于 爽，張 營，許祺珺，裴志花,2*，馬紅霞

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點實驗室，吉林 長春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118)

隨著生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，多肽藥物已成為藥物研發(fā)和臨床治療的熱點。目前已上市或進入臨床試驗階段的多肽藥物已達數(shù)百種，涉及的病癥也超過200種[1]。多肽藥物具有生物活性高、低毒、低免疫原性、高組織滲透性和易于合成等優(yōu)點，具有極為廣泛的應(yīng)用前景。然而，大多數(shù)多肽的相對分子質(zhì)量較小，易被血液和腎臟快速清除，同時易被人和動物體內(nèi)的多種蛋白酶和肽酶降解，因此大多數(shù)多肽類藥物的體內(nèi)半衰期較短，這嚴重限制了該類藥物在臨床上的應(yīng)用[2]。為了解決多肽藥物半衰期短的問題，近年來研究者利用DNA融合技術(shù)將多肽藥物與其他蛋白融合、糖基化或與聚合物綴合等，增加了蛋白質(zhì)的流體動力學(xué)體積或產(chǎn)生電荷效應(yīng)，通過減小腎小球濾過率來延長多肽藥物的半衰期，并取得了一定的成效[3]。在多肽藥物與聚合物綴合來延長藥物半衰期的研究中報道最多的是PEG化學(xué)修飾、PAS 綴合和XTEN修飾。XTEN修飾技術(shù)是近年來新興的一種用于延長藥物半衰期、增加藥物穩(wěn)定性的蛋白及多肽藥物修飾技術(shù)，具有極為廣闊的應(yīng)用前景?，F(xiàn)就XTEN蛋白修飾技術(shù)在延長多肽藥物半衰期方面的研究做一總結(jié)，以期為多肽藥物半衰期延長策略的研究提供理論依據(jù)。

1 XTEN蛋白修飾技術(shù)

1.1 XTEN蛋白序列XTEN是一條含有864個氨基酸的蛋白質(zhì)聚合物，該聚合物及其不同長度的衍生物統(tǒng)稱為XTEN。XTEN最初是Amunix公司[5]開發(fā)的一類非結(jié)構(gòu)化的可生物降解的蛋白質(zhì)聚合物，是一段由6個親水、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的氨基酸組成的非重復(fù)性氨基酸序列。VOLKER等[4]嘗試用以上6個氨基酸以不同比例組合成序列片段，在大腸桿菌中成功表達，并通過常規(guī)蛋白質(zhì)色譜法純化為具有確切長度和序列的單分散多肽[5]。XTEN具有親水性高和免疫原性低的特點[6]，有較大的流體動力學(xué)體積且?guī)ж撾姾?，通過基因工程方法將多肽藥物與XTEN融合，能夠增強藥物的穩(wěn)定性和溶解性。非結(jié)構(gòu)化XTEN多肽流體力學(xué)體積比類似質(zhì)量的典型球狀蛋白大得多，因此賦予與其連接的多肽藥物以流體力學(xué)體積增大的效應(yīng)，進而達到增強多肽藥物的穩(wěn)定性、溶解性及體內(nèi)半衰期的目的。

1.2 XTEN序列的設(shè)計NATHAN等[5]發(fā)現(xiàn)了一個結(jié)構(gòu)簡單的多肽鏈可以形成類似于PEG的擴展構(gòu)象，進一步研究發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)性蛋白序列XTEN能夠提供體積增大效應(yīng)，從而能穩(wěn)定與之融合的蛋白質(zhì)，并可能降低蛋白類藥物的免疫原性。XTEN蛋白修飾不僅能夠比聚乙二醇化修飾獲得更均勻的最終產(chǎn)物，還能避免在修飾過程中發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)，而且可以精確地將修飾的多肽調(diào)整到任何期望長度，以控制血漿半衰期。

為了設(shè)計一種可溶的、化學(xué)穩(wěn)定的、主要是非結(jié)構(gòu)化的多肽，研究人員首先排除了疏水性氨基酸Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp和Tyr，因為它們易導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，且易引起HLA/MHL-Ⅱ介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。然后排除了帶酰胺基團的氨基酸Asn和Gln，因為其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、易水解。接下來又排除了帶正電荷的氨基酸His、Lys和Arg，因為它們會與細胞膜相互作用。最后排除了易形成二硫鍵的氨基酸Cys。ALVAREZ等[7]曾嘗試使用2～5個氨基酸的5肽重復(fù)序列來設(shè)計非結(jié)構(gòu)氨基酸序列，結(jié)果顯示出免疫原性和很低的溶解度，而血漿半衰期僅得到適度改善，這意味著需要額外的氨基酸來獲得具有理想性質(zhì)的蛋白聚合物?；谶@些考慮，最終研究人員選擇了Pro、Glu、Ser、Thr、Ala和Gly 等6種氨基酸，成功降低了免疫原性并增加了溶解度。研究人員[5-7]為了創(chuàng)建沒有固定二級結(jié)構(gòu)并能在大腸桿菌中穩(wěn)定、高效表達的多肽，首先構(gòu)建了1個包含以上6種氨基酸的36個非重復(fù)性的氨基酸片段庫(每個片段包含8%A、12%E、18%G、17%P、28%S和17%T)，并從中篩選出約1 500個高效表達水平的獨特片段。對這些高效表達的片段進行反復(fù)連接并重新篩選以獲得最大表達，得到一個片段庫，其中的每個片段包含864個氨基酸。然后對其中5個表達量最高的片段進行遺傳穩(wěn)定性、溶解度、熱穩(wěn)定性、抗聚集性和污染物分布(包括宿主細胞蛋白質(zhì)、DNA和細菌脂多糖)等標(biāo)準(zhǔn)進行評估(數(shù)據(jù)未顯示)，選擇出了一個名為XTEN的序列，進行進一步研究發(fā)現(xiàn)其性質(zhì)穩(wěn)定，表達水平高。如今，該多肽及其不同長度的衍生物統(tǒng)稱為XTEN[7]。

2 XTEN蛋白修飾技術(shù)的優(yōu)勢

2.1 多重機制延長多肽藥物半衰期腎小球的濾過率與多肽藥物的大小和電荷數(shù)有關(guān)。XTEN攜帶谷氨酸殘基使融合蛋白帶有大量負電荷，這會降低其與受體之間的親和力，從而減少受體介導(dǎo)的蛋白藥物的清除。另外，XTEN多肽攜帶大量負電荷，與基底膜之間發(fā)生靜電排斥作用，也可以減慢腎小球的濾過作用，可進一步延長蛋白藥物的血漿半衰期。并且XTEN是無規(guī)則卷曲構(gòu)象的蛋白質(zhì)，這使得多肽融合蛋白具有較大的流體動力學(xué)體積，從而減少腎小球?qū)λ幬锏臑V過作用[8]，從而達到延長多肽藥物半衰期的目的。

2.2 融合產(chǎn)物易于表達和純化融合構(gòu)建體的一個明顯好處是便于表達、純化和表征單個分子，該單個分子包括治療藥物部分和填充部分。為了適應(yīng)遺傳融合，有效載荷分子必須由蛋白源性L-氨基酸組成，并且融合產(chǎn)物必須是線性單向多肽[9]。由于XTEN蛋白聚合物經(jīng)過工程改造，有非常高的溶解度，因此生成的融合產(chǎn)物可以方便地以可溶形式在胞質(zhì)溶膠中表達。根據(jù)菌株的遺傳因素和所使用的表達載體，可以利用T7/lac或phoA啟動子系統(tǒng)來優(yōu)化產(chǎn)物的表達[10]。XTEN融合產(chǎn)物通常顯示出可增強所修飾目的肽和目的蛋白溶解度和熱力學(xué)穩(wěn)定性的特點[11]，有助于獲得可溶性表達的目的蛋白和目的蛋白的純化產(chǎn)物。

2.3 XTEN蛋白修飾有望取代PEG修飾聚乙二醇(PEG)是歷史上第一種通常用于提高生物治療劑體內(nèi)半衰期的填充劑，現(xiàn)已被應(yīng)用在多種已獲批準(zhǔn)的產(chǎn)品中[12-14]。PEG修飾有降低免疫原性、增加藥物溶解性、減少蛋白酶降解、增加藥物流體動力學(xué)體積等優(yōu)點，但是仍存在純化工藝復(fù)雜、成本高、長期給藥時易產(chǎn)生抗PEG的抗體、會在腎臟中聚集等缺點。PEG不可生物降解，在動物研究中已觀察到PEG化修飾化合物的細胞空泡[15-16]。盡管人們普遍認為PEG本身不具有免疫原性的，但據(jù)報道PEG化治療劑的免疫原性似乎取決于被修飾蛋白質(zhì)大小、PEG大小和化學(xué)組成。在用PEG化蛋白治療的患者中檢測到的抗PEG抗體的特異性和中和特性仍有爭議，在健康人群中也有抗PEG抗體的報道[17]。PEG的成功和局限性都刺激了替代性可生物降解填充劑的開發(fā)(表1)。

與PEG修飾相比較，XTEN蛋白修飾技術(shù)具有以下幾點優(yōu)勢:XTEN聚合物是在標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)平臺中生產(chǎn)的，XTEN已經(jīng)在該平臺中表達并且優(yōu)化后生產(chǎn)[18]，隨后的XTEN純化處理是高效且易于擴展的，產(chǎn)生了均勻的、高度純化的本體[19]。XTEN蛋白聚合物具有較高的生物安全性，它能進行生物降解，不會在器官或細胞中蓄積，避免產(chǎn)生副作用；可以通過基因工程技術(shù)將XTEN和蛋白質(zhì)進行融合表達，從而避免了體外化學(xué)偶聯(lián)和修飾后的純化、去除標(biāo)簽等步驟；融合蛋白的半衰期可通過調(diào)整多肽鏈的長度來調(diào)節(jié)，可以為臨床用藥提供選擇，連接于蛋白藥物的N端還是C端對于其生物活性的影響是可有可無的[20]；盡管XTEN具有大量的負電荷和體積，但對于不同大小和電荷的肽，接合反應(yīng)通常進行得迅速而有效，這表明XTEN的物理化學(xué)特性不會導(dǎo)致聚合物上活性部分的屏蔽，也不會導(dǎo)致XTEN與目標(biāo)肽之間產(chǎn)生非生產(chǎn)性的排斥或吸引作用[20]，且使用范圍廣[21]。除了PEG修飾外，還有其他延長半衰期的重組方法包括融合免疫球蛋白、抗體衍生片段、以及白蛋白或結(jié)合血漿中長壽命分子的結(jié)構(gòu)域等技術(shù)，都有自己的優(yōu)勢，但是XTEN適用于更廣泛的藥物種類，原核和真核系統(tǒng)都可用于表達XTEN融合蛋白，因此XTEN修飾技術(shù)有望替代PEG修飾，在肽類和蛋白質(zhì)類藥物半衰期延長方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 XTEN蛋白融合與PEG修飾的比較

3 XTEN蛋白修飾技術(shù)在藥物半衰期延長方面的應(yīng)用

XTEN蛋白修飾技術(shù)可以通過融合表達和化學(xué)偶聯(lián)2種方法來延長多肽藥物的半衰期?；瘜W(xué)偶聯(lián)法需要分別生產(chǎn)XTEN和有效藥物載荷、組分選擇性交聯(lián)以及最終結(jié)合物的純化，這些額外的步驟較多而且麻煩。與化學(xué)偶聯(lián)相比，XTEN融合蛋白通常易于表達，但仍需要對其表達和純化步驟進行一些探索。利用基因融合產(chǎn)生XTEN蛋白的一個功能優(yōu)勢是能夠?qū)⒍鄠€XTEN片段融合到感興趣的治療蛋白上，這一優(yōu)勢已提高和開發(fā)了幾種藥物的治療能力[22]。在人生長激素(hGH)中，通過將XTEN的912個氨基酸殘基序列融合到治療蛋白的N端，使腎臟清除率最小化，而通過將XTEN的144個氨基酸殘基序列融合到C末端，可以降低受體介導(dǎo)的清除率[23]。在凝血因子Ⅷ中，多個XTEN片段被整合到多肽藥物的天然序列中[24]。XTEN蛋白聚合物由基因編碼的氨基酸組成，因此可以重組融合到治療性蛋白質(zhì)或肽上[25]。目前，XTEN技術(shù)已應(yīng)用在包括激素、凝血因子和多肽在內(nèi)的多種生物治療方法中。

3.1 XTEN與hGH融合腎臟過濾和受體介導(dǎo)的清除作用會清除人體內(nèi)的生長激素，從而導(dǎo)致該藥物在猴子中的半衰期為2～3 h[26-29]。VRS-317是一種新型的長效hGH-XTEN融合蛋白，正在臨床研發(fā)中，用于治療生長激素缺乏癥(GHD)，經(jīng)過專門設(shè)計的藥物可包含這種雙重清除抑制機制，從而延長藥物在動物體內(nèi)的半衰期[23](大鼠延長至15 h，猴子延長至110 h)。VRS-317的臨床評估于2012年在50名GHD成人中開始。在這項單次遞增劑量研究中，發(fā)現(xiàn)VRS-317是有效的，耐受性良好，沒有意外或嚴重的不良事件，確定其半衰期為131 h，這表明VRS-317是潛在的按月劑量進行治療的良好藥物[30]。

3.2 XTEN與艾塞那肽融合艾塞那肽是一種39個氨基酸的肽，其作用類似于胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，目前以byetta的形式出售以治療T2D(2型糖尿病)。由于其體積小且腎臟清除迅速，byetta的血漿半衰期為2.4 h，每天需用藥2次。byetta治療最常見的副作用是惡心、嘔吐和腹瀉[31]。2012年，byetta的緩釋版本bydureon被FDA批準(zhǔn)為首個每周1次用于治療T2D的藥物。然而，bydureon的注射部位結(jié)節(jié)發(fā)病率很高[32]。為了延長艾塞那肽的循環(huán)半衰期，將XTEN與該肽的C末端融合，融合分子被稱為VRS-859[5]。VRS-859已在動物模型中進行了廣泛測試，根據(jù)在小鼠、大鼠、猴和犬中確定的藥代動力學(xué)參數(shù)，預(yù)計在人體內(nèi)的半衰期為139 h[23]。

3.3 XTEN與胰高血糖素樣肽2融合teduglutide在美國以gattex的名義出售，在歐洲以revestive的名義出售，是一種胰高血糖素樣肽2(GLP2)類似物，適用于治療患有節(jié)段性回腸炎疾病。與天然GLP2相比，teduglutide(GLP2-2G)在第2位具有甘氨酸取代基，增加了其半衰期和穩(wěn)定性，從而將人的半衰期從7 min延長至3～5 h[33-35]。即使在循環(huán)半衰期有所增加的情況下，仍需每天服用teduglutide。這時長效GLP2-2G-XTEN有更高的療效以及更少的給藥頻率。GLP2-2G-XTEN是通過GLP2-2G肽在其C端與864個氨基酸長XTEN遺傳融合而產(chǎn)生的。在小鼠、大鼠和猴中，GLP2-2G-XTEN血漿半衰期分別顯著延長至34，38,120 h。根據(jù)異速生長比例，估計在人體內(nèi)的半衰期為240 h[16]。

3.4 XTEN與胰高血糖素融合低血糖癥是糖尿病治療中最常見的并發(fā)癥，影響90%的糖尿病人群，嚴重低血糖癥患者的死亡風(fēng)險會增加[36-37]。Gcg是一種能夠?qū)⒏翁窃鎯α哭D(zhuǎn)化為葡萄糖以釋放到血液中的肽激素，通常在這種急性降血糖危機的情況下使用。由于其在液體制劑中的溶解性和穩(wěn)定性差，目前市場上銷售的Gcg為凍干粉，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。天然Gcg的半衰期非常短，為8～18 min[38]，因此不適合在夜間低血糖癥中預(yù)防使用[39-40]。由于XTEN蛋白聚合物能夠改善多肽的溶解度、穩(wěn)定性和半衰期，因此由XTEN修飾的Gcg可用于夜間低血糖預(yù)防性治療。XTEN144-Gcg是通過將144個氨基酸長的XTEN重組融合到Gcg的C端而產(chǎn)生的。Gcg-XTEN144的溶解度比天然胰高血糖素高60倍，可以進行液體配制。在禁食的比格犬模型中，發(fā)現(xiàn)Gcg-XTEN144和天然Gcg均可引起血糖快速升高。但只有Gcg-XTEN144的作用持續(xù)了10～12 h，而Gcg的作用在2 h后恢復(fù)[6]。這些數(shù)據(jù)表明，Gcg-XTEN144有潛力成為預(yù)防夜間低血糖的有效藥物療法。

3.5 XTEN與凝血因子融合血友病a和b分別是由凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ)活性不足引起的遺傳性出血性疾病。血友病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是通過定期輸注血漿來源的FⅧ/FⅨ或重組FⅧ/FⅨ來替代缺失的凝血因子，在血液中保持一定的凝結(jié)活性以防止出血[39-40]。此方案的臨床結(jié)果顯著改善，但由于這些凝血因子的半衰期短，導(dǎo)致了很高的治療費用，因此需要延長其血漿半衰期。將FⅦ與288個氨基酸的XTEN的C端連接并表達出蛋白，通過常規(guī)色譜方法純化[41-42]，評估血友病a小鼠單次靜脈內(nèi)輸注后不同時間點的可溶性組織因子凝血酶原時間活性來確定藥代動力學(xué)，還觀察到終末半衰期顯著延長(從1.2 h延長至8.9 h)[43]，以及在藥代動力學(xué)曲線下的回收率和面積顯著增加(表2)。

這些結(jié)果證明XTEN蛋白融合可以成功應(yīng)用于復(fù)雜生物制劑，融合表達是一種可行的方式并顯著延長多肽藥物的半衰期以及改善藥代動力學(xué)參數(shù)。

4 總結(jié)與展望

XTEN蛋白修飾結(jié)合了聚合物理想的物理化學(xué)性質(zhì)和DNA編碼蛋白質(zhì)合成的精確性，其設(shè)計是專門用于模仿PEG的有益特性，同時避免了其某些缺點，例如具有免疫原性和缺乏生物降解性[47]。XTEN與多肽藥物的融合導(dǎo)致其半衰期比原肽延長了60～130倍，此外還提高了其熱穩(wěn)定性和溶解性。但與所有延長藥物半衰期的方法一樣，XTEN蛋白修飾技術(shù)也具有一些缺點和不足，比如： XTEN及其修飾的多肽都必須由天然L-氨基酸組成，融合蛋白以線性單向多肽的形式產(chǎn)生，修飾后表達系統(tǒng)和純化步驟等還有待探索和優(yōu)化。然而，隨著XTEN修飾技術(shù)研究的不斷深入，這些缺點和不足必將得到克服。XTEN修飾已不限于XTEN蛋白與目的肽和蛋白質(zhì)的末端融合，XTEN還可以在體外與其他類型的生物活性分子共價化學(xué)偶聯(lián)，這樣既可以將反應(yīng)性基團放置在XTEN序列內(nèi)的受控位置，也可以放置在其他附著位置。XTEN不僅可以作為一種可生物降解的填充劑，而且可以作為一個組裝平臺，將靶向部分和細胞毒性因子等多種功能結(jié)合到新的治療方法中，用于更多的臨床適應(yīng)癥。目前一些融合蛋白產(chǎn)物已進入臨床試驗階段，如VRS-859、VRS-317等，隨著研究的不斷深入， XTEN蛋白修飾技術(shù)必將成為延長蛋白質(zhì)和多肽藥物半衰期不可或缺的有效手段，從而促進這類藥物的臨床應(yīng)用。

表2 XTEN修飾多肽藥物與原藥的半衰期