田照輝 徐紹剛 董穎 胡紅霞 王巍 東天 孫愛(ài)

摘要：為了篩選適合漁用微生態(tài)制劑的益生菌，從池塘邊發(fā)酵魚(yú)肉湯中分離芽孢桿菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征、16S rRNA及gyrA、gyrB、rpoB和purH基因序列比對(duì)分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)蛋白酶能力及生長(zhǎng)情況進(jìn)行研究。結(jié)果表明，分離篩選的6株芽孢桿菌分屬于4個(gè)種，1株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），1株為阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai），2株為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），2株為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），6株菌在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，均具有產(chǎn)蛋白酶能力，其中4株具有產(chǎn)淀粉酶能力。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌;分離鑒定;生物學(xué)特性;產(chǎn)淀粉酶能力;產(chǎn)蛋白酶能力

中圖分類號(hào)： S917.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2021）13-0157-05

一直以來(lái)，抗生素和藥物殘留是食品安全的重要威脅，2018年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織制定了《獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)試點(diǎn)工作方案》，推行減抗行動(dòng)。微生態(tài)制劑能夠提高動(dòng)物的免疫力和生產(chǎn)性能，為綠色飼料添加劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，微生態(tài)制劑還能有效調(diào)控水質(zhì)，是實(shí)現(xiàn)高效綠色養(yǎng)殖模式的有效措施之一[1]。

芽孢桿菌是一類重要的微生態(tài)制劑，可以形成芽孢，耐高溫，具有較強(qiáng)的生存能力。在缺乏營(yíng)養(yǎng)或不良環(huán)境時(shí)，芽孢桿菌可以生成芽孢來(lái)增強(qiáng)抗逆性進(jìn)入消化道，調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制病原菌生長(zhǎng)。芽孢桿菌還能促進(jìn)機(jī)體免疫器官及組織的成熟，可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，從而提高機(jī)體的體液免疫、細(xì)胞免疫水平，芽孢桿菌在動(dòng)物、人體的微生態(tài)調(diào)節(jié)中得到了高度重視和廣泛應(yīng)用，是較好的微生態(tài)制劑菌種[2]。劉文亮等在飼料中添加蠟樣芽孢桿菌投喂凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei），發(fā)現(xiàn)可以改變凡納濱對(duì)蝦的腸道微生物組成，提高其生長(zhǎng)速度，增強(qiáng)其抗病能力[3]，將蠟樣芽胞桿菌添加到凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中，可以提高凡納濱對(duì)蝦抗白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）和感染能力[4]。孫盛明等在飼料中添加枯草芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)能夠提高團(tuán)頭魴幼魚(yú)的生長(zhǎng)性能、抗氧化能力并改變其腸道菌群結(jié)構(gòu)[5]。張歡歡等在生物絮團(tuán)對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中添加其分離到的芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)能夠改善菌群結(jié)構(gòu)，抑制弧菌生長(zhǎng)[6]。芽孢桿菌、乳酸菌益生菌在卡他扇貝（Argopecten ventricosus）早期發(fā)育過(guò)程中能夠促進(jìn)卡他扇貝生長(zhǎng)、抵抗溶藻弧菌病[7]。在飼料中添加枯草芽孢桿菌后，草魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）腸道和肝胰臟消化酶的活性顯著提高，腸道芽孢桿菌、假單胞菌數(shù)量極顯著提高，致病性弧菌、大腸稈菌數(shù)量極顯著減少[8]。芽孢桿菌能產(chǎn)生胞外酶，如高蛋白酶、高淀粉酶活性，可以高效降解養(yǎng)殖殘餌中的蛋白和淀粉，改善修復(fù)養(yǎng)殖環(huán)境。將芽孢桿菌類應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，進(jìn)行水質(zhì)調(diào)控，還可作為有害菌的拮抗菌替代或減少抗生素的使用。枯草芽孢桿菌 HAINUP40可顯著降低水體中的亞硝酸鹽、氨氮和化學(xué)需氧量，不僅可以作為水質(zhì)改良劑改善水體環(huán)境，還可作為飼料添加劑提高羅非魚(yú)的疾病抵抗力，預(yù)防無(wú)乳鏈球菌疾病的發(fā)生[9]。短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）能夠抑制多種水產(chǎn)病原菌，對(duì)水體環(huán)境的耐受能力強(qiáng)，具有防治水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的應(yīng)用潛力[10]。高艷俠等篩選的貝萊斯芽孢桿菌具有較強(qiáng)的廣譜拮抗水產(chǎn)常見(jiàn)病原菌功能，能有效抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類常見(jiàn)病原菌如無(wú)乳鏈球菌、 海豚鏈球菌等[11]。張皎皎等篩選的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制效果顯著[12]。

有益微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能有效改善水質(zhì)，其應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但仍存在一些問(wèn)題，如有些菌種的效果不高，穩(wěn)定性差，不能快速成為優(yōu)勢(shì)菌群等[13]，微生態(tài)制劑菌種還具有種屬特異性和地域性，一般從微生物生活的環(huán)境中分離和篩選特定功能益生菌，因此從相應(yīng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境分離菌株，用于篩選水產(chǎn)微生態(tài)制劑菌種更具有合理性[14-16]。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

2018年夏將池塘中零星死亡的魚(yú)收集起來(lái)，在塘邊煮成肉糜，任其自然發(fā)酵，待發(fā)酵肉湯無(wú)色無(wú)臭后，取回至北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種分離。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L氯化鈉、2%瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌 15 min ，倒平板上備用[17]。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株篩選培養(yǎng)基 12 g/L脫脂奶粉、20 g/L營(yíng)養(yǎng)瓊脂，113 ℃高壓滅菌15 min，倒平板上備用。

1.2.3 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選培養(yǎng)基 可溶性淀粉 5 g/L、氯化鈉5 g/L、pH值7.2，將除瓊脂外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH值，加入2%瓊脂粉，于115 ℃高壓滅菌15 min，倒平板備用。

1.3 菌種分離

在無(wú)菌條件下，于滅菌后的三角瓶中加入 90 mL 無(wú)菌水和10 mL發(fā)酵肉湯，混勻后取10 mL懸浮液置于無(wú)菌試管中，在80 ℃保溫15 min殺死非芽孢菌體，之后取1 mL進(jìn)行梯度稀釋制成懸液，濃度依次為發(fā)酵肉湯原液的10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分別取50 μL各稀釋液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑選單菌落，傳代3次以上，待菌落穩(wěn)定后，挑取單菌落用營(yíng)養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)24 h，進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色，在顯微鏡下觀察，選取有芽孢的G+菌，滅菌甘油保存于-80 ℃。

1.4 生理生化鑒定

利用HIBacillusTM Identification Kit和參照微生物試驗(yàn)中的糖酵解試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.5 分離純化芽孢菌株產(chǎn)蛋白酶活力和產(chǎn)淀粉酶活力測(cè)定

挑選單菌落點(diǎn)種于“1.2.2”節(jié)所述培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)17 h，取出后4 ℃放置6 h，以芽孢桿菌利用底物產(chǎn)生透明圈直徑和菌體直徑的比值表示產(chǎn)酶活性。

挑選單菌落點(diǎn)種于“1.2.3”節(jié)所述培養(yǎng)基，于30 ℃恒溫培養(yǎng)17 h，取出后4 ℃放置6 h，滴加魯哥氏碘液顯色，以芽孢桿菌利用底物產(chǎn)生透明圈直徑和菌體直徑的比值表示產(chǎn)酶活性。

1.6 分子生物學(xué)鑒定

挑選純化的菌株參照曹鳳明等的方法[17-18]設(shè)計(jì)引物，將純化的菌株送北京擎科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行16S rRNA、gyrA、gyrB、rpoB、purH基因測(cè)序，測(cè)序引物序列見(jiàn)表1。

1.7 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將保存的芽孢桿菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上復(fù)蘇，挑單克隆在LB培養(yǎng)基中于37 ℃、150 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，將過(guò)夜培養(yǎng)的芽孢桿菌按1%的量接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h使用伯樂(lè)（Bio-Rad）公司的SmartSpec Plus分光光度計(jì)檢測(cè)菌液D600 nm，以測(cè)定D600 nm為縱坐標(biāo)、以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩，選取6株分離得到的菌株，將其編號(hào)為2019B1～2019B6，各菌株的菌落形態(tài)、革蘭氏染色和芽孢產(chǎn)生情況見(jiàn)表2。

2.2 生理生化反應(yīng)的鑒定

利用芽孢桿菌鑒定試劑盒HIBacillusTM Identification Kit的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3，糖酵解試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3 產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶活性

用透明圈直徑/菌落直徑的值表示產(chǎn)酶能力[19]。由表5可以看出，6株菌株均具有產(chǎn)蛋白酶能力，其中2019B1和2019B6產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng);2019B2、2019B6無(wú)產(chǎn)淀粉酶能力，其他4株具有產(chǎn)淀粉酶能力，其中2019B5產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)。

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

將各菌株的16S rRNA核苷酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)每株都有多個(gè)與其同源性達(dá)99%以上的種，選取GenBank中與6株菌株同源性高的菌株的模式菌株的16S rRNA序列，用MEGA 6軟件進(jìn)行同源性比對(duì)并構(gòu)建鄰接（NJ）樹(shù)，自展次數(shù)為1 000次（圖1）。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可見(jiàn)，2019B1與蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）聚為一支，2019B2與阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai）聚為一支，2019B3、2019B4與貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）聚為一支，2019B5、2019B6與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）聚為一支。

除利用16S rRNA序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)外，還對(duì)各菌株進(jìn)行g(shù)yrA、gyrB、rpoB和purH基因的測(cè)序，并在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)2019B1的purH基因序列比對(duì)結(jié)果為蠟樣芽孢桿菌，2019B3、2019B4的gyrA、purH基因序列的比對(duì)結(jié)果分別為貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌，rpoB基因序列的比對(duì)結(jié)果均為貝萊斯芽孢桿菌，2019B5的gyrA基因序列比對(duì)結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌，2019B6的rpoB、purH基因序列比對(duì)結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌。

2.5 菌株鑒定結(jié)果

結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果可知，2019B1為蠟樣芽孢桿菌（B. cereus），2019B2為阿氏芽孢桿菌（B. aryabhattai），2019B3、2019B4為貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis），2019B5和2019B6為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

2.6 生長(zhǎng)曲線

由圖2可以看出，6株芽孢桿菌均能在37 ℃的LB液體培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)，達(dá)到較高濃度。其中，2019B2長(zhǎng)勢(shì)最好，培養(yǎng)13 h時(shí)已接近穩(wěn)定期;2019B1、2019B2在培養(yǎng)2 h時(shí)就開(kāi)始進(jìn)入快速增長(zhǎng)期， 在培養(yǎng)6.3 h后濃度增長(zhǎng)放緩， 2019B1尤其明顯;2019B4在培養(yǎng)4 h才開(kāi)始生長(zhǎng)，并逐漸結(jié)束遲緩期，在培養(yǎng)6.3 h進(jìn)入快速生長(zhǎng)期;2019B6的生長(zhǎng)情況比較平穩(wěn)，2019B3、2019B5的生長(zhǎng)曲線比較一致，在培養(yǎng)4 h內(nèi)和2019B6的長(zhǎng)勢(shì)相似，培養(yǎng)2 h內(nèi)為遲緩期，培養(yǎng)2～4 h時(shí)生長(zhǎng)開(kāi)始增快，培養(yǎng)4 h后2019B3、2019B5快速增長(zhǎng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)2019B6。

3 討論與結(jié)論

枯草芽孢桿菌于1835年被正式命名，隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌是一個(gè)表型相似近緣種群（簡(jiǎn)稱枯草群），其形態(tài)特征和生理生化特征是早期進(jìn)行各種群分類與鑒定的基礎(chǔ)，16S rRNA基因含有豐富的信息量，已經(jīng)成為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，但是將分離篩選的菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列同源性檢索時(shí)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中幾種芽孢桿菌的同源性達(dá)99%以上，這是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌是一個(gè)表型相似近緣種群（簡(jiǎn)稱枯草群），枯草群多個(gè)種類的16S rRNA基因序列相似性均在99.5%以上，目前NCBI（美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，16S rRNA、gyrB、gyrA、rpoB、 purH等基因已涵蓋了枯草群的各個(gè)種，可利用這些基因進(jìn)行相關(guān)菌株的鑒定和鑒別[18]，因此本研究在分離篩選芽孢桿菌時(shí)，不僅進(jìn)行了生理生化鑒定，還進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，在進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定時(shí)除進(jìn)行16S rRNA測(cè)序建樹(shù)，各菌株還進(jìn)行了gyrA、gyrB、rpoB和purH基因的測(cè)序同源比對(duì)，將傳統(tǒng)方法與分子生物學(xué)方法相結(jié)合，互為補(bǔ)充和驗(yàn)證。

在生產(chǎn)過(guò)程中微生態(tài)制劑對(duì)于篩選益生菌尤其關(guān)鍵，種屬特異性是篩選合適益生菌的一個(gè)先決條件，不同來(lái)源的芽孢桿菌在不同動(dòng)物胃腸道內(nèi)的黏附繁殖能力及相關(guān)生理功能有所不同[16]。水產(chǎn)養(yǎng)殖戶在池邊將零星死亡的魚(yú)煮成肉糜自然發(fā)酵，待其無(wú)臭無(wú)味后潑灑使用，能有效地改善水質(zhì)，池塘養(yǎng)殖魚(yú)未出現(xiàn)不良反應(yīng)，說(shuō)明發(fā)酵后的魚(yú)肉湯是安全的，可能含有能有效凈化水質(zhì)的微生物，從這種發(fā)酵的魚(yú)肉湯中分離的菌株，可能來(lái)源于魚(yú)體或周邊環(huán)境，更適合在本區(qū)域池塘養(yǎng)殖使用。

本研究分離鑒定得到了6株芽孢桿菌，分屬于4種，即1株蠟樣芽孢桿菌，1株阿氏芽孢桿菌，2株解淀粉芽孢桿菌，2株貝萊斯芽孢桿菌，均具有產(chǎn)蛋白酶能力，其中4株具有產(chǎn)淀粉酶能力，6株菌在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，為之后進(jìn)一步研究其環(huán)境耐受性、體外抑菌試驗(yàn)、水質(zhì)凈化作用及對(duì)魚(yú)類的免疫作用研究奠定了基礎(chǔ)。

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