn)將放在與生物堿合成相關(guān)的特異菌群的篩選和機(jī)制研究等方面。