洪 磊，陳 祥，唐 文，周志楠

(貴州大學 動物科學學院 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室/貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

類固醇激素是動物體內(nèi)最主要的一類性腺激素,包括雄激素、雌激素和孕酮等[1]，參與動物的生殖調(diào)控，與動物的繁殖性狀密切相關。類固醇5α還原酶2(steroid 5 alpha-reductase 2,SRD5A2)是微粒體蛋白，能催化睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮[2]。20世紀90年代初，ANDERSSON等[3]首先克隆了SRD5A2的2種異構體全長cDNA，分別命名為1、2型微粒體蛋白。SRD5A2基因決定著哺乳類(包括人類)胚胎生殖道原始細胞的分化和性別發(fā)育[4]。二氫睪酮結合雄激素受體后啟動外生殖器發(fā)育，使其分化為男性型并促進前列腺發(fā)育，若該酶缺陷會引起男性型分化障礙。研究顯示SRD5A2基因與生殖系統(tǒng)及前列腺組織發(fā)育有關[5]，SRD5A2基因缺乏，會造成女性生殖能力低下的臨床癥狀。ZI等[6]比較多羔金堂黑山羊和單羔藏羊卵巢基因轉(zhuǎn)錄表達情況，結果顯示SRD5A2基因在多羔金堂黑山羊卵巢組織表達高于在單羔藏羊卵巢組織，推測其可能與金堂黑山羊高繁殖性能有關。ZOU等[7]對單、多羔川中黑山羊卵巢進行RNA高通量測序，結果發(fā)現(xiàn)SRD5A2基因在類固醇激素生物合成中顯著富集。通過檢測SRD5A2基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔性狀相關基因表達量變化，有助于探究SRD5A2基因?qū)η甭檠虍a(chǎn)羔性狀的調(diào)控機制。而生長因子對動物卵泡發(fā)育有著極其重要作用，山羊繁殖相關基因包括轉(zhuǎn)化生長因子超家族β(TGFβ)中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)、生長分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白1B(BMPR-1B)，他們是卵巢中啟動卵泡發(fā)育以及調(diào)節(jié)排卵的必要生長因子[8-11]，是山羊多羔性狀候選基因。MIAO等[12]通過對濟寧青山羊和萊蕪黑山羊的卵巢RNA-Seq發(fā)現(xiàn)，miR-187和miR-874這2個miRNA可以通過調(diào)節(jié)BMPR-1B、SRD5A2等基因的表達而調(diào)控山羊的繁殖力。BMP15與GDF9基因共同作用于卵泡，影響優(yōu)勢卵泡的選擇和閉鎖卵泡的形成，調(diào)控顆粒細胞的增殖和分化。促卵泡素(FSH)是一種由垂體前葉分泌的糖蛋白激素，它與性腺細胞受體結合，促使顆粒細胞增殖，刺激類固醇合成，從而調(diào)節(jié)配子細胞的發(fā)育和成熟，F(xiàn)SH由α和β兩個亞基組成，β亞基決定著FSH的生物活性[13]。促卵泡素β亞基(FSHB)在山羊繁殖過程中起著重要作用，是山羊高繁殖性狀的主效基因。因此，SRD5A2基因是否通過影響產(chǎn)羔相關基因表達來參與調(diào)控山羊產(chǎn)羔性狀，是本研究主要目的之一。

黔北麻羊是貴州地方三大優(yōu)良山羊品種之一，具有良好的種質(zhì)特性，如遺傳性能穩(wěn)定，抗病力強，合群性好，適應性強等特點[14]，有較高研究價值。研究其多羔遺傳分子機制，對培育多胎黔北麻羊新品系和提高黔北麻羊養(yǎng)殖效益具有重要意義。本研究通過克隆黔北麻羊SRD5A2基因，構建SRD5A2基因真核表達載體并培養(yǎng)黔北麻羊卵巢顆粒細胞用于轉(zhuǎn)染，檢測SRD5A2基因?qū)毎鲋澈彤a(chǎn)羔性狀相關基因表達的影響，為探究SRD5A2基因?qū)η甭檠虍a(chǎn)羔性狀調(diào)控的分子機制及提高產(chǎn)羔性能的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗動物來自貴州省習水縣富興牧業(yè)有限公司，選擇健康的(2～3歲)黔北麻羊經(jīng)產(chǎn)母羊6只，體質(zhì)量均勻，平均體質(zhì)量38 kg。參照貴州省地方標準《羊屠宰操作規(guī)程》(DB22/T 2740—2017)進行屠宰，采集卵巢組織，用75%酒精沖洗3次，置于含雙抗的PBS溶液中保存，4～5 h內(nèi)進行分離培養(yǎng)卵巢顆粒細胞及RNA提取。

1.2 主要試劑及儀器快速瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T-克隆PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、pMD19-T載體連接試劑盒均購自生工生物工程技術有限公司(上海)；氨芐青霉素、TOP10感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司； EcoRⅠ和BamHⅠ酶購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑購自貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司；10×QuickCut Green Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司；Hi Fi Script cDNA第1鏈合成試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒等購自北京康為世紀生物科技有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、PBS溶液、DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基、胰蛋白凍等購自廣州飛揚生物工程有限公司。

1.3 相關基因的引物設計根據(jù)NCBI上傳的山羊SRD5A2、BMP15、BMPR-1B、GDF9、FSHB基因mRNA序列，以β-actin為內(nèi)參基因，利用Primer 5.0 軟件進行引物設計和酶切位點分析，在SRD5A2基因5′端添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點，由生工生物工程技術有限公司(上海)進行合成(表1)。

表1 PCR反應引物信息

1.4 總RNA提取及cDNA合成采用TRIzol法提取黔北麻羊的卵巢組織的總RNA，并吸取1 μL測定總RNA濃度和純度，D260/D280值為1.8～2.0，-80℃保存。按照Hi Fi Script cDNA第1鏈合成試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行濃度和純度檢測，D260/D280值為1.7～1.9，-20℃保存。

1.5 目的片段合成及回收以cDNA為模板，進行SRD5A2基因CDS區(qū)克隆，PCR反應體系(20 μL)：2×Es Taq Master Mix 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各 1.0 μL，無酶水5.5 μL，2 mg/L cDNA模板2.5 μL。PCR反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃終延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增目的產(chǎn)物。將發(fā)光較亮且長度符合條帶，按照膠回收試劑盒操作步驟進行目的片段回收，取1 μL反應產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計進行濃度和純度檢測。

1.6 PCR產(chǎn)物連接與測序?qū)⒛z回收產(chǎn)物與pMD19-T載體在16℃恒溫下連接過夜。將連接液加入到TOP10感受態(tài)細胞中，冰上靜置30 min，42℃水浴熱激90 s，再次冰上靜置20 min 后，加入不含抗生素液體培養(yǎng)基700 μL，固定于37℃培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)1 h，均勻涂布在制好的LB固體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)進行培養(yǎng)。觀察平板上菌落生長情況，挑取10個白色單菌落置于含有氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h，參照1.5反應條件PCR鑒定菌液。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。挑選與目的條帶大小一致的菌液送至生工生物工程技術有限公司(上海)進行測序。

1.7 SRD5A2基因真核表達載體構建及驗證對重組基因質(zhì)粒和pEGFP-N3空載體進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，使目的片段與pEGFP-N3載體具有相同的黏性末端，酶切體系如下：重組質(zhì)粒/pEGFP-N3空載體8 μL，EcoRⅠ和BamHⅠ分別1 μL，10×QuickCut Green Buffer 2 μL,ddH2O 8 μL，37℃恒溫水浴2 h。雙酶切SRD5A2基因與pEGFP-N3真核表達載體連接，反應體系為0.2 μmol/L目的基因2.5 μL，500 mg/L pEGFP-N3載體1 μL，10×Ligation buffer 1 μL，T4DNA Ligase 0.5 μL，ddH2O 5 μL。連接過夜所得產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。轉(zhuǎn)化及挑菌步驟與1.6相同，雙酶切檢測，篩選陽性菌液，并送至生工生物工程技術有限公司(上海)進行測序。

1.8 山羊卵巢卵泡顆粒細胞的培養(yǎng)與鑒定參考劉曉鵬等[15]方法，將采集新鮮健康黔北麻羊卵巢用75%酒精沖洗后，用滅菌PBS沖洗3～5次，完全去除殘留的酒精后，在DMEM/F-12新鮮培養(yǎng)液中，用醫(yī)用無菌注射器針頭刺入卵巢的卵泡腔，吸取卵泡液，使卵泡液完全釋放，吸取DMEM/F-12培養(yǎng)液吹打使得卵泡液和培養(yǎng)液混合均勻。將混合液吸入至10 mL無菌離心管，靜置10 min后，將上層清液吸入到新的10 mL無菌離心管中，1 000 r/min離心10 min；棄去上清液，加入3 mL DMEM/F-12 培養(yǎng)液，輕吹混和均勻，1 000 r/min離心10 min，此步重復1次；棄去上清液，加入新配制的 DMEM/F-12培養(yǎng)液，含10%胎牛血清和1%雙抗(100 IU/mL青霉素+50 g/L鏈霉素)，輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中，37℃ 5%CO2下培養(yǎng)24 h，使用滅菌的PBS沖洗2次后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

采用免疫熒光染色法，鑒定分離培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞純度，操作步驟參考高可心等[16]的方法。

1.9 SRD5A2基因真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染將卵巢顆粒細胞均勻分裝至6孔板中培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%匯合度時，更換為含10%胎牛血清且無抗生素的培養(yǎng)基，利用LipofectamineTM3000CD Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒，按照說明書將重組質(zhì)粒pEGFP-N3-SRD5A2與轉(zhuǎn)染試劑混合，均勻地滴加到細胞培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染情況。

1.10 超表達SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細胞增殖的影響將細胞分裝于96孔板中，待細胞生長到90%左右的匯合度，更換為含10%胎牛血清且無抗生素的培養(yǎng)基，將pEGFP-N3-SRD5A2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞，分別培養(yǎng)6，12，24，48 h后，更換100 μL新鮮培養(yǎng)基，然后再加入10 μL CCK-8試劑，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測D450值，分析超表達pEGFP-N3-SRD5A2基因?qū)毎鲋车挠绊憽?/p>

1.11 超表達SRD5A2基因?qū)Ξa(chǎn)羔性狀相關基因表達的影響收集空白組細胞和轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-SRD5A2重組質(zhì)粒的細胞，TRIzol法提取細胞RNA，返轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測山羊產(chǎn)羔性狀相關基因SRD5A2、BMP15、BMPR-1B、GDF9、FSHB的mRNA在兩組細胞中的表達量。

1.12 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析采用2-△△Ct法計算，利用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 黔北麻羊SRD5A2基因的克隆與測序利用卵巢組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴增黔北麻羊SRD5A2基因CDS區(qū)，PCR結果如圖1所示，擴增產(chǎn)物條帶清晰度高、特異性強，未發(fā)現(xiàn)有引物二聚體，片段長度與預期片段大小723 bp一致。將擴增的CDS區(qū)序列與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coliTOP10中，挑選菌落進行搖菌與測序。測序結果比對顯示，黔北麻羊SRD5A2基因與NCBI登錄的山羊相應序列具有高度同源性，同源性達到100%，說明已經(jīng)成功構建黔北麻羊SRD5A2基因T克隆載體。

M.DL5000 DNA Marker;1～2.SRD5A2基因擴增片段

2.2 山羊卵巢顆粒細胞的培養(yǎng)鑒定由于FSHR在其他卵泡細胞中不表達，在卵巢顆粒細胞中專一性表達，因此，利用FSHR免疫熒光法鑒定分離培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞。免疫熒光結果顯示，加入FSHR抗體的陽性細胞發(fā)出紅光，表明細胞分泌的FSHR蛋白與FSHR抗體結合(圖2A)，卵巢顆粒細胞的細胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍色(圖2B)，細胞核染色和細胞質(zhì)染色完全重合(圖2C)，說明山羊卵巢顆粒細胞培養(yǎng)鑒定成功，經(jīng)鑒定細胞純度高于90%，可以用于后續(xù)試驗。

A.FSHR染色；B.DAPI染色；C.A+B合成圖

2.3 黔北麻羊SRD5A2真核表達載體的構建及細胞水平的檢測重組載體pEGFP-N3-SRD5A2經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，獲得約4 692 ,723 bp 2個條帶，分別為pEGFP-N3載體和SRD5A2基因CDS區(qū)片段，表明真核表達載體構建成功(圖3)。將pEGFP-N3-SRD5A2重組質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測序，結果顯示，黔北麻羊SRD5A2基因與NCBI上傳的山羊SRD5A2基因的序列完全吻合。將重組質(zhì)粒pEGFP-N3-SRD5A2轉(zhuǎn)染到卵巢顆粒細胞中，24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細胞在熒光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光，陰性對照組細胞未見有綠色熒光(圖4)。

1,2.重組載體；M.DL5000 DNA Marker

A.空白對照組;B.N3空載體組;C.SRD5A2基因超表達組

2.4 超表達SRD5A2基因轉(zhuǎn)染效率檢測超表達SRD5A2基因后，RT-qPCR檢測結果顯示(圖5)，轉(zhuǎn)染組SRD5A2基因mRNA水平極顯著高表達于空白組(P<0.01),說明pEGFP-N3-SRD5A2真核表達載體可以顯著提高SRD5A2基因表達，SRD5A2基因超表達載體構建并轉(zhuǎn)染成功,可進行下一步試驗。

2.5 超表達SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細胞增殖的影響CCK-8檢測結果由圖6可知，超表達SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細胞增殖均具有促進作用，在6,12,24 h顯著促進細胞增殖(P<0.05)，48 h 達到極顯著促進作用(P<0.01),初步證明SRD5A2基因能促進卵巢顆粒細胞增殖。

2.6 超表達SRD5A2基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔性狀相關基因的影響轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒成功組細胞BMPR-1B、BMP15和FSHB基因的mRNA表達水平極顯著高于空白對照組(P<0.01)，GDF9基因mRNA表達水平顯著高于空白對照組(P<0.05)。結果表明,超表達SRD5A2基因可促進產(chǎn)羔相關基因BMPR-1B、BMP15、GDF9、FSHB在黔北麻羊卵巢顆粒細胞中的表達(圖7)。

注：*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。下同

圖6 超表達SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細胞增殖的影響

圖7 超表達SRD5A2基因?qū)Ξa(chǎn)羔性狀相關基因的表達影響

3 討論

SRD5A是一種位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白質(zhì)，能催化睪酮轉(zhuǎn)化為另一種雄激素—二氫睪酮(DHT)，在性分化及雄激素生理中發(fā)揮重要作用。目前已知，在人類和大鼠體內(nèi)，至少存在2種5α-還原酶，即5α-還原酶1型和2型。研究顯示SRD5A2基因參與調(diào)控哺乳類(包括人類)胚胎生殖道原始細胞的分化和發(fā)育性別，與動物繁殖密切相關。為了闡明SRD5A2基因在黔北麻羊產(chǎn)羔性能中的具體調(diào)控機制，本研究成功分離培養(yǎng)了黔北麻羊卵巢顆粒細胞，并構建pEGFP-N3-SRD5A2真核表達載體，進一步將載體轉(zhuǎn)染至黔北麻羊卵巢顆粒細胞中，為后續(xù)研究該基因在卵巢顆粒細胞中的功能提供理想的試驗材料。細胞增殖是生活細胞的重要生理功能之一，是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎。研究發(fā)現(xiàn)抑制SRD5A2基因表達可以降低前列腺癌細胞增殖，說明該基因?qū)η傲邢侔┘毎鲋尘哂写龠M作用[17]。超表達SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細胞在6～48 h的增殖均具有促進作用，初步證明SRD5A2基因能促進黔北麻羊卵巢顆粒細胞的增殖。

產(chǎn)羔數(shù)是山羊重要的繁殖性狀之一，受到多基因的調(diào)控。多羔候選基因BMPR-1B、BMP15、GDF9和FSHB等與羊產(chǎn)羔數(shù)存在一定的關聯(lián)。本試驗進一步研究超表達SRD5A2基因?qū)η甭檠蚵殉差w粒細胞中產(chǎn)羔相關基因表達的影響。GOYAL等[18]研究結果表明，BMPR-1B、BMP15和GDF9在綿羊黃體期卵巢中均高表達，在其他組織中也存在不同程度表達，說明這3個基因具有廣泛生物學功能并在卵巢中發(fā)揮重要作用。BMPR-1B基因在綿羊卵巢中的顆粒細胞和卵母細胞中特異性表達，影響顆粒細胞分化和卵泡發(fā)育，具有促進排卵的作用[19]。本試驗結果表明，超表達SRD5A2基因后，BMPR-1B基因在卵巢顆粒細胞中的表達顯著提高(P<0.01)，推測SRD5A2基因可能通過促進BMPR-1B基因在卵巢顆粒細胞中的表達來促進排卵，從而影響黔北麻羊產(chǎn)羔性狀。BMP15是豬、牛、羊的多胎候選基因[20-22]。劉霜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BMP15基因在多羔金堂黑山羊卵巢中的mRNA表達量高于單羔藏山羊(P<0.05)，說明卵巢中BMP15基因的表達量與金堂黑山羊多羔性狀相關。相同的，CUI等[24]在單羔云嶺黑山羊與多羔波爾山羊的比較研究中也發(fā)現(xiàn)，波爾山羊卵巢BMP15基因的表達量顯著高于云嶺黑山羊。GDF9基因是另一種影響綿羊多胎性的基因[25]，主要由卵母細胞分泌，對卵泡的生長和分化、胚胎的發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)的湖羊卵泡中的GDF9基因表達量顯著高于低產(chǎn)的湖羊群體[26]。FSH和促黃體素(LH)都是糖蛋白類促性腺激素[27]，是控制哺乳動物生殖的核心激素，由垂體前葉嗜堿性細胞合成和分泌。劉建斌等[28]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHB基因可能是影響小尾寒羊高繁殖性能的一個主效基因。同樣，ZI等[29]研究報道，發(fā)情期高繁殖力樂至黑山羊腦垂體中FSHB基因的mRNA表達量顯著高于低繁殖力藏山羊。本研究RT-qPCR結果顯示，超表達SRD5A2基因后，BMPR-1B、BMP15、GDF9、FSHB基因的表達量均顯著或極顯著高于空白對照組。因此，結合前人研究結果，推測SRD5A2基因可能通過促進產(chǎn)羔相關基因的表達來參與調(diào)控產(chǎn)羔數(shù)量，進一步證明了SRD5A2基因與黔北麻羊產(chǎn)羔性狀密切相關，具體的調(diào)控機制還有待深入研究。