張笑玲 孟義江 賈凱旋 白旭瑞 葛淑俊

摘要：利用高效液相色譜（HPLC）法測定紫菀不同發(fā)育時期和不同組織部位的紫菀酮含量，探索藥用植物紫菀中紫菀酮積累的時空動態(tài)規(guī)律，為解析紫菀酮合成機制提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明，不同部位紫菀酮含量差異顯著，紫菀酮主要在根莖中積累，不定根和根狀莖紫菀酮含量均高于地上各部位，含量表現(xiàn)為根>根狀莖>蘆頭>葉片>葉柄，葉片中有大量紫菀酮合成，并最終在根中積累，葉柄中沒有紫菀酮積累，只參與葉片中紫菀酮向下運輸過程;不同時期根部紫菀酮含量差異明顯，未抽薹紫菀動態(tài)變化趨勢為高—低—高，抽薹紫菀動態(tài)變化趨勢為高—低—高—低—高，越年生紫菀根部紫菀酮含量低于一年生紫菀。紫菀酮積累受不同部位、不同時期、不同年限及抽薹開花的影響，綜合質(zhì)量評價一年生未抽薹紫菀的根及根莖更適用于入藥，紫菀最佳采收期為10月中下旬，本研究為紫菀的高效利用提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫菀;紫菀酮;時空變化規(guī)律;HPLC法

中圖分類號：R284 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0174-05

紫菀（Aster tataricus L. f.）為菊科紫菀屬草本植物，以干燥根莖入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、利尿和抗?jié)兊茸饔肹1]，主產(chǎn)于河北省安國市和安徽省亳州市[2]。紫菀中含有化學(xué)成分100余種，其中三萜類紫菀酮是紫菀中特有成分，主要在根及根莖中積累，《中華人民共和國藥典》中規(guī)定紫菀酮含量不低于0.15%。目前關(guān)于紫菀酮含量的測定方法[1]、不同種源中含量的差異[3]以及紫菀酮的藥理作用[4]等研究較多，但關(guān)于紫菀酮合成代謝的機制尚未明確。本研究以課題組篩選到的穩(wěn)定紫菀株系為材料，采用蘆頭和根莖播種，分時期測定地上和地下各部位中紫菀酮的含量，研究紫菀酮積累的時空變化規(guī)律，以期為解析紫菀酮合成機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以本課題組選育的生長一致、紫菀酮含量穩(wěn)定的株系紫菀1601為材料，經(jīng)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)楊太新教授鑒定為紫菀（Aster tataricus L. f.）。以不同發(fā)育時期紫菀樣本為試驗材料做后續(xù)分析。

1.2 試驗儀器

紫菀酮含量測定所用儀器為LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司，包括LC-20AD輸液泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A 檢測器、CBM-20Alite控制器、LC solution工作站）、Sartorius BS223S電子天平、WH-986A靜音混合器（上海新諾儀器集團有限公司）、SK5200H超聲儀、高速離心機（德國Eppendorf 5417C）;所用試劑有甲醇、乙腈，均為色譜純，紫菀酮標準品（中國藥品生物制品檢定所提供，Cas-10376-48-4）。

1.3 試驗方法

1.3.1 紫菀栽種和管理 2018年3月28日在河北省安國市中藥都藥博園內(nèi)栽種，沙壤土，底施有機肥1 000 kg/667 m2，氮、磷、鉀復(fù)合肥50 kg/667 m2，深翻整平。栽種行距為30 cm，穴距為15 cm，每穴栽種3個帶芽根莖節(jié)段或帶芽蘆頭。田間管理同大田。

在紫菀出苗后每隔30 d取樣1次，每次挖取3株，測量新生葉片和葉柄長度，抖凈泥土，沖洗后用濾紙吸干水分，取葉片、葉柄、蘆頭、不定根和根莖等部位，烘干，研磨，過40目篩備用。

1.3.2 紫菀酮含量的測定 對照品溶液制備：精密稱取紫菀酮標準品25 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋，并定容至刻度，超聲30 min，置于40 ℃恒溫水浴鍋直至溶解，搖勻，即得標準品溶液[5]。

供試樣品溶液制備：精密稱取樣品粉末0.1 g置于2.0 mL離心管中，加入1 mL甲醇溶液，超聲 30～60 min，4 ℃搖勻過夜，12 000 r/min離心 30 min，取上清液用微孔濾膜（0.45 μm）過濾后置于樣品瓶中待用。

紫菀酮含量測定：參照筆者所在實驗室建立的高效液相色譜（HPLC）法測定[4]。色譜條件為Polaris C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;柱溫箱溫度為40 ℃;檢測波長為200 nm;流速為1.0 mL/min;流動相乙腈 ∶ 水=96 ∶ 4（體積比）;進樣體積為20 μL;液相色譜（LC）結(jié)束時間設(shè)為50 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫菀植株生長發(fā)育情況

紫菀春季栽種后20～30 d出苗。由圖1可知，前期生長較慢，5月中下旬紫苑植株有3葉1心，第1條母根和次生根逐漸發(fā)育（圖1-A1）;6月植株葉片形成速度加快，分蘗增加，蘆頭和根狀莖開始形成（圖1-A2）;7月植株進入封壟期（圖1-A3），葉片和不定根迅速增多，蘆頭增大，不定根和根狀莖呈白色，之后根系顏色逐漸變深（圖1-A4），圖1-A4-1 為未抽薹紫菀，圖1-A4-2為抽薹紫菀，抽薹紫菀進入盛花期;9月植株根系進入快速發(fā)育期，根莖明顯伸長，次生根數(shù)量大量增加，根系顏色紫紅（圖1-A5）;10月后地上部生長基本停止，葉片變黃，地下根系持續(xù)伸長和增粗，根莖數(shù)量增加（圖1-A6）;11月中旬植株葉片枯萎，根系顏色紫紅，根莖數(shù)量顯著增加（圖1-A7）;12月中旬，在氣溫降至0 ℃以下后根系停止生長（圖1-A8）。春季返青前，根系和根莖顏色紫紅，根狀莖芽眼飽滿。下面用A1～A9表示對應(yīng)的各個時期，A9為春季返青前。

在紫菀生長過程中，新生葉的葉柄長度和葉片長度的比值有明顯變化，葉柄變短現(xiàn)象更有利于地上部紫菀酮向地下部運輸。由圖2可知，3葉1心時期植株新生葉葉柄較長，葉炳長與葉長的比值為1.50，之后葉柄逐漸變短，至8月植株進入旺盛生長期時新葉葉柄和葉片長度之比降為1.00;之后形成的新葉其葉柄和葉片的長度之比均在0.67左右。

2.2 紫菀酮含量積累的時間和空間變化情況

由圖3可知，紫菀植株各部位均有紫菀酮積累，但含量有明顯差異。根系是紫菀酮積累的主要器官，含量最高可達0.32%，遠高于根狀莖、蘆頭和葉片中的含量。根狀莖中有少量積累，含量達到了《中華人民共和國藥典》中規(guī)定的標準，可用于入藥，蘆頭和葉片中積累量較少。從取樣時期看，出苗后形成的第1條根中即檢測到了紫菀酮，含量為0.15%，表明紫菀酮可以在根部合成。合成含量在10月中下旬前呈上升趨勢，隨著氣溫降低，地上部開始枯萎，根系生長緩慢，紫菀酮含量有所下降，之后植株地上部完全干枯，到第2年春季返青前，紫菀酮含量不斷增加;蘆頭中紫菀酮含量在地上部枯萎前不斷增加，11月中下旬達到峰值后無明顯變化，根狀莖中紫菀酮含量從出苗到來年春季返青前不斷積累增加;葉片中紫菀酮含量在9月中下旬前處于穩(wěn)定增加階段，之后呈下降趨勢，差異明顯;葉柄中紫菀酮含量在植株整個生長期無明顯變化。

2.3 不同處理下紫菀酮含量的差異顯著性分析

紫菀相同部位不同時期、相同時期不同部位的紫菀酮含量均有顯著差異，把紫菀酮含量設(shè)為因變量，時期和部位當作2個不同處理，設(shè)為變量，對主體間效應(yīng)進行檢驗，從表1可以看出，誤差均方為0.002，表明數(shù)據(jù)結(jié)果可靠可信，基于α=0.05，P值（部位）為0.000，不同部位紫菀酮含量差異極顯著，P值（時期）為0.041，不同時期紫菀酮含量差異顯著。

2.4 不同部位、不同時期紫菀酮含量的顯著差異分析

把紫菀酮含量設(shè)為因變量，把部位設(shè)為變量，對不同部位紫菀酮含量進行顯著差異分析，結(jié)果見表2，基于α=0.05，標準誤差為0.02，葉柄與蘆頭無顯著差異，葉柄與根狀莖、葉片、根部差異顯著;蘆頭與根狀莖、葉片無顯著差異，與根部差異顯著;根狀莖與葉片無顯著差異，與根部差異顯著;葉片與根部差異顯著。

把紫菀酮含量設(shè)為因變量，時期設(shè)為變量，對不同時期紫菀酮含量進行顯著差異分析，結(jié)果見表3，基于α=0.05，標準誤差為0.02，A1、A2、A3、A4等4個時期無顯著差異，可以歸為類別Ⅰ，A5、A7、A8、A9等4個時期無顯著差異，可以歸為類別Ⅱ，A6與其余8個時期差異顯著，A6歸為類別Ⅲ，3個類別間差異顯著，類別內(nèi)差異不顯著。

2.5 未抽薹植株與抽薹植株中紫菀酮含量動態(tài)變化情況

紫菀采用蘆頭為材料播種后，當年即可抽薹開花。由圖4可知 未抽薹紫菀各部位不同時期平均紫菀酮含量大多高于抽薹紫菀。就根系而言，植株生長的前2個月，紫菀酮含量均呈上升趨勢，到第3個月蘆頭來源的植株中含量迅速下降，明顯低于抽薹植株，至10月抽薹植株中紫菀酮含量開始上升。因此，未抽薹植株根中紫菀酮含量隨植株生長發(fā)育呈現(xiàn)持續(xù)上升的狀態(tài)，而抽薹植株紫菀酮含量則是呈升—降—升的趨勢，二者在春季紫菀酮含量均下降，但前者最終含量高于后者。蘆頭和葉片中紫菀酮含量變化趨勢基本相同。

2.6 未抽薹植株與抽薹植株不同處理下紫菀酮含量差異顯著性分析

把紫菀酮含量設(shè)為因變量，時期和部位當作2個不同處理，設(shè)為變量，對主體間效應(yīng)進行檢驗，從表4可以看出，誤差均方為0.002，表明數(shù)據(jù)結(jié)果可靠可信，基于α=0.05，P值（部位）為0.000，差異極顯著，P值（時期）為0.708，大于0.05，無顯著差異，說明抽薹植株和未抽薹植株紫菀酮含量與時期相關(guān)性低，不同時期抽薹紫菀酮含量均低于未抽薹植株。

2.7 未抽薹植株與抽薹植株不同部位紫菀酮含量差異顯著性分析

把紫菀酮含量設(shè)為因變量，把部位設(shè)為變量，對不同部位紫菀酮含量進行顯著差異分析，結(jié)果見表5，基于α=0.05，標準誤差為0.02，蘆頭（抽薹）、蘆頭（未抽薹）、葉片（抽薹）、葉片（未抽薹）無顯著差異，可以歸為類別Ⅰ，表明蘆頭和葉片中紫菀酮含量不受植株抽薹影響，相關(guān)性低;類別Ⅰ與根部（抽薹）、根部（未抽薹）差異顯著，表明抽薹植株與未抽薹植株蘆頭與葉片中紫菀酮含量均與根部紫菀酮含量差異顯著;根部（抽薹）與根部（未抽薹）紫菀酮含量差異顯著，表明植株抽薹會影響植株根部紫菀酮含量積累，相關(guān)性高。

3 討論與結(jié)論

中藥紫菀是菊科植物紫菀的干燥根及根莖[5]。紫菀酮是紫菀中特有的三萜類化合物。關(guān)于紫菀酮積累的部位和時期差異，夏成凱等研究指出紫菀根中紫苑酮含量高于母根和根莖[6];郭偉娜等研究指出紫菀酮積累主要部位為韌皮部和皮層內(nèi)側(cè)，且根下部紫菀酮含量高于上部[7]，紫菀酮含量與根和根莖的質(zhì)量比顯著正相關(guān)[8]。本研究測定了不同時期根、蘆頭、根狀莖、葉片、葉柄中紫菀酮含量，通過差異比較分析發(fā)現(xiàn)紫菀酮含量在不同部位、不同時期均呈顯著差異，根部與其他4個部位紫菀酮含量差異顯著，A6與其余8個時期紫菀酮含量差異顯著，根部與10月分別為紫菀酮合成重點部位和重點時期;不同部位紫菀酮含量表現(xiàn)為根>根狀莖>蘆頭>葉片>葉柄，10月中下旬前，根中紫菀酮含量不斷增長，之后由于溫度降低，紫菀酮含量顯著減少，土凍后地上部完全干枯，地下部停止生長，但紫菀酮不斷積累，次年3月春季返青前紫菀酮含量仍低于頭年10月中下旬紫菀酮含量，根狀莖中紫菀酮含量不斷積累增加;蘆頭內(nèi)紫菀酮含量在地上枯萎前不斷積累，之后停止積累;值得關(guān)注的是，地上部停止生長，葉片開始變黃前，葉片中紫菀酮含量不斷積累并達到峰值0.20%后不斷減少;葉柄參與紫菀酮由地上部到地下部的運輸，葉柄中紫菀酮含量在各個時期基本保持不變。計算不同時期新生葉葉柄長與葉片長比值，發(fā)現(xiàn)前期新生葉葉柄長大于葉片長，葉柄長與葉片長比值大于1，后期新葉葉柄長與葉片長比值不斷減小，更有利于紫菀酮的運輸。

抽薹主要是由于節(jié)間伸長進入生殖生長的叢生型植物的莖，受到溫度和日光長度等環(huán)境變化的刺激，隨著花芽的分化，莖開始迅速伸長，植株開始變高。二年生紫菀和以帶蘆頭栽種的紫菀多會出現(xiàn)抽薹開花現(xiàn)象，當歸、防風、天麻等中藥材發(fā)育中也會出現(xiàn)早期抽薹現(xiàn)象，當歸早期抽薹影響植株正常生長，抽薹前后，植株體內(nèi)多個重要生理生化指標及次生代謝物阿魏酸和多糖差異顯著，且大大降低揮發(fā)油的合成，增加根部柴性，最終導(dǎo)致當歸失去其藥用價值[9-10]，栽培防風由于內(nèi)源激素量的變化在第2年或者第3年會出現(xiàn)大量抽薹，抽薹開花后，植株早期根部會出現(xiàn)中空、木質(zhì)化，后期植株根部腐爛，色原酮及多糖含量大大降低，藥效也大大降低，最終導(dǎo)致植株失去其藥用價值[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)抽薹植株與未抽薹植株不同部位紫苑酮含量差異明顯，除A1時期外，抽薹紫菀中根部紫菀酮含量均低于未抽薹植株;未抽薹紫苑根部紫苑酮含量變化趨勢為高—低—高，抽薹紫苑變化趨勢為高—低—高—低—高。3月底到7月中旬，植株不斷生長，葉片增多，蘆頭、根狀莖形成并增大，根系增多增長，此時營養(yǎng)物質(zhì)主要供給植株生長發(fā)育，7月底到8月底是紫菀酮合成積累的重要階段，未抽薹植株中營養(yǎng)物質(zhì)主要用于次生代謝物的合成和積累，但此階段抽薹植株進入盛花期，生殖生長階段根中次生物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成能力減弱，紫菀酮含量顯著低于未抽薹植株。因此防止紫菀抽薹是保證紫菀品質(zhì)與質(zhì)量的前提。

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