海 卓，熊顯榮，馬鴻程，張 賀，閔星宇，李 鍵*

(1.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.青藏高原動(dòng)物遺傳育種資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

遺傳是一種在不改變堿基遺傳序列情況下的修飾遺傳，主要包括組蛋白修飾、DNA甲基化修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾及復(fù)雜三維基因組排列[1-2]。染色質(zhì)、染色體是真核生物遺傳物質(zhì)處于有絲分裂及減數(shù)分裂特定階段中的特定形式，其基本單位是由組蛋白H2A、H2B、H3和H4構(gòu)成的八聚體與DNA緊密纏繞形成的核小體[3]。DNA甲基化修飾在胚胎腎臟輸尿管分支的形成、胎盤組織的發(fā)育皆具有重要作用[4-5]。近幾年組蛋白修飾逐漸被人們所熟知，它是一種由特定相關(guān)因子作用于組蛋白特定殘基位點(diǎn)的遺傳修飾，甲基化、乙酰化、磷酸化、糖基化、泛素化等是其主要的修飾途徑[6]。組蛋白乙酰化修飾通過(guò)組蛋白乙?；?HATs)與去乙?；?HDACs)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后的遺傳過(guò)程，進(jìn)而影響細(xì)胞的分裂分化[7]。目前發(fā)現(xiàn)參與修飾的HATs約有15個(gè)，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的同源性至少可分為3個(gè)家族：GCN5與其相關(guān)的N-端乙?；D(zhuǎn)移蛋白、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CBP)及其類似蛋白(p300、MoZ、YBF2、SAS3、SAS2)和MYST(Tip60)。目前組蛋白乙?；趧?dòng)植物相關(guān)基因的研究主要集中于MyST家族[8]，MyST家族有組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶Tip60(KAT5)、KAT6A、KAT6B、KAT7和KAT8，且這些家族成員在組蛋白氨基酸殘基的作用位點(diǎn)并不相同[9-10]。

組蛋白乙酰化酶8(KAT8)又稱為MYST1或MOF，除包含C-端HAT結(jié)構(gòu)域外還含有MYST結(jié)構(gòu)域(存在CoA、染色質(zhì)2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)及C2HC型鋅指蛋白)[11]。KAT8主要作用于組蛋白H4的賴氨酸K16殘基位點(diǎn)(H4K16)[12]。KAT8最初發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，參與X染色體遺傳物質(zhì)平衡的劑量補(bǔ)償過(guò)程，并被命名為MOF[13]。有研究表明，KAT8是一種潛在的雌激素受體α(estrogen receptor α，ECα)抑制因子，用RNAi技術(shù)干擾其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。KAT8與天冬氨酸重復(fù)蛋白5(aspartic acid repeat-containing protein 5,WDR 5)共同作用于雄激素受體(androgen receptor,AR)靶基因上，從而激活前列腺癌細(xì)胞中雄激素依賴基因，且敲除KAT8基因能夠顯著降低AR靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響雄性生殖系統(tǒng)[15]。在人胚腎293 T細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)KAT8不僅能夠促進(jìn)H4K16發(fā)生乙?；?，還致使多種組蛋白和非組蛋白發(fā)生丙酰化修飾[16]。研究發(fā)現(xiàn)，KAT8基因也介導(dǎo)雌性卵巢發(fā)育及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂調(diào)控[17]。植入前胚胎會(huì)因母體KTA8缺失而出現(xiàn)囊胚形成率降低及單個(gè)囊胚中總細(xì)胞數(shù)降低的現(xiàn)象，說(shuō)明KAT8在雌性生殖過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用[18]。

牦牛(Bosgrunniens)是一種生活在高海拔、強(qiáng)紫外線且低氧環(huán)境中的高原地區(qū)優(yōu)勢(shì)物種，是高原地區(qū)人民生活保障的必需家畜，具有“全能家畜”、“高原之舟”的美稱。與黃牛的繁殖情況不同，牦牛是季節(jié)性發(fā)情，通常1年1胎或3年2胎，產(chǎn)犢率低下[19]，這嚴(yán)重阻礙了牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。KAT8作為一種重要的染色質(zhì)組蛋白修飾因子，在牦牛中的表達(dá)水平及作用機(jī)制人們尚不清楚。為此，本研究利用RT-PCR技術(shù)對(duì)牦牛KAT8基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，對(duì)其組織表達(dá)譜及該基因在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律進(jìn)行探究，并通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)KAT8在不同發(fā)育時(shí)期卵泡中的定位進(jìn)行研究，旨在分析KAT8理化性質(zhì)及在牦牛生殖過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，為牦牛育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集在秋季選擇3頭3～5周歲未妊娠的母牦牛，屠宰后立即采集心臟、胃、腎臟、肝臟、肺臟、小腸、脾臟、肌肉、子宮及卵巢組織，利用凍存管收集后置于液氮中暫做保存。采集10頭3～5周歲母牦牛卵巢，利用無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈，隨機(jī)分為2份，一份放入4%多聚甲醛(PFA)中進(jìn)行固定；另一份放入含有雙抗(青霉素、鏈霉素)的30℃生理鹽水中暫存，以上樣品于3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑TRIzol RNA提取試劑購(gòu)自Invitrogen公司；核酸助沉劑購(gòu)自北京百泰克神武技術(shù)有限公司；PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD19-T載體均為TaKaRa公司產(chǎn)品；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒、2×Phanta?Max Master Mix(Dye Plus)由南京諾唯贊生物科技股份有限公司提供；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)有限公司；DEPC、DNA Marker、感受態(tài)細(xì)胞DH5α均購(gòu)自天根生化科技有限公司；Rabbit Anti-MYST1/KAT8 antibody由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 卵巢獲取及卵母細(xì)胞收集在無(wú)菌環(huán)境下，收集卵巢表面直徑為2 ～10 mm卵泡中的卵泡液，轉(zhuǎn)移至直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下選取顆粒細(xì)胞包裹致密、細(xì)胞無(wú)變形退化的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)50～70顆，用OM液清洗2～3次后于透明質(zhì)酸酶中脫去顆粒細(xì)胞，用PBS洗滌3次，獲得生發(fā)泡時(shí)期(GV期)卵母細(xì)胞，放入1.5 mL EP管中備用。分別收集體外培養(yǎng)的第1次減數(shù)分裂中期(MⅠ)和第2次減數(shù)分裂中期(MⅡ)卵母細(xì)胞，用上述方法處理后備用。

1.4 不同時(shí)期卵母細(xì)胞及各組織cDNA的獲得采用TRIrizol法提取各樣本總RNA，用核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)總RNA濃度；選取D260/D280值為1.8～2.0的RNA樣本，用PrimeScrptTMRT Reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得各組織及不同時(shí)期卵母細(xì)胞的cDNA，收取D260/D280值為1.8～2.0的cDNA樣本，-20℃暫存，備用。

1.5 KAT8基因克隆引物和熒光定量引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登陸的牛KAT8序列 (GenBank登錄號(hào)：XM_027528321.1)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)KAT8分段擴(kuò)增引物KAT8-1和KAT8-2，其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度預(yù)期為996，942 bp，KAT8全長(zhǎng)預(yù)期為1 938 bp。利用NCBI中的Primer-BLAST設(shè)計(jì)KAT8基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物及β-actin定量引物(GenBank登錄號(hào)：XM_027538848.1)。引物均送由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 KAT8 PCR引物及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.6 牦牛KAT8基因的克隆及測(cè)序以牦牛卵巢cDNA為模板，用KAT8-1和KAT8-2分段擴(kuò)增KAT8基因，PCR反應(yīng)體系均為2×Phanta?Max Master Mix (Dye Plus) 25.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA 2.0 μL(0.5 μg/L)，ddH2O 補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序均為95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。分段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在紫外光下切取目的條帶，用膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的2段目的片段分別與pMD19-T載體連接，連接體系為5 μL：DNA片段 2 μL，pMD19-T載體0.5 μL，solutionⅠ 2.5 μL，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中增菌2 h后，4℃環(huán)境下8 000 r/min離心15 min收集菌液。將所獲菌體分別涂布于含有100 mg/L氨芐青霉素(Amp)的選擇培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。用無(wú)菌接種環(huán)分別挑取目的菌落，接種含Amp的液體培養(yǎng)基中，放在搖床上過(guò)夜培養(yǎng)。將獲得的菌體送由生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，利用DNAMAN將目的序列拼接，獲得KAT8基因。

1.7 牦牛KAT8生物學(xué)信息學(xué)分析利用BLAST在線系統(tǒng)比對(duì)物種間KAT8核苷酸序列相似性，通過(guò)MAGA 7.0軟件構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。將序列輸入NCBI-ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)中獲得氨基酸序列。通過(guò)ExPASy在線軟件中的ProtParam (http://web.expasy.org/protparam)、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)程序及Npsa-Prabi (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPS)和SWISS_MODEL預(yù)測(cè)KAT8蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、親疏水性以及該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

1.8 KAT8 mRNA的組織表達(dá)譜分析以上述反轉(zhuǎn)錄的各組織cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因(表1)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析檢測(cè)KAT8 mRNA在各組織相對(duì)表達(dá)量。熒光定量PCR總反應(yīng)體系為15 μL：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA (0.5 μg/L) 1 μL，ddH2O 5.5 μL。熒光定量反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s， 39個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s,60℃ 1 min。每個(gè)組織檢測(cè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)組。采用2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)量。

1.9 KAT8在卵母細(xì)胞成熟及卵泡發(fā)育過(guò)程中表達(dá)規(guī)律分析以1.3中獲得的GV期、MⅠ期、MⅡ期卵母細(xì)胞cDNA為模板，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)KAT8在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的表達(dá)情況，反應(yīng)體系及條件參照1.8。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。采用2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)量。

采用免疫組織化學(xué)染色法定位分析KAT8在卵巢中的表達(dá)規(guī)律。將1.2中已固定的卵巢組織用PBS沖洗干凈后進(jìn)行石蠟切片，按照Rabbit Anti-MYST1/KAT8 antibody說(shuō)明書稀釋(1∶100)，4℃濕潤(rùn)條件下孵育過(guò)夜。TBST反復(fù)清洗3次，每次5 min，滴加過(guò)氧化物偶聯(lián)鼠兔雙標(biāo)二抗，室溫孵育30 min。TBST清洗3次，每次5 min，避光環(huán)境下DAB顯色液處理15 min；PBS清洗2次，每次5 min，蘇木精復(fù)染3 min后，進(jìn)行藍(lán)化、脫水及中性樹(shù)脂封片鏡檢。

1.10 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)法分析各個(gè)組織及不同時(shí)期卵母細(xì)胞中KAT8相對(duì)表達(dá)量的差異性。免疫組織切片利用激光共聚焦進(jìn)行觀察拍照，隨機(jī)選取各發(fā)育時(shí)期的卵泡。

2 結(jié)果

2.1 牦牛KAT8基因的克隆及序列分析以卵巢cDNA為模板，利用分段擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增到約996，942 bp片段(圖1)。分段擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，通過(guò)DNAMAN拼接獲得1 938 bp 的KAT8基因，其CDS全長(zhǎng)為1 377 bp，共編碼458個(gè)氨基酸。

M．DL2000 DNA Marker；1,2.KAT8-2和KAT8-1擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 牦牛KAT8蛋白相關(guān)生物信息學(xué)分析通過(guò)BLAST比對(duì)核苷酸發(fā)現(xiàn)牦牛KAT8基因與黃牛、野牛、綿羊和山羊的相似性較高，分別為99.64%，99.27%，98.33%，98.04%；與小鼠、馬和家兔核苷酸相似性較低，分別為88.67%，90.46%，91.65%(圖2A)。利用MAGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示(圖2B)，牦牛與黃牛、野牛、山羊和綿羊親源關(guān)系最近，且與核苷酸相似性比對(duì)結(jié)果一致;說(shuō)明KAT8在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守。通過(guò)ExPASy在線工具預(yù)測(cè)KAT8蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為52.44 kDa，分子式為C2366H3671N633O690S13，共有原子數(shù)7 373個(gè)，其理論等電點(diǎn)為8.48，脂肪指數(shù)為77.90，不穩(wěn)定指數(shù)為41.26，推測(cè)該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白，且在哺乳動(dòng)物中該氨基酸預(yù)估半衰期為30 h。KAT8蛋白中含量較高的氨基酸有賴氨酸(Lys)、谷氨酸(Glu)和亮氨酸(Leu)，分別為9.4%，8.3%,8.1%；含量較低的氨基酸有半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)和甲硫氨酸(Met)，分別為2.0%，2.0%,0.9%；帶負(fù)電荷殘基的天冬氨酸和谷氨酸(Asp+Glu)有59個(gè)，帶正電荷殘基的精氨酸、賴氨酸和組氨酸(Arg+Lys+His)有77個(gè)。蛋白質(zhì)親疏水性分析，異亮氨酸(ILe)親水性4.500，精氨酸(Arg)親水性-4.500，且該蛋白質(zhì)中大多數(shù)氨基酸殘基親水性數(shù)值小于零，最終總親疏水性平均值-0.584，因此推測(cè)KAT8為親水性蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，牦牛KAT8蛋白中α螺旋占37.25%，延伸鏈占17.43%，無(wú)規(guī)則卷曲占45.10%，無(wú)β-轉(zhuǎn)角(圖3)。SWISS_MODEL預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)證實(shí),KAT8蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)含有ɑ螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，且結(jié)果顯示延伸鏈主要位于ɑ螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)之間(圖4)。

A.牦牛KAT8核苷酸序列相似性分析；B.不同物種間牦牛KAT8蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

紫色指示無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)；藍(lán)色指示α螺旋(Hh)；紅色指示延伸鏈(Ee)

A.α螺旋;B.無(wú)規(guī)則卷曲;C.延伸鏈

2.3 牦牛KAT8 mRNA組織表達(dá)譜分析以β-actin為內(nèi)參基因，利用RT-PCR技術(shù)分析各組織中KAT8 mRNA相對(duì)表達(dá)量，并繪制組織表達(dá)譜(圖5)。結(jié)果顯示，KAT8在牦牛各組織中廣譜表達(dá)，在肌肉、心臟和卵巢中相對(duì)表達(dá)量較高，極顯著高于其他組織(P<0.01)；在肺臟、脾臟和胃中相對(duì)表達(dá)量較低，其中肌肉和心臟無(wú)顯著性差異，但顯著高于卵巢中KAT8 mRNA表達(dá)量(P<0.05)。

注：相同字母代表差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

2.4 KAT8在牦牛卵泡發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律及定位分析采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)，結(jié)果表明KAT8在牦牛各發(fā)育時(shí)期卵泡中均有表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物呈褐色或棕褐色(圖6)。由圖6F可知KAT8主要定位于顆粒細(xì)胞，而卵泡膜細(xì)胞中相對(duì)較少。

A.原始卵泡(100×)；B.初級(jí)卵泡(80×)；C.次級(jí)卵泡(80×)；D.三級(jí)卵泡(50×)；E.優(yōu)勢(shì)卵泡(50×)；F.局部放大(100×)。GC.顆粒細(xì)胞；TC.膜細(xì)胞

2.5 牦牛KAT8 mRNA在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中表達(dá)規(guī)律分析以β-actin作為內(nèi)參基因，利用RT-PCR方法分析KAT8 mRNA在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的時(shí)序表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期KAT8均有表達(dá)，生發(fā)泡期(GV)相對(duì)表達(dá)量較高，MⅠ期次之，MⅡ期最低，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖7)。

圖7 牦牛卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中KAT8 mRNA表達(dá)規(guī)律

3 討論

目前，有關(guān)KAT8的研究主要集中在免疫及造血功能方面[20-21]，然而關(guān)于其在卵巢、卵泡發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)及作用的研究較少[17]。因此，探討KAT8在牦牛生殖過(guò)程中的表達(dá)模式及分子機(jī)制尤為重要。本試驗(yàn)利用RT-PCR技術(shù)成功克隆出牦牛KAT8基因CDS序列。通過(guò)核苷酸相似性分析發(fā)現(xiàn)，牦牛、黃牛和野牛KAT8核苷酸序列高度吻合。綜上表明，KAT8基因在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守。

研究可知，KAT8在動(dòng)物不同組織中的作用不盡相同[19-22]，在牦牛各個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量及在生殖器官及生殖細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制仍未可知。本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)牦牛各組織中KAT8 mRNA相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明，KAT8在牦牛各組織中廣譜表達(dá)，其中肌肉、卵巢和心臟中表達(dá)量較高。有報(bào)道已證實(shí)KAT8(MOF)對(duì)抑制心肌肥大具有關(guān)鍵性作用，與過(guò)氧化氫酶和錳超氧化物歧化酶(MnSOD)具有協(xié)同作用，可阻斷心臟橫向動(dòng)脈縮窄誘導(dǎo)的活性氧基因(ROS)及其下游的c-Raf-MEK-ERK通路，從而抑制心肌肥大[8]。因此，推測(cè)牦牛耐低氧特性與其心臟中KAT8 mRNA高表達(dá)有關(guān)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。YIN等[17]利用基因編輯技術(shù)敲除小鼠卵巢KAT8基因，探究母體卵巢KAT8表達(dá)對(duì)后續(xù)生殖過(guò)程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除鼠卵巢形態(tài)與野生型小鼠卵巢形態(tài)差異較大，體脂率降低77.4%，且出現(xiàn)了卵泡減少及卵泡表面直徑減小的現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，在人正常卵巢組織中KAT8 mRNA在相對(duì)表達(dá)量顯著高于卵巢癌組織[23]。本研究證實(shí)，KAT8 mRNA在牦牛卵巢中表達(dá)量較高。綜上結(jié)果表明，KAT8參與卵巢發(fā)育，其缺失會(huì)嚴(yán)重影響卵巢的正常發(fā)育。

為進(jìn)一步探究KAT8在牦牛卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的表達(dá)規(guī)律，本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)KAT8 mRNA在牦牛不同時(shí)期卵母細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)GV、MⅠ和MⅡ期卵母細(xì)胞表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，這與YIN等[17]對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的研究結(jié)果一致。有研究證實(shí)，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中組蛋白殘基逐漸進(jìn)行乙?；揎?，GV期乙?；阶罡撸S后降低，同時(shí)去乙酰化酶水平隨之升高[22]。結(jié)合組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)及組蛋白去乙?；?(HDAC8)在GV期的表達(dá)結(jié)果推測(cè)卵母細(xì)胞GV期較高的乙?；揭种迫ヒ阴；揎椬饔肹19,24]。有研究表明，KAT8在小鼠卵母細(xì)胞不同時(shí)期中的表達(dá)水平存在顯著性差異，GV期顯著高于MⅠ和MⅡ期[17]，但本研究中牦牛3個(gè)時(shí)期卵母細(xì)胞表達(dá)水平無(wú)顯著性差異。本試驗(yàn)對(duì)核苷酸序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，牦牛KAT8與小鼠相似性最低，推測(cè)該基因在牦牛和小鼠中出現(xiàn)的差異可能與物種特異性及牦牛特殊生存環(huán)境有關(guān)，具體原因有待進(jìn)行深入研究。

最后，本試驗(yàn)采用免疫組化對(duì)KAT8在牦牛卵巢不同發(fā)育時(shí)期卵泡的表達(dá)定位進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)KAT8在卵泡各發(fā)育期均有表達(dá)，且主要定位于卵泡顆粒細(xì)胞中。由人正常卵巢及患有癌癥的卵巢組織免疫組化結(jié)果可知，KAT8在卵巢多種細(xì)胞中均表達(dá)，但在不同發(fā)育時(shí)期的正常及患癌卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)其他細(xì)胞明顯升高[23]。目前KAT8在經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生殖過(guò)程中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。研究KAT8在牦牛不同發(fā)育時(shí)期卵泡中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)進(jìn)一步探究該基因?qū)Υ菩躁笈Ｉ诚嚓P(guān)的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。