李一鳴，李 麗,2，張凱悅，張彥明*，姜艷芬*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.威海市文登區(qū)人才創(chuàng)新發(fā)展中心，山東 威海 264400)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是一種廣泛分布于環(huán)境和動物腸道中的革蘭陽性厭氧梭狀芽孢桿菌，屬于條件性致病菌[1-2]。當(dāng)動物(機(jī)體)免疫力下降或環(huán)境劇烈變化引起應(yīng)激時(shí)，可造成腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)氣莢膜梭菌迅速繁殖，產(chǎn)生的大量毒素?fù)p壞腸黏膜上皮細(xì)胞的完整性，使腸道黏膜的通透性增加，細(xì)菌和毒素進(jìn)入血液循環(huán)，造成壞死性腸炎和腸毒血癥等疾病[3-4]。該菌分為A～G 7個(gè)血清型[5]，其中A～E型引起羊發(fā)病，A型是引起羊“猝死癥”的主要原因，產(chǎn)生α毒素；B型是羔羊痢疾和綿羊出血性腸炎的病原，產(chǎn)生α、β和ε毒素；C型引起綿羊、山羊、羔羊等腸毒血癥，產(chǎn)生α和β毒素；D型引起山羊、綿羊腸毒血癥，產(chǎn)生α和ε毒素；E型主要引起羔羊腸毒血癥，產(chǎn)生α和ι毒素，我國目前還沒有關(guān)于E型菌株分離的報(bào)道。

目前，產(chǎn)氣莢膜梭菌病已廣泛分布于全國各地，以潛伏期短、發(fā)病急、死亡快為特點(diǎn)，嚴(yán)重危害中國畜牧業(yè)的發(fā)展[6-7]。據(jù)青海省海北州祁連縣綿羊發(fā)病死亡情況調(diào)查，平均3.9%的病死率中，致死率達(dá)到1.7%，接近綿羊發(fā)病死亡的50.0%[8]。近些年，隨著養(yǎng)羊業(yè)不斷向著集約化、規(guī)?；l(fā)展，該種疾病的報(bào)告病例呈上升趨勢，急需采取有效措施，切實(shí)做好防控工作[9]。因此，建立一種快速鑒別診斷方法已迫在眉睫。本研究建立了針對A、B、C、D型羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的α、β和ε毒素基因的多重?zé)晒舛?PCR檢測方法，定量檢測不同型的產(chǎn)氣莢膜梭菌，為更好地防控產(chǎn)氣莢膜梭菌病，有效降低該類疫病的發(fā)病率提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株產(chǎn)氣莢膜梭菌A型(CVCC49)、B型(CVCC54)、C型(CVCC59)、D型(CVCC84)，均購自中國獸醫(yī)菌種保藏中心；鏈球菌(CVCC 1887)、沙門菌(CVCC2185)、大腸埃希菌(ATCC 25922)、腐敗梭菌(CVCC 60021)和金黃色葡萄球菌(ACCC 01011)均由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器Premix Ex Taq 2×Probe qPCR購自寶生物(大連)公司；液體巰基乙醇酸鹽培養(yǎng)基(FTG)和腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)購自北京奧博星生物公司；糞便、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)公司；CFX96 Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 引物和探針的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中收錄的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因序列，查閱并參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，應(yīng)用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)了cpa、cpb和etx3種毒素基因特異性引物及TaqMan探針，由寶生物(大連)公司合成，引物及探針的序列、擴(kuò)增長度見表1。

表1 熒光定量PCR引物及探針序列

1.4 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備以B型產(chǎn)氣莢膜梭菌為模板，進(jìn)行cpa、cpb和etx基因目的片段PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化回收?；厥债a(chǎn)物cpa與pMD18-T載體、cpb/etx與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)。通過藍(lán)白斑篩選，挑取單克隆白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，檢測陽性的送西安擎科生物公司測序。測序結(jié)果與克隆基因目的片段完全一致的陽性克隆接種Amp+LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒。根據(jù)計(jì)算公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)(拷貝/μL)= 阿氏常數(shù)×質(zhì)粒質(zhì)量濃度(g/μL)/質(zhì)粒相對分子質(zhì)量(g/moL)，進(jìn)行質(zhì)?？截悢?shù)濃度換算，-20℃保存?zhèn)溆茫鳛闊晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 單項(xiàng)熒光定量PCR方法的建立將引物和探針均稀釋為10 μmol/L(etx-Pr稀釋為5 μmol/L)，引物和探針的加入量分別為0.5,1.0，2.0 μL，退火溫度為53,54,55,56℃ 4個(gè)梯度，互相組合進(jìn)行試驗(yàn)。對所得的每個(gè)濃度梯度的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)進(jìn)行比較，以產(chǎn)生Ct值最小和標(biāo)準(zhǔn)偏差最小值兩者綜合指數(shù)為依據(jù)選擇最佳引物、探針濃度和退火溫度。分別按照建立的單項(xiàng)熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行敏感性、特異性及重復(fù)性試驗(yàn)。

1.6 多重?zé)晒舛縋CR方法的建立

1.6.1反應(yīng)體系條件的確立 依據(jù)已優(yōu)化的單項(xiàng)熒光定量PCR的引物濃度進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR的引物和探針及退火溫度的優(yōu)化。

1.6.2敏感性試驗(yàn) 按照已建立的多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件，以10倍梯度稀釋制備成1×109～1×100拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)3次，建立動力學(xué)擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3特異性試驗(yàn) 按照已建立的反應(yīng)條件對產(chǎn)氣莢膜梭菌A、B、C、D型菌、鏈球菌、沙門菌、大腸埃希菌、腐敗梭菌和金黃色葡萄球菌，以菌液為模板在相同條件下進(jìn)行熒光定量PCR檢測，觀察反應(yīng)的特異性。

1.7 基因組DNA和菌液熒光定量PCR敏感性檢測提取B型產(chǎn)氣莢膜梭菌DNA，測質(zhì)量濃度后將其稀釋為1 mg/L，再以10倍梯度稀釋制備成1×10-1～1×10-9mg/L的DNA為模板，每個(gè)梯度重復(fù)3次進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其靈敏度；另取100 μL B型菌液倍比稀釋8個(gè)梯度，以各梯度菌液為模板，每個(gè)梯度重復(fù)3次進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)檢測其靈敏度；同時(shí)分別吸取10-4～10-7梯度菌液各100 μL涂布TSC平板，每個(gè)梯度2個(gè)重復(fù)，37℃厭氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算原始菌液濃度及各梯度DNA所對應(yīng)的菌落數(shù)。

1.8 臨床樣品檢測根據(jù)糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，對采集的20份健康山羊糞便提取DNA，應(yīng)用本研究建立的方法進(jìn)行檢測，同時(shí)，根據(jù)GB 4789.13—2012《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌》對樣品進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)及分離鑒定[11]，計(jì)算符合率，驗(yàn)證該方法的實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在137,113,133 bp處分別有1條特異性條帶，擴(kuò)增結(jié)果與設(shè)計(jì)的目的片段長度相符(圖1)。經(jīng)純化回收、連接轉(zhuǎn)化、PCR鑒定，測序鑒定的陽性克隆接種Amp+LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒。測定質(zhì)粒質(zhì)量濃度：cpa-pMD18-T為259.12 mg/L，cpb-pGEM-T為243.86 mg/L，etx-pGEM-T為114.90 mg/L。計(jì)算的重組質(zhì)?？截悢?shù)分別為8.35×1010,7.11×1010,3.33×1010拷貝/μL。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品-20℃ 保存?zhèn)溆?，同時(shí)將質(zhì)粒的一部分稀釋制備成1×109～1×100拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

M.DL2000 DNA Marker;1～2.cpa;4～5.cpb；7～8.etx;3,6,9.陰性對照

2.2 單項(xiàng)熒光定量PCR方法的建立

2.2.1反應(yīng)體系條件的確立 經(jīng)優(yōu)化，最終確立的單項(xiàng)熒光定量PCR引物和探針的最佳濃度分別為cpa-F/R/P 0.4 μmol/L，cpb-F/R/P 0.8 μmol/L，etx-F/R 0.4 μmol/L，etx-P 0.2 μmol/L。退火溫度為55℃。反應(yīng)程序同多重?zé)晒舛縋CR。

2.2.2敏感性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，最低檢測限均為1×102拷貝/μL，除cpa-pMD18-T的1×101拷貝/μL有擴(kuò)增曲線和熒光信號外(但Ct>36)(圖2B)，其他1×101～1×100拷貝/μL均無擴(kuò)增曲線和熒光信號(圖2D，2F)。cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T的擴(kuò)增效率分別為101.1%，91.6%，102.0%，R2分別為0.998，0.998，0.999(圖2A,C,E)。

2.2.3特異性與重復(fù)性 結(jié)果顯示，在有效循環(huán)內(nèi)除了以1×1010拷貝/μL標(biāo)準(zhǔn)品為模板的PCR反應(yīng)起峰外，以鏈球菌、沙門菌、大腸埃希菌、腐敗梭菌和金黃色葡萄球菌菌液為模板和陰性對照的PCR反應(yīng)均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)。通過計(jì)算，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的CV值均小于4%。

A,B.藍(lán)色為cpa-pMD18-T;C,D.綠色為cpb-pGEM-T;E,F.橙色為etx-pGEM-T

2.3 多重?zé)晒舛縋CR方法的建立

2.3.1反應(yīng)體系及條件的確立 經(jīng)優(yōu)化，最終確立的多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 2×Probe qPCR 12.5 μL，cpa-F/R/P(10 μmol/L)各1 μL，cpb-F/R/P(20 μmol/L)各1 μL，etx-F/R(20 μmol/L)各0.5 μL，etx-P(5 μmol/L)1 μL，cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T、etx-pGEM-T各1 μL，最后用ddH2O將反應(yīng)體積補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；在退火階段檢測熒光信號。

2.3.2敏感性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 多重?zé)晒舛縋CR敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，最低檢測限均為1×102拷貝/μL，除etx-pGEM-T的1×101拷貝/μL有擴(kuò)增曲線和熒光信號外(但Ct>36)，其他1×101～1×100拷貝/μL均無擴(kuò)增曲線和熒光信號(圖3B)。結(jié)果與單項(xiàng)熒光定量PCR基本一致。cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T的擴(kuò)增效率分別為95.0%，91.2.%,101.3%，R2分別為0.990，0.991,0.999(圖3A)。

a.cpa-pMD18-T；b.cpb-pGEM-T；c.etx-pGEM-T

2.3.3特異性 多重?zé)晒舛縋CR特異性檢測結(jié)果顯示，A(α毒素)、B(α、β和ε毒素)、C(α和β毒素)、D(α和ε毒素)型產(chǎn)氣莢膜梭菌均出現(xiàn)cpa擴(kuò)增曲線，同時(shí)B型菌出現(xiàn)cpb和etx2條擴(kuò)增曲線，C和D型菌分別出現(xiàn)cpb和etx擴(kuò)增曲線，以其他常見細(xì)菌菌液為模板和陰性對照的PCR反應(yīng)均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)(圖4)，說明該方法具有良好的特異性。

1.cpa-pMD18-T、cpb-pGEM-T和etx-pGEM-T；2.A型菌；3.B型菌；4.C型菌；5.D型菌；6.ddH2O；7.鏈球菌；8.沙門菌；9.大腸埃希菌；10.腐敗梭菌；11.金黃色葡萄球菌

2.3.4重復(fù)性 通過計(jì)算，批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)cpa、cpb和etx的CV值分別為0.27%～0.85%,1.02%～2.08%,1.23%～2.26%。批間重復(fù)試驗(yàn)cpa、cpb和etx的CV值分別為0.44%～1.88%,1.00%～2.30%,0.44%～2.08%。以上CV值均小于4%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.3.5菌液和基因組DNA熒光定量PCR敏感性檢測 熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，B型菌液稀釋至5.0×106～5.0×102CFU/mL，具有較好擴(kuò)增曲線及線性關(guān)系，因此，其檢測限為5.0×102CFU/mL。cpa、cpb和etx的擴(kuò)增效率分別為101.5%，94.8%,92.1%，R2分別為0.994，0.997,0.999(圖5A，B)?；蚪MDNA稀釋至1.0×100～1.0×10-4mg/L，其對應(yīng)的菌落數(shù)為2.91×106～2.91×102CFU/mL，具有較好的擴(kuò)增曲線及線性關(guān)系，因此，其檢測限為100 μg/L和2.91×102CFU/mL。cpa、cpb和etx的擴(kuò)增效率分別為82.3%,73.4%,79.6%，R2分別為0.999,0.996,0.999(圖5C，D)。

2.3.6臨床樣品檢測 熒光定量PCR結(jié)果顯示，20份樣品中16份樣品檢測到cpa，其中2份樣品檢測到etx，B型DNA作陽性對照擴(kuò)增出cpa、cpb和etx，其他樣品cpa、cpb和etx均為陰性(圖6)。D型菌株DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示cpa比etx的Ct值大1.7左右，etx的表達(dá)量高于cpa。然而，2份樣品出現(xiàn)etx的Ct值大于cpa，cpa的表達(dá)量高于etx，推測樣品中既含A型又含D型菌。根據(jù)B型標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落數(shù)為102～104CFU/g，2份含D型菌樣品的A和D型菌菌落數(shù)均為102CFU/g，與菌落計(jì)數(shù)結(jié)果相比符合率達(dá)90%。樣品經(jīng)分離純化，陽性分離率為80%且均為A型菌，與熒光定量PCR結(jié)果相比，1株熒光定量PCR檢測陽性但細(xì)菌分離鑒定結(jié)果為陰性，另有1株細(xì)菌分離鑒定為陽性但熒光定量PCR檢測為陰性，因此，該符合率為90%。說明此方法有良好的實(shí)用價(jià)值，且方便快捷可對羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行分型及定量檢測。

A.菌液標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.菌液敏感性；C.DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線；D.DNA敏感性(藍(lán)色.cpa；綠色.cpb；橙色.etx)

1～3.B型DNA cpa、cpb、etx擴(kuò)增曲線；4.陽性糞便樣品；5.陰性糞便樣品和陰性對照

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌不僅能引起多種動物的多種疾病和造成家畜的大量死亡，而且也直接危害著人類的健康。目前，已知羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌主要引起羔羊和幼齡羊患病，對其他年齡段的羊只也有影響，但癥狀并不嚴(yán)重，雖然該病的發(fā)病率較低，但病死率卻很高。盡管接種疫苗大大降低了該病的發(fā)病率，但該病仍經(jīng)常發(fā)生[12]，給我國養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

現(xiàn)階段關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測方法主要包括多重PCR、LAMP、熒光定量PCR等[13-15]，但多重PCR檢測耗時(shí)長、流程較繁瑣，LAMP需要設(shè)計(jì)多條特異性引物、且易產(chǎn)生假陽性。而TaqMan熒光定量PCR技術(shù)是一種擁有較多優(yōu)勢的分子生物學(xué)方法，既可定性又可達(dá)到定量的目的。因此，建立針對A、B、C、D型羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的α、β和ε毒素基因的多重?zé)晒舛縋CR檢測方法。該方法可在1個(gè)體系內(nèi)同時(shí)對96個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)毒素的檢測，在臨床中，對液體樣品(飲水、污水或羊奶等)或經(jīng)初步FTG厭氧培養(yǎng)的樣品直接檢測，固體樣品(糞便或飼料等)可提取總DNA后檢測[16]，依據(jù)建立的菌液和基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量監(jiān)測。

本研究建立的熒光定量方法在敏感性方面，cpa、cpb和etx質(zhì)?？截悢?shù)均可達(dá)1×102拷貝/μL(3.1×10-7mg/L)，而張蓉蓉等[17]建立的方法檢測限為1.5×10-5mg/L。菌液檢測限為5.0×102CFU/mL，DNA檢測限為100 μg/L，WISE等[18]建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度為50 μg/L，與本實(shí)驗(yàn)室建立的多重PCR檢測方法的靈敏度(2.6×104CFU/mL)相比提高了100倍[13]。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性。

應(yīng)用建立的多重?zé)晒舛縋CR方法，在采集的20份健康山羊糞便樣品中，14份檢測到A型，2份檢測到既含A型又含D型菌。然而，經(jīng)分離純化鑒定均為A型菌。傳統(tǒng)分離鑒定方法雖無靈敏度限制，只要樣品中含目的菌，就可檢測到，但純化過程由于只挑取單個(gè)菌落，存在漏檢情況，導(dǎo)致最終結(jié)果不準(zhǔn)確，同時(shí)，樣品菌落計(jì)數(shù)需要進(jìn)行厭氧培養(yǎng)24 h以及菌落的鑒定，耗時(shí)長，過程繁瑣。本研究建立的方法可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法存在的弊端，不僅準(zhǔn)確快速地對樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行分型，而且可以實(shí)時(shí)監(jiān)測。該方法不僅為產(chǎn)氣莢膜梭菌引發(fā)疾病的生物安全提供快速便捷的技術(shù)支持，也為這些疾病的臨床檢測提供輔助手段。