周禮華，常見榮，高揚麗，王朝凱

蚌埠醫(yī)學院1公共衛(wèi)生學院，2科研中心，安徽 蚌埠233030

氯氰菊酯（CYP）是Ⅱ型擬除蟲菊酯（Py）類殺蟲劑，神經(jīng)系統(tǒng)是Py類殺蟲劑毒性效應的主要靶器官，按照Py類引起的周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀將其分為I型(周圍神經(jīng)系統(tǒng)癥狀)和Ⅱ型（中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀）［1,2］，其中，Ⅱ型Py殺蟲劑對機體造成的影響高于Ⅰ型［3］。作為Ⅱ型Py的代表，CYP可輕易跨過血腦屏障，進入腦組織，誘導ROS自由基損傷和DNA損害，進而導致細胞凋亡，即使低劑量暴露也會對機體產(chǎn)生免疫毒性和遺傳毒性［4-6］。原花青素（PC）屬于多酚類化合物，原花青素B2（PCB2）特有的二聚體結(jié)構(gòu)使其具有最強的抗氧化活性［7］。既往研究表明，PCB2通過清除ROS自由基保護小腦顆粒神經(jīng)元免于化學物質(zhì)誘導的細胞損傷［8］。PC對CYP誘導的大腦皮層神經(jīng)元損傷是否具有保護作用及其機制未見報道。PCB2 能否干預CYP誘導的神經(jīng)毒性及相關機制尚未明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在CYP誘導C57BL/6小鼠大腦皮層神經(jīng)元氧化損傷與凋亡過程中Nrf2/ARE信號通路參與調(diào)控［9］，而Nrf2/ARE的上游通路P13K/Akt通路是否參與這一調(diào)控，仍然未知。本實驗采用原代培養(yǎng)的新生鼠大腦皮層神經(jīng)元作為實驗模型，采用P13K/Akt信號通路抑制劑LY294002抑制P13K 的激活，研究PCB2 是否能夠活化P13K/Akt 通路，調(diào)節(jié)Nrf2抗氧化防御通路，干預CYP對大腦皮層神經(jīng)元的毒性效應。作為神經(jīng)系統(tǒng)的中樞，大腦皮層參與高等生物的學習、記憶、情感等一系列生命過程［10-12］。原代培養(yǎng)的新生鼠大腦皮層神經(jīng)元，無論是形態(tài)結(jié)構(gòu)還是生理功能與活體小鼠大腦皮層生物活性相似度很大，能夠間接反映生物體內(nèi)狀態(tài)［13］。本文研究PCB2對CYP誘導損傷的保護作用能夠為從植物性食物中尋找消除或減輕殺蟲劑殘留對機體影響的天然物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物、試劑和儀器

1.1.1 動物和試劑 C57BL/6乳鼠，雌雄不限，由蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物使用通過蚌埠醫(yī)學院實驗動物倫理審查。PCB2（Extrasynthese）；CYP、多聚-L-賴氨酸（Sigma-Aldrich）；Neurobasal Medium、B27、胎牛血清（Gibco）；線粒體膜電位試劑盒（JC-1）、ROS檢測試劑盒（Beyotime）；LY294002（MCE）；anti-NSE antibody（Affinity）、anti-Akt antibody、anti-β-actin antibody（CST）、anti-TBP antibody（Proteintech）、anti-p-Akt antibody、anti-Nrf2 antibody、anti-HO-1 antibody（Abcam）。

1.1.2 主要儀器 熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡（Olympus）、Synergy 2 酶標儀（BioTek）、化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)元原代培養(yǎng)與鑒定 取新生1～2 d小鼠，75%酒精消毒，預冷D-hank'液沖洗，剪開顱骨，分離大腦皮質(zhì)，0.25%胰酶（內(nèi)含0.1%DNaseⅠ）消化10 min后終止消化，輕吹打，取上清離心，離心后棄上清，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，調(diào)細胞密度至1×106，接種于多聚-L-賴氨酸處理的培養(yǎng)板。24 h換成Neurobasal-B27無血清培養(yǎng)基，之后每2 d半量換液。

采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）細胞免疫熒光染色對神經(jīng)元進行鑒定。神經(jīng)元培養(yǎng)至第5天，細胞爬片經(jīng)多聚甲醛固定、Triton破膜，山羊血清封閉后滴加NSE抗體及FITC熒光二抗，最后滴入含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，激光共聚焦顯微鏡觀察并隨機拍照。

1.2.2 實驗分組 神經(jīng)元體外培養(yǎng)5 d后隨機分組為：正常對照組（Control），Neurobasal-B27無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；PCB2處理組，將5 μg/mL的PCB2加入無血清培養(yǎng)基與細胞共培養(yǎng)24 h；CYP 暴露組，將50 μmol/L 的CYP 加入培養(yǎng)基與細胞共培養(yǎng)24 h；PCB2 預處理組（PCB2+CYP），將5 μg/mL的PCB2與細胞預處理30 min后加入CYP 50 μmol/L共培養(yǎng)24 h；LY294002處理組（PCB2+CYP+LY294002），將20 μmol/L 的LY294002與細胞預處理30 min，然后給與PCB2預處理30 min，最后加入CYP共培養(yǎng)24 h。

1.2.3 細胞活性分析 將細胞按照100 μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，分別設置實驗各組同上，同時設空白對照組。按說明書要求滴加CCK-8試劑，每組設3個復孔，采用酶標儀檢測各組細胞吸光度值A450nm。

1.2.4 細胞核形態(tài)觀察 細胞分組處理后，按說明書要求均勻滴加Hoechst 33342活細胞染液，10 min后吸除含染料的培養(yǎng)液，PBS清洗，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)變化。

1.2.5 JC-1檢測 分組處理后，采用線粒體膜電位試劑盒（JC-1）檢測線粒體膜電位（MMP）變化。嚴格按說明書步驟裝載JC-1熒光探針，探針裝載完畢30 min內(nèi)完成檢測。熒光顯微鏡觀察、拍照，采用ImageJ 軟件對熒光強度進行分析。

1.2.6 ROS分析 細胞分組處理后（陽性對照及陰性對照），每孔加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，孵育20 min后PBS洗滌，分別采用熒光顯微鏡及流式細胞儀進行分析。

就現(xiàn)有文獻來看，不僅黃庭堅本人沒有整理過其詞作，而且其親友和后人也都沒有參與，外甥洪炎編《內(nèi)集》、表弟李彤編《外集》、從孫黃編《別集》都與詞無涉。因此，詞集的質(zhì)量無法與處于正統(tǒng)地位的黃庭堅內(nèi)集、外集、別集相提并論，此為造成后世黃庭堅詞集版本淆亂、所收作品數(shù)量不一的主要原因。

1.2.7 Western blot 檢測 分組提取細胞總蛋白及細胞核蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗及二抗孵育。凝膠成像系統(tǒng)檢測ECL化學發(fā)光并采集圖像，采用ImageJ 軟件對條帶灰度值進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用統(tǒng)計軟件SPSS 22.0進行分析，定量資料以均數(shù)±標準差表示（不同批次細胞重復3次），采用方差分析及SNK法進行組間差異比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元培養(yǎng)與鑒定

C57BL/6乳鼠大腦皮層神經(jīng)元種板后分散均勻，24 h神經(jīng)元開始呈現(xiàn)梭形或錐形，細胞突起逐漸延伸（圖1A）；第3天，細長彎曲的樹突緊密連接，形成神經(jīng)網(wǎng)絡（圖1B）；培養(yǎng)第5天，神經(jīng)元胞體變大，神經(jīng)元樹突延伸，形成密集的神經(jīng)網(wǎng)絡（圖1C）。NSE可特異地表達于神經(jīng)元細胞，神經(jīng)元胞質(zhì)、軸突及樹突呈現(xiàn)綠色熒光被定義為陽性細胞。結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的小鼠大腦皮層神經(jīng)元純度較高（圖1D）。

圖1 神經(jīng)元形態(tài)變化及NSE免疫熒光染色Fig.1 Morphological changes of mouse neurons in primary culture over time and immunofluorescence staining of the neurons.A:24 h.B:3 days.C:5 days.D:Neuron purity.

2.2 CCK-8分析神經(jīng)元活性

CYP暴露組神經(jīng)元細胞A值為0.642±0.060，Control組細胞A值為0.802±0.044，與Control組相比，CYP暴露組細胞活性受到抑制（P＜0.001）；PCB2預處理組細胞A值為0.749±0.047，與CYP暴露組相比，PCB2預處理能夠提高細胞活性（P=0.006）；LY294002處理組細胞A值為0.626±0.044，與Control組相比，細胞活性明顯受到抑制（P＜0.001）；PCB2處理組與Control組的細胞A值接近，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 CCK-8檢測神經(jīng)元細胞活性Fig.2 Viability of neurons detected by CCK-8 assay(n=3).*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CYP exposure group.

2.3 Hoechst 33342觀察細胞核形態(tài)特征

Control 組細胞核大而圓，均勻藍染，形態(tài)完整；PCB2處理組核形態(tài)變化與Control相似；CYP暴露組細胞核體積變小、濃染致密；PCB2預處理改善了CYP導致的細胞核形態(tài)異常；LY294002處理組細胞核形態(tài)出現(xiàn)凋亡特征（圖3）。

圖3 Hoechst 33342染色觀察細胞核形態(tài)變化Fig.3 Morphological characteristics of the nuclei of the neurons with different treatments(Hoechst 33342 staining).

2.4 JC-1分析MMP變化

Control組MMP較高，熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的紅色或黃色；PCB2處理組紅綠熒光比例與Control組相似；CYP暴露組MMP下降，細胞中綠色熒光顯著增強；PCB2預處理在一定程度上逆轉(zhuǎn)了CYP導致的MMP；LY294002阻斷了PCB2對CYP的拮抗作用（圖4）。

圖4 JC-1分析神經(jīng)元線粒體膜電位變化Fig.4 Changes of mitochondrial membrane potential in the neurons with different treatments(JC-1 staining).*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CYP exposure group.

2.5 ROS分析

圖5 流式細胞術與DCFH-DA檢測細胞活性氧水平Fig.5 Production of reactive oxygen species in the neurons detected by flow cytometry and DCFH-DA.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CYP exposure group.

2.6 Western blot檢測Nrf2、HO-1、p-Akt、Akt蛋白表達

與Control組相比，CYP暴露組Nrf2及HO-1蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.001）；PCB2預處理組蛋白表達較CYP暴露組明顯下調(diào)（P=0.01，P=0.015）；與Control組相比，LY294002處理組Nrf2及HO-1蛋白表達上調(diào)（P＜0.001）；PCB2處理組Nrf2蛋白表達較Control組上調(diào)（P=0.03）。

與Control組相比，CYP暴露組p-Akt蛋白表達上調(diào)（P＜0.001）；PCB2預處理組p-Akt蛋白表達較CYP暴露組下調(diào)（P=0.004）；與Control組相比，LY294002處理組p-Akt蛋白表達上調(diào)（P＜0.001）。各處理組Akt蛋白表達變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖6）。

圖6 Western blot分析Nrf2、HO-1、p-Akt、Akt蛋白表達Fig.6 Nrf2,HO-1,p-Akt,and Akt protein expressions in the neurons in different groups analyzed by Western blotting.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs CYP exposure group.

3 討論

植物活性物質(zhì)一直以來被證明具有神經(jīng)保護作用，植物活性物質(zhì)的神經(jīng)保護作用依賴于對細胞內(nèi)信號通路的調(diào)控［14-17］。蘿卜硫素通過激活P13K信號通路，保護皮層神經(jīng)元免于內(nèi)源性神經(jīng)毒素造成的損傷［18］；白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)Nrf2蛋白表達，保護乙醇誘導的小腦顆粒神經(jīng)元損傷［19］。CYP已成為環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中普遍存在的殘留農(nóng)藥［20,21］，如果能夠從植物性食物中尋找到減輕CYP殘留對神經(jīng)系統(tǒng)影響的天然物質(zhì)，將為應對日益嚴重的農(nóng)藥殘留問題提供新的思路。Nrf2在調(diào)節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)和保護細胞免受氧化損傷中發(fā)揮核心作用［22］。磷脂酰肌醇-3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（P13K/Akt）通路是機體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路，在細

胞存活、凋亡及增殖等活動中發(fā)揮重要的生物學功能［23］。本實驗采用P13K/Akt信號通路抑制劑抑制P13K的激活，研究P13K/Akt 通路在Nrf2/ARE 通路參與CYP和PCB2介導的細胞損傷和保護作用過程中是否參與調(diào)控及調(diào)控機制。

細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)通過細胞抗氧化防御系統(tǒng)平衡ROS的產(chǎn)生和清除。CYP暴露損傷抗氧化防御系統(tǒng)，導致ROS產(chǎn)生過多，清除能力下降。線粒體是ROS的主要來源，ROS產(chǎn)生過量直接導致線粒體功能障礙，在氧化應激條件下，線粒體DNA更易受到損傷［24,25］。MMP下降是細胞凋亡的早期事件，本研究顯示，CYP暴露導致MMP下降，小鼠大腦皮層神經(jīng)元細胞核出現(xiàn)固縮、濃染等凋亡特征。PCB2強大的抗氧化能力能夠平衡氧化應激對細胞的損傷，CYP暴露之前給與PCB2預處理顯然改善了細胞核形態(tài)異常及線粒體功能障礙。但是，P13K/Akt信號通路抑制劑LY294002明顯阻斷了PCB2對神經(jīng)元的保護作用。

我們在進一步研究PCB2對CYP所致小鼠大腦皮層神經(jīng)元損傷的保護機制中發(fā)現(xiàn)，CYP暴露引起Nrf2核易位、Nrf2 及其下游靶激酶HO-1 蛋白表達上調(diào)；PCB2預處理Nrf2及HO-1蛋白表達沒有持續(xù)上調(diào)，而是向著基礎水平回調(diào)。Nrf2與HO-1相互刺激、相互調(diào)節(jié)增強抗氧化通路［26］。HO-1通過降解細胞內(nèi)促氧化血紅素，產(chǎn)生膽紅素的前體膽綠素（一種強力過氧化自由基清除劑）發(fā)揮抗氧化和細胞保護作用，HO-1的適度上調(diào)能夠發(fā)揮強大的抗氧化和細胞保護作用。然而，HO-1的上調(diào)并不總是對細胞有益，因為血紅素的消耗、膽紅素的積累具有潛在毒性［27,28］。從分子角度來看，Nrf2/ARE信號通路的調(diào)控應處于穩(wěn)態(tài)。這提示PCB2通過調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號通路保護神經(jīng)元免于CYP誘導的氧化損傷。本研究顯示，當采用LY294002抑制P13K的激活后，PCB2的保護作用被抵消，p-Akt蛋白表達由于LY294002的存在也發(fā)生改變。這些表明，PCB2對神經(jīng)元的保護機制與激活P13K/Akt 信號通路，調(diào)控Nrf2/ARE信號通路密切相關。

PCB2處理組Nrf2及HO-1蛋白表達較Control組也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，在應對內(nèi)源性或外源性氧化應激時，有復雜的反應機制保護細胞免受氧化還原狀態(tài)和能量代謝的改變［29］。一定水平的氧化應激可以誘導細胞防御信號通路的激活，這是程序性細胞生存設置的一部分，以平衡更嚴重的應激情況［30］。因此，PCB2處理組Nrf2與HO-1蛋白表達上調(diào)，對細胞是一種保護效應。

綜上所述，我們認為PCB2通過激活P13K/Akt信號通路，調(diào)控Nrf2/ARE信號通路，抑制ROS產(chǎn)生，逆轉(zhuǎn)MMP下降，保護CYP誘導的小鼠大腦皮層神經(jīng)元氧化損傷。