陳韋任，楊 霞，周玉杰，馬 茜，吳雪萍，沙 媛，錢 賡

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)12病房，北京市心肺血管疾病研究所，冠心病精準(zhǔn)治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029；中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院2第二醫(yī)學(xué)中心心血管內(nèi)科，3第一醫(yī)學(xué)中心心血管內(nèi)科，北京100853

血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、終末期腎病等多種疾病的病理生理基礎(chǔ)，它可以導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、血栓形成等嚴(yán)重后果，是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素［1-3］。血管鈣化主要表現(xiàn)為血管硬度增加和順應(yīng)性下降，其機(jī)制和骨發(fā)育相似，是主動(dòng)的、可以調(diào)節(jié)的過程［4-6］。研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化機(jī)制包括細(xì)胞凋亡、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）由收縮型向成骨樣細(xì)胞表型分化、鈣磷沉積、氧化應(yīng)激等［7-11］。Bax抑制因子-1（BI-1）是抑制程序性壞死信號(hào)通路的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子［12-14］。最新研究證實(shí)BI-1和心血管疾病密切相關(guān)［15-17］。心肌缺血再灌注損傷中，BI-1表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡增加，而激活BI-1能下調(diào)線粒體分裂蛋白表達(dá)，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，減輕再灌注損傷［18］。BI-1對(duì)血管鈣化的具體作用目前尚不清楚。本研究通過建立VSMC鈣化模型，觀察鈣化時(shí)BI-1的表達(dá)和BI-1對(duì)鈣磷沉積、VSMC骨型分化和細(xì)胞凋亡的作用，為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠30只（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供），4周齡，體質(zhì)量80～100 g；主要試劑：β磷酸甘油；氯化鈣；磷酸鹽緩沖液（PBS）；胎牛血清（Hyclone）；DMEM（Gibco）；茜素紅S染色試劑盒、堿性磷酸酶試劑盒（Sigma）；鈣測(cè)定試劑盒（北京中生北控生物公司）；BI-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）（Abcam）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)程已獲批準(zhǔn)，符合首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、模型建立和實(shí)驗(yàn)分組

在潔凈臺(tái)內(nèi)分離4周SD大鼠胸主動(dòng)脈，剝?nèi)ネ饽?，使用眼科剪將血管剪成小碎塊（1 mm2）接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)［19-21］。3～5 d換液傳代1次。經(jīng)免疫組織化學(xué)法和形態(tài)學(xué)檢測(cè)VSMC純度＞95%。

VSMC鈣化模型的制作：將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后加入10 mmol/L β磷酸甘油和7.2 mmol/L氯化鈣誘導(dǎo)14 d，每隔2 d換1次液體［22,23］。

實(shí)驗(yàn)采用隨機(jī)方法分為4組：對(duì)照組（10%胎牛血清的DMEM液培養(yǎng)14 d）、BI-1過表達(dá)組（過表達(dá)BI-1蛋白后，10%胎牛血清的DMEM液培養(yǎng)14 d）、鈣化組（鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d）、鈣化+BI-1過表達(dá)組（過表達(dá)BI-1蛋白后，鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d）。每組檢測(cè)均重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)。

1.3 BI-1過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

建立BI-1過表達(dá)的重組質(zhì)粒（江蘇吉瑪基因技術(shù)有限公司），將VSMC 接種至6 孔板，以脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染BI-1，24 h后裂解細(xì)胞提取蛋白，使用Western blot法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.4 茜素紅S染色

鈣化誘導(dǎo)14 d后，使用4 ℃PBS緩沖液沖洗3次，多聚甲醛固定15～20 min，PBS沖洗3次。標(biāo)本中加入l%茜素紅S（1 g茜素紅S，100 mL蒸餾水），室溫下孵育20 min，PBS沖洗細(xì)胞3次，顯微鏡下觀察紅色鈣化結(jié)節(jié)并拍照。

1.5 Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平

建模成功后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，然后提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算各組上樣量。常規(guī)進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）蛋白電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%牛奶封閉1 h后，加入一抗室溫孵育30 min、4 ℃孵育過夜，洗膜后使用封閉液稀釋的二抗室溫孵育40 min。使用化學(xué)發(fā)光試劑與膜孵育后，暗室曝光，使用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 鈣含量的測(cè)定

建模成功后，4 ℃PBS沖洗細(xì)胞3次，使用0.6 mol/L鹽酸37 ℃孵育24 h進(jìn)行脫鈣處理，次日取上清液用于鈣含量測(cè)定。收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取上清液，BCA定量試劑盒進(jìn)行蛋白測(cè)定。鈣含量標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值=樣品鈣含量／樣品蛋白含量。

1.7 堿性磷酸酶活性測(cè)定

鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d后，4 ℃PBS沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，取上清進(jìn)行測(cè)定。按試劑盒說明書加入緩沖液，37 ℃孵育30 min，終止液終止反應(yīng)，測(cè)定405 nm范圍內(nèi)吸光光度值。BCA方法測(cè)定細(xì)胞總蛋白含量，然后用蛋白含量校正堿性磷酸酶含量。

1.8 VSMC凋亡檢測(cè)（TUNEL法）

細(xì)胞爬片中加入4%多聚甲醛室溫下固定30 min，1%Triton X-100液體通透打孔，爬片加入末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)液混勻，沖洗3次后，加入標(biāo)記液37 ℃反應(yīng)30 min，熒光顯微鏡下觀察照相。凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間作t檢驗(yàn)分析，多組間采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSMC鈣化中BI-1蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot結(jié)果可見隨著鈣化時(shí)間的延長(zhǎng)，BI-1蛋白水平逐漸下降。鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)第3d，BI-1蛋白表達(dá)開始下降；誘導(dǎo)第7 d，BI-1蛋白下降明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007），誘導(dǎo)第14 d 下降達(dá)到最低值（P=0.001），結(jié)果提示BI-1蛋白和鈣化時(shí)間存在負(fù)反饋關(guān)系（圖1）。

圖1 鈣化誘導(dǎo)后血管平滑肌細(xì)胞BI-1蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of BI-1 protein in vascular smooth muscle cells with induced calcification.*P＜0.01 vs 0 d,#P＜0.01 vs 7 days.

2.2 過表達(dá)BI-1蛋白對(duì)細(xì)胞鈣磷沉積的影響

鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d后，鈣化組茜素紅S染色可見彌漫性紅色鈣化結(jié)節(jié)，而BI-1蛋白過表達(dá)后鈣化被抑制，鈣化結(jié)節(jié)消退（圖2）。另外我們還測(cè)定了細(xì)胞鈣含量和堿性磷酸酶活性。細(xì)胞鈣含量結(jié)果提示，VSMC鈣化后，鈣含量明顯增加，而過表達(dá)BI-1可以顯著減少細(xì)胞鈣含量（P=0.0002，圖3）。堿性磷酸酶結(jié)果提示，VSMC鈣化后，堿性磷酸酶活性明顯增加，而BI-1過表達(dá)能明顯降低堿性磷酸酶活性（P=0.0006，圖4）。

圖2 各組血管平滑肌細(xì)胞茜素紅S染色結(jié)果Fig.2 Alizarin red S staining of the cells in the 4 groups.

圖3 各組血管平滑肌細(xì)胞鈣含量Fig.3 Comparison of calcium content in the cells in the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

圖4 各組血管平滑肌細(xì)胞堿性磷酸酶活性Fig.4 Comparison of alkaline phosphatase activity among the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

2.3 過表達(dá)BI-1蛋白對(duì)細(xì)胞骨型分化的影響

Runx-2和BMP-2是VSMC骨型分化重要標(biāo)志性蛋白。Western blot結(jié)果顯示，VSMC鈣化后，Runx-2和BMP-2蛋白表達(dá)明顯增加，BI-1過表達(dá)能抑制Runx-2（P=0.0003，圖5）和BMP-2蛋白表達(dá)（P=0.0001，圖6）。

圖5 各組血管平滑肌細(xì)胞Runx-2蛋白表達(dá)Fig.5 Comparison of Runx-2 protein expression among the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

圖6 各組血管平滑肌細(xì)胞BMP-2蛋白表達(dá)Fig.6 Comparison of BMP-2 protein expression among the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

2.4 過表達(dá)BI-1蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

VSMC鈣化后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，過表達(dá)BI-1能明顯降低VSMC凋亡率（P=0.01，圖7）。Western blot結(jié)果顯示，VSMC鈣化后，凋亡蛋白活化的caspase-3表達(dá)明顯增加，而鈣化＋BI-1過表達(dá)組活化的caspase-3蛋白水平較鈣化組明顯減少（P=0.0003，圖8）。

圖7 各組血管平滑肌細(xì)胞凋亡率Fig.7 Comparison of apoptosis rate among the 4 groups.

圖8 各組血管平滑肌細(xì)胞活化的caspase-3蛋白表達(dá)Fig.8 Comparison of cleaved caspase-3 protein expression among the 4 groups.*P＜0.01 vs control;#P＜0.01 vs VSMC calcification group.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鈣化時(shí)間的延長(zhǎng)，BI-1蛋白水平逐漸下降，兩者存在負(fù)反饋關(guān)系；另外BI-1表達(dá)下降，伴隨著VSMC鈣沉積、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨型分化增加；而促進(jìn)BI-1蛋白表達(dá)后，VSMC鈣沉積、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨型分化減少，血管鈣化明顯減輕。

Lisak等研究發(fā)現(xiàn)BI-1不僅可以減少細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度，還能降低細(xì)胞鈣水平，保持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)平衡［24］。大鼠免疫細(xì)胞敲除BI-1蛋白后，細(xì)胞內(nèi)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣濃度明顯增加，細(xì)胞壞死增多，免疫功能下降，而過表達(dá)BI-1后，細(xì)胞鈣濃度恢復(fù)，免疫功能得以改善，可見BI-1調(diào)節(jié)鈣平衡對(duì)免疫系統(tǒng)起到非常重要的作用［25］。Doycheva等認(rèn)為BI-1能減少缺血缺氧引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。過表達(dá)BI-1能減少小鼠大腦梗死面積，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)系統(tǒng)功能；沉默BI-1后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多，大腦梗死面積增加，神經(jīng)系統(tǒng)功能惡化［26］。小鼠急性腎損傷模型中，BI-1表達(dá)下降，腎小管細(xì)胞凋亡增加，而促進(jìn)BI-1表達(dá)后，腎小管細(xì)胞凋亡減少，炎癥和氧化應(yīng)激損傷減輕，腎功能明顯改善［27］。近期研究發(fā)現(xiàn)BI-1對(duì)心血管疾病能起到保護(hù)性作用。心肌缺血再灌注損傷時(shí)，BI-1蛋白表達(dá)減少，而過表達(dá)BI-1能降低黃嘌呤氧化酶活性，減少線粒體活性氧爆發(fā)，抑制氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞凋亡，而抑制BI-1則加重氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［28］。另一心肌梗死研究中，BI-1蛋白能抑制心肌細(xì)胞壞死，減少心肌梗死面積和改善心臟功能，而基因敲除BI-1后氧化應(yīng)激增加，細(xì)胞凋亡加重，心肌梗死面積增加，心臟功能惡化［29］。本研究中，血管鈣化時(shí)，BI-1表達(dá)下降，VSMC鈣含量、細(xì)胞凋亡率和caspase-3分泌增多；而過表達(dá)BI-1 蛋白后，鈣含量、細(xì)胞凋亡率和caspase-3分泌減少，血管鈣化明顯減輕。

血管鈣化時(shí)，細(xì)胞凋亡能促進(jìn)VSMC骨型分化，而抑制細(xì)胞凋亡則減少VSMC骨型分化，BMP-2蛋白表達(dá)明顯下降［30］。另有研究發(fā)現(xiàn)腎臟透析患者VSMC凋亡誘發(fā)血管鈣化，凋亡的VSMC通過囊泡釋放羥基磷灰石促進(jìn)Runx-2和BMP-2表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)血管鈣化［31］。本研究中，VSMC鈣化后細(xì)胞凋亡增加，BMP-2、Runx-2表達(dá)增多，而促進(jìn)BI-1蛋白表達(dá)后，BMP-2、Runx-2表達(dá)減少，血管鈣化明顯減輕，因此BI-1可能通過減少細(xì)胞凋亡抑制BMP-2、Runx-2表達(dá)，進(jìn)而減輕血管鈣化。綜上所述，血管鈣化抑制BI-1蛋白表達(dá)，加重細(xì)胞凋亡、鈣磷沉積和VSMC骨型分化，而促進(jìn)BI-1蛋白表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡、鈣磷沉積和VSMC骨型分化，進(jìn)而減輕血管鈣化。由此可見，BI-1蛋白作為新的血管鈣化調(diào)節(jié)蛋白，具有多重細(xì)胞保護(hù)作用，相信隨著BI-1和血管鈣化深入研究，將來一定為血管鈣化診斷和治療開辟新的途徑。

該研究局限性在于缺乏更深機(jī)制研究和動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)，比如BI-1是線粒體重要的調(diào)控蛋白，而線粒體融合蛋白（OPA1）/線粒體融合/自噬和血管鈣化密切相關(guān)［21］，BI-1是否通過該途徑抑制線粒體損傷，進(jìn)而減輕血管鈣化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面采用血管特異性BI-1過表達(dá)小鼠，建立血管斑塊鈣化模型，測(cè)定細(xì)胞鈣含量、Runx-2、caspase-3等指標(biāo)，明確BI-1的血管保護(hù)作用。另外BI-1能降低細(xì)胞鈣水平，是否這一改變對(duì)細(xì)胞內(nèi)外電位存在影響，進(jìn)而對(duì)鈣化產(chǎn)生作用，有待下一步深入研究。