閭少冬 魏勇鵬 王卓 袁建勇 盧軍華

肝細胞癌是目前全球第六大常見的惡性腫瘤，預后總體較差，并且患者的生存率在很大程度上是由肝細胞癌的分期決定的[1]。目前肝細胞癌治療后復發(fā)率仍較高[2-3]。因此對肝細胞癌的形成和發(fā)生的深入研究，對于肝細胞癌的發(fā)現(xiàn)和早期篩查，提高肝細胞癌的治愈率，降低肝細胞癌的病死率，就顯得尤為重要。

Hippo信號通路，不論是在果蠅這類的模式生物中，還是在高等的哺乳動物中，都是高度保守的。它的功能主要涉及控制細胞生長、增殖、凋亡、分化和器官大小等[4]。Hippo信號通路通過上游調(diào)節(jié)蛋白接收來自細胞外的生長抑制信號，然后將信息轉(zhuǎn)移到主要核心激酶，最后轉(zhuǎn)移到下游效應器[5]。最近的大量研究證實了Hippo信號在癌癥發(fā)生中的作用。Hippo通路實際上是一種腫瘤抑制通路，功能異常的Hippo信號通路參與了多種生物學過程[6]。

材料與方法

一、實驗材料

(一)實驗組織材料 本研究從東方肝膽外科醫(yī)院肝外五科收集了32例肝癌組織樣本和30例正常肝組織樣本。根據(jù)肝癌AFP水平分類，32例肝癌患者中AFP水平<25.0 μg/mL的占3例，AFP水平在25.0～200.0 μg/mL的占16例，AFP水平>200.0 μg/mL的占13例；30例肝良性增生患者中AFP水平<25.0 μg/mL的占11例，AFP水平在25.0～200.0 μg/mL的占11例，AFP水平>200.0 μg/mL的占8例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意，所有納入個體均簽署書面知情同意書。

(二)實驗細胞材料 本研究中使用的L-02細胞、Huh7細胞、SK-Hep1細胞和HepG2細胞均購自中國科學院上海生命科學研究所細胞庫，SMMC-7721細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。L-02細胞、SK-Hep1細胞和HepG2細胞培養(yǎng)使用的MEM培養(yǎng)基購自Gibco，Huh7細胞培養(yǎng)使用的DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone，SMMC-7721細胞培養(yǎng)使用的RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco。培養(yǎng)基中均需加入10%胎牛血清，胎牛血清購自Excell。所有細胞均置于37 ℃含有5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。

二、細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染實際脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen，操作方法參照Invitrogen的產(chǎn)品說明。消化細胞并鋪到12孔板中，待細胞完全貼壁且達到約60%匯合度時進行細胞轉(zhuǎn)染。MST1和MST2的shRNA均由Tsingke公司設計并合成。

三、主要分子和化學試劑

RNA抽提所用的RNAiso試劑購自Takara；酚氯仿異戊醇、異丙醇等化學試劑購自申試；RNase free water購自Takara；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promrga；Oligo dT18購自Takara；SYBR Green熒光定量試劑盒均購自Bio-rad。Western blot實驗所用的RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自Beyotine；SDS-PAGE預制膠和蛋白電泳相關試劑均購自雅酶；脫脂奶粉購自BD；PVDF膜購自GE healthcare；ECL顯色液購自Millipore。

四、qRT-PCR

使用RNAiso裂解細胞至無RNA酶的1.5 mL EP管中，參照RNAiso的產(chǎn)品說明書提取肝癌組織或肝癌細胞中的總RNA。使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應體系和程序參照Promega公司的產(chǎn)品說明書。使用RNase free water將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA稀釋10倍，并作為模板進行qRT-PCR檢測，qRT-PCR實驗使用Bio-rad公司的SYBR Green熒光定量試劑盒，具體的反應體系和程序參照Bio-rad公司的產(chǎn)品說明書。qRT-PCR反應所用引物見表1。

表1 本研究所用引物序列

五、Western blot

使用RIPA裂解液收集細胞至1.5 mL的EP管，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白的濃度，向細胞裂解液中加入蛋白loading buffer煮沸5 min后，按每孔10 μL的比例上樣到10% SDS-PAGE膠中，使用80 V電壓，電泳1 h至蛋白樣品徹底分層。隨后在280 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜。將膜轉(zhuǎn)移到5%脫脂奶粉中封閉1 h，分別加入TBST稀釋的一抗，稀釋比例和孵育時間參照各個一抗的產(chǎn)品說明，使用TBST充分洗膜后加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。ECL顯色液顯影。應用凝膠圖像分析軟件Image J分析各條帶的灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值。實驗重復3次。實驗中所用抗體MST1(A0109)、MST2(A9036)、GAPDH(A19056)、AMPK(A12718)、p-AMPK(AP0116)、OCT-4(A7920)、Nanog(A14150)以及對應的兔二抗(AS014)和鼠二抗(AS003)均購自愛博泰克。

六、免疫組織化學染色

將肝癌組織和正常的肝組織，于4%多聚甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟處理。微波加熱修復抗原，至沸騰后停止加熱5 min，然后重復加熱一次，冷卻至常溫。PBS沖洗切片后滴加正常山羊血清封閉液封閉。HistostainTMSP-9000免疫組化染色試劑盒(Zymed公司)染色。分別使用MST1和MST2一抗4 ℃處理過夜。復溫并用PBS沖洗后，滴加對應的二抗，于37 ℃下30 min。PBS沖洗后滴加辣根標記工作液孵育，DAB顯色5～10 min，鏡下調(diào)整染色時間，蘇木精復染1 min后樹膠封片，拷片后拍照保存。

七、流式細胞術

收集SMMC-7721細胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，細胞計數(shù)并調(diào)整細胞懸液濃度至1×106/mL，取1 mL細胞1 500 r/min離心10 min，棄上清，每毫升細胞加2 mL PBS，再離心，棄上清后，加入預冷的70%乙醇固定細胞，4 ℃過夜。第二天用PBS洗滌細胞2次，取100 μL細胞懸液，將細胞懸液加入0.5 mL含50 μg/mL RNAase PI溶液中，避光30 min后用100目的尼龍網(wǎng)過濾，流式細胞儀分別記錄CD90+、CD105+和CD133+型細胞的分布情況。

八、統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件(USA)進行處理，計量資料采用均值±標準差的形式表示，兩組間比較為t檢驗，多組間的比較應采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。

結 果

一、MST1和MST2在肝癌中高表達

為了研究MST1和MST2在肝癌中的作用，筆者首先檢測了MST1和MST2在肝癌中的表達情況。我們從東方肝膽外科醫(yī)院肝外五科取32例肝癌組織樣本，以及30例正常的肝組織樣本，通過qRT-PCR和免疫組化實驗檢測了MST1和MST2的表達情況。結果表明在肝癌組織中，MST1和MST2均顯著高表達(圖1A、圖1B)。通過qRT-PCR和Western blot在肝癌細胞系Huh7、SK-Hep1、HepG2和SMMC-7721中檢測MST1和MST2的表達情況。qRT-PCR結果表明，對比人正常肝細胞L-02，MST1和MST2在Huh7、SK-Hep1、HepG2和SMMC-7721中的表達分別為：2.16±0.25、1.73±0.15、2.63±0.31、2.36±0.25；1.97±0.21、2.12±0.19、2.76±0.18、2.92±0.21。其中MST1和MST2的表達在HepG2和SMMC-7721肝癌細胞系中的表達最高(圖1D)，因此使用HepG2和SMMC-7721細胞系作為后續(xù)實驗的研究材料。以上結果表明，MST1和MST2在肝癌中高表達，提示MST1和MST2與肝癌的發(fā)生密切相關。

二、SMMC-7721中肝癌干細胞的鑒定

為了研究MST1和MST2在肝癌干細胞自我更新過程中的作用。本研究首先通過流式細胞術檢測肝癌干細胞表面標志物CD90、CD105、CD133，發(fā)現(xiàn)CD90+、CD105+、CD133+型的細胞在SMMC-7721細胞中占有一定比例(圖2A)，筆者從中分選出CD90+、CD105+、CD133+的SMMC-7721細胞作為肝癌干細胞模型進行后續(xù)研究。經(jīng)過分選的SMMC-7721肝癌干細胞，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)其形成微球體的能力顯著增強(圖2A)。在SMMC-7721肝癌干細胞中，檢測干細胞標準蛋白AMPK、OCT-4和Nanog的表達。qRT-PCR結果顯示，相比普通肝癌細胞HepG2，AMPK在肝癌干細胞SMMC-7721中的表達情況無明顯變化，而OCT-4和Nanog的表達分別為2.56±0.21、2.32±0.11，提示OCT-4和Nanog在肝癌干細胞中顯著上調(diào)。Western blot結果顯示，在肝癌干細胞中AMPK的磷酸化水平顯著增加，OCT-4和Nanog的表達上調(diào)趨勢與qRT-PCR結果一致(圖2B)。以上結果表明，通過檢測干細胞微球體的形成以及干細胞標志物AMPK、OCT-4和Nanog的表達，本研究成功誘導了SMMC-7721肝癌干細胞。

圖1 MST1和MST2在肝癌中高表達A：qRT-PCR檢測肝癌組織中MST1和MST2的表達，*表示與Normal組相比P<0.05；B：免疫組化檢測肝癌組織中MST1和MST2的表達；C：Western blot檢測肝癌細胞中MST1和MST2的表達。所有實驗均重復3次

三、MST1和MST2促進了肝癌干細胞的干性維持

為了研究MST2和MST2對肝癌干細胞自我更新的影響，筆者分別設計并合成了MST1和MST2的shRNA，通過Western blot檢測shRNA的敲低效率。結果顯示三對shRNA均能成功敲低MST1(圖3A)和MST2的表達(圖3B)。在SMMC-7721肝癌干細胞中，敲低MST1和MST2后，肝癌干細胞微球體顯著減少(圖3C)。通過qRT-PCR結果顯示，檢測了敲低MST1后，OCT-4和Nanog的表達下調(diào)為0.48±0.02和0.26±0.08；敲低MST2后，OCT-4和Nanog的表達下調(diào)為0.35±0.06和0.42±0.03。Western blot結果顯示，敲低MST1和MST2，AMPK的磷酸化水平顯著減弱，OCT-4和Nanog的下調(diào)趨勢與qRT-PCR結果一致(圖3D)。干細胞標志物指標表明，MST1和MST2的敲低抑制了肝癌干細胞的干性維持能力。

討 論

近年的研究表明，Hippo信號通路的活性被證實在多種腫瘤的發(fā)生過程中異常上調(diào)，例如在約17%的宮頸鱗狀細胞癌、約16%的鱗狀細胞癌、約15%的食管鱗狀細胞癌和約14%的頭頸部鱗狀細胞癌中觀察到YAP1、Taz和Tead2的癌基因激活和擴增[7]。當然其中不乏在肝癌中的研究。過表達的YAP可以促進肝臟生長，由此也可以促進肝細胞癌的快速發(fā)展，表明Hippo信號通路是調(diào)節(jié)肝細胞癌的重要因素[8]。更深入的研究表明，在晚期的肝細胞癌中通過siRNA-LNPs技術抑制YAP1的表達，有著很好的抑制腫瘤的效果[9]。在肝癌中，Hippo信號通路受到多種信號通路相互作用，與包括Wnt通路，Notch通路還有GPCRs通路在內(nèi)的多個通路共同調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在MST1和MST2缺陷的肝臟中，Notch調(diào)控了一個正反饋回路，從而增強YAP信號，并進一步促進肝癌的發(fā)生。YAP1也被證明可以促進JAG1的表達上調(diào)，從而在肝癌細胞中激活Notch信號通路，這表明兩種通路之間存在相互作用[10]。而Wnt信號通路可以通過干擾Notch-YAP的反饋反應，抑制肝癌細胞中YAP/TAZ信號[10-11]。

Wang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，MST1和MST2的過表達可以抑制細胞的增殖，促進YAP1的磷酸化，進一步在mRNA水平上下調(diào)CTGF和AREG的表達。此外，轉(zhuǎn)錄因子CREB通過與YAP啟動子的-608/-439位點結合促進YAP1的表達[13]。MEK1-YAP1的相互作用被證明對肝癌細胞的增殖和腫瘤發(fā)生很重要[14]。各種膜相關蛋白，如NF2/Merlin、WWC和Angiomotin家族的Scaffolding蛋白已被證明可調(diào)節(jié)Hippo信號通路[15-16]。進一步的研究表明，在肝癌細胞中，Sirtuin 1(SIRT1)可以使YAP2蛋白去乙?；?，增加YAP2和Tead4結合，增強Trad4的轉(zhuǎn)錄水平，最終導致肝癌的進展[17]。

A：流式細胞術分選細胞中CD90、CD105和CD133陽性的細胞，并通過顯微鏡鏡檢細胞的微球體形成情況；B：Western blot檢測SMMC-7721肝癌干細胞中干細胞標志物的表達。所有實驗均重復3次圖2 SMMC-7721中肝癌干細胞的鑒定

A：Western blot檢測MST1的敲低效果；B：Western blot檢測MST2的敲低效果；C：鏡檢觀察MST1和MST2敲低后干細胞微球體形成情況；D：Western blot檢測肝癌干細胞中敲低MST1和MST2后干細胞標志物的表達。所有實驗重復3次圖3 MST1和MST2促進了肝癌干細胞的干性維持

在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)MST1和MST2在肝癌組織和肝癌細胞中，表達顯著上調(diào)，提示MST1和MST2在肝癌的進程中起著重要的作用。在SMMC-7721細胞中，通過流式細胞術篩選到CD90+、CD105+、CD133+的表型，并發(fā)現(xiàn)這類表型的細胞，微球體的形成能力顯著變強，提示SMMC-7721細胞可以作為一個很好的細胞模型來進行肝癌干細胞的研究。因此在SMMC-7721 CD90+、CD105+、CD133+型的細胞中，筆者敲低了MST1和MST2，結果表明敲低MST1和MST2均能顯著抑制微球體的形成，并且干細胞標志物AMPK的磷酸化水平顯著下調(diào)，OCT-4和Nanog的表達也被顯著抑制。本研究的結果作為Hippo信號通路在肝癌干細胞中的初步探索，很好地證實了抑制Hippo信號通路活性可以抑制肝癌干細胞的自我更新和干性維持，為Hippo信號通路在肝癌中的研究開辟了新的思路。