余幼林，沈雄山，胡超華，余軍林，盧婷，楊峰，張文杰，張小莉，劉漢忠，陶溢潮

（武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院1.甲狀腺乳腺外科2.腫瘤科3.病理科4.超聲科，湖北孝感432000; 5.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州121000）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，近年來發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)[1-2]。臨床上，甲狀腺超聲檢查聯(lián)合細(xì)針穿刺抽吸活檢（ultrasound-fine needle aspiration biopsy，US-FNAB）被認(rèn)為是甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別主要手段[3-5]。但仍然存在自身局限性。甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)在超聲聲象表現(xiàn)上存在交叉、重疊現(xiàn)象，超聲操作者診斷帶有自身主觀性。FNAB 操作有創(chuàng)，并非所有結(jié)節(jié)能實(shí)現(xiàn)有效取材，特別是位置特殊，較小結(jié)節(jié)。在獲取組織細(xì)胞診斷仍存在30%不能明確[6]。單一檢測(cè)手段其臨床價(jià)值有限。因此，探索建立新的無創(chuàng)檢測(cè)方法對(duì)提高診斷甲狀腺癌準(zhǔn)確率具有重要意義。

外周血循環(huán)游離的DNA（cfDNA）來源于細(xì)胞壞死或凋亡后釋放的DNA 片段或增殖細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞）主動(dòng)分泌DNA 片段。包含了循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）[7-10]。cfDNA 在甲狀腺癌中的研究處于初級(jí)階段。有研究[13]顯示：cfDNA 在甲狀腺癌診療中可作為的潛在生物標(biāo)志物[11]。檢測(cè)cfDNA 片段的完整性可用于甲狀腺癌的診斷[12]。cfDNA 定量聯(lián)合BRAF V600E 突變檢測(cè)可用于甲狀腺癌早期診斷。因此，在本研究通過檢測(cè)甲狀腺結(jié)節(jié)患者cfDNA 濃度，聯(lián)合甲狀腺結(jié)節(jié)超聲特征性改變建立評(píng)分系統(tǒng)分析在甲狀腺癌診斷中臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年6月—2020年10月在武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）住院治療240 例甲狀腺結(jié)節(jié)患者為研究對(duì)象，按照1∶1 隨機(jī)分為建模組120 例，驗(yàn)證組120 例。本研究的納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者年齡20～70 歲；⑵有完整甲狀腺+頸部淋巴結(jié)超聲檢查資料；⑶單灶性和多灶性甲狀腺結(jié)節(jié)，無論良惡性結(jié)節(jié)均可；⑷甲狀腺手術(shù)后，明確組織學(xué)病理診斷。切除組織前未行碘131 治療，未經(jīng)任何放化療或者內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴一般臨床數(shù)據(jù)資料不完整；⑵甲狀腺超聲檢查圖像結(jié)果不完整；⑶患有其他腫瘤疾病者；⑷甲狀腺良性結(jié)節(jié)合并惡性結(jié)節(jié)。所有患者均進(jìn)行手術(shù)明確病理診斷，其中甲狀腺癌132 例，良性甲狀腺結(jié)節(jié)108 例（腺瘤29 例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫囊性變共79 例）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)sw2017002），且研究對(duì)象均知情同意簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 超聲檢查術(shù)前所有的患者進(jìn)行甲狀腺超聲檢查，檢查內(nèi)容：甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)（囊性，非囊性）、縱橫比、包膜完整性、回聲，有無鈣化。超聲檢查設(shè)備采用深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，機(jī)器型號(hào)RESONA7，探頭L11-3U。甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)超聲檢查圖像見圖1。

圖1 甲狀腺結(jié)節(jié)超聲圖像A：甲狀腺良性結(jié)節(jié)（箭頭所示）；B-C：甲狀腺惡性性結(jié)節(jié)（箭頭所示）Figure 1 Ultrasound images of the thyroid nodulesA:A benign thyroid nodule(shown by the arrow);B-C:A malignant thyroid nodule(shown by the arrow)

1.2.2 cfDNA 檢測(cè)⑴樣本采集：術(shù)前240 例患者抽取靜脈血5 mL 置于EDTA 抗凝管中，在室溫下，3 000r/min，離心15 min，取上清置于凍存管放入-80 ℃?zhèn)溆?。⑵血漿DNA 的提取及純化：采用血漿游離DNA 提取試劑盒（天根，DP339）提取血漿游離的DNA 并進(jìn)行純化，按照試劑盒操作說明進(jìn)行。⑶血漿DNA 的定量：通過熒光定量PCR 反應(yīng)試劑盒（天根）進(jìn)行DNA 染色，后進(jìn)行熒光定量PCR，以基因β-actin 作為參照基因，上游引物5'-TAT CCA GGC TGT GCT ATC CC-3'，下游引物5'-CCA TCT CTT GCT CGA AGT CC-3'。設(shè)置反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，隨后，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共設(shè)置40 個(gè)循環(huán)，同時(shí)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔，由已知濃度的人HepG2 細(xì)胞提取的DNA 倍比稀釋進(jìn)行擴(kuò)增得到Ct（cycle threshold）值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿DNA 的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組計(jì)量資料的比較采用t檢驗(yàn)，兩組計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。多因素分析采用Logistic 回歸，標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)（β）為0.5513×回歸系數(shù)×標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)對(duì)單一指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，構(gòu)建10 分制評(píng)分系統(tǒng)，并計(jì)算每個(gè)人的總得分。cfDNA 及評(píng)分的最佳截?cái)嘀低ㄟ^ROC 曲線分析實(shí)現(xiàn)。通過Graphpad Prim 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)患者的血漿cfDNA 的濃度差異

240 例甲狀腺良、惡性結(jié)節(jié)組進(jìn)行比較，結(jié)果表明，甲狀腺癌組的cfDNA 濃度明顯高于良性結(jié)節(jié)組，兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中良性結(jié)節(jié)組的cfDNA 濃度的范圍為20.16～78.42 ng/mL，平均（54.35±11.76）ng/mL；甲狀腺癌組的cfDNA濃度的范圍為45.62～84.33 ng/mL，平均（62.16±7.82）ng/mL（圖2）。進(jìn)一步ROC 曲線分析結(jié)果表明，良惡性結(jié)節(jié)組的cfDNA 濃度的最佳截?cái)嘀禐?6.84 ng/mL（AUC=0.707）（圖3）。

圖2 甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)患者的cfDNA濃度比較Figure 2 Comparison of the cfDNA concentrations between patients with benign and malignant thyroid nodules

圖3 cfDNA診斷甲狀腺癌的ROC曲線Figure 3 The ROC curve of cfDNA in diagnosis of thyroid cancer

2.2 基線特征比較

建模組和驗(yàn)證組患者的基線特征比較結(jié)果顯示，建模組120 例患者中男31 例，女89 例；中位年齡45（28～68）歲。驗(yàn)證組120例患者中男33例，女87 例；中位年齡46（25～67）歲。cfDNA 濃度及超聲影像（縱橫比，內(nèi)部回聲，包膜，鈣化，囊性病變）在兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表1）。

表1 建模組和驗(yàn)證組患者的基線特征比較[n=120，n（%）]Table 1 Comparison of the baseline characteristics between modeling group and validation group[n=120,n(%)]

2.3 建模組中影響甲狀腺癌診斷的單因素分析

建模組中良性和與惡性結(jié)節(jié)兩組比較結(jié)果顯示，兩組間cfDNA 濃度及超聲影像（縱橫比，內(nèi)部回聲，包膜，鈣化，囊性病變）的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）（表2）。

表2 單因素分析建模組中甲狀腺癌診斷的影響因素[n=120，n（%）]Table 2 Univariateanalysisoffactorsforaffectingthediagnosisofthyroidcancerinmodelinggroup[=120,n(%)]

2.4 建模組中影響甲狀腺癌診斷的多因素分析及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

多因素分析結(jié)果表明，cfDNA≥56.84 ng/mL，超聲顯示：縱橫比≥1，不完全包膜，低回聲，鈣化，和非囊性病變是診斷甲狀腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）。根據(jù)Logistic 回歸的標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（10 分制），cfDNA≥56.84 ng/mL 為1.2 分，超聲指標(biāo)：縱橫比≥1（2.2分），不完全包膜（2.1分），低回聲（1.8 分)，鈣化（1.3 分），非囊性病變（1.5 分）（表3）。

表3 多因素分析建模組中甲狀腺癌診斷的影響因素及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Multivariate analysis of the factors affecting the diagnosis of thyroid cancer in modeling group and their scoring standards

2.5 單一指標(biāo)及評(píng)分系統(tǒng)在甲狀腺癌診斷中的預(yù)測(cè)價(jià)值

良性甲狀腺結(jié)節(jié)組的綜合評(píng)分為3.16±1.77，甲狀腺癌組的綜合評(píng)分為7.37±1.52。兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。進(jìn)一步ROC 曲線分析結(jié)果表明（圖4），該評(píng)分系統(tǒng)在建模組中診斷甲狀腺癌的效能較高（AUC=0.958，95%CI=0.926～0.989），高于單一指標(biāo)（縱橫比、內(nèi)部回聲、包膜、囊性病變、鈣化、cfDNA 的AUC 值分別為0.457、0.706、0.752、0.708、0.680、0.715）。評(píng)分系統(tǒng)診斷模型最佳截?cái)嘀?.5。以最佳截?cái)嘀禐閰⒖键c(diǎn)，其相對(duì)應(yīng)的敏感度，特異度，陽性預(yù)測(cè)值，陰性預(yù)測(cè)值分別為85.5%，89.7%，89.8%，85.2%，均高于單一指標(biāo)（表4）。在驗(yàn)證組中，該模型診斷甲狀腺癌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為83.8%、86.2%、86.7%、83.3%，AUC 為0.902（95%CI=0.848～0.957），高于單一指標(biāo)（縱橫比、內(nèi)部回聲、包膜、囊性病變、鈣化、cfDNA 的AUC 值分別為0.498、0.712、0.731、0.701、0.668、0.709）（表4）。

圖4 評(píng)分系統(tǒng)的ROC曲線A：建模組；B：驗(yàn)證組Figure 4 The ROC curves of scoring systemA:Modeling group;B:Validation group

表4 建模組中單一指標(biāo)及評(píng)分系統(tǒng)在甲狀腺癌診斷中的診斷效能（%）Table 4 Predictiveefficacyof singlefactorand the scoresystem fordiagnosis of thyroidcancerinmodelinggroup(%)

3 討論

據(jù)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：甲狀腺癌目前是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一[1-2]。臨床上，甲狀腺超聲檢查聯(lián)合US-FNAB 用于甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)鑒別診斷常用的方法。但仍然存在20%～25%細(xì)胞學(xué)診斷不能明確[14]。即使對(duì)部分結(jié)節(jié)重復(fù)FNAB，還是有大約9.9%～47.8% 無法診斷或意義不明確[15]。US-FNAB 聯(lián)合分子診斷也是相對(duì)較低敏感度（48%～63%）[16-17]和相對(duì)較低特異度（48%～53%）[18]。最近研究顯示：US-FNAB 對(duì)甲狀腺癌診斷敏感度為57.89%[19]。單獨(dú)超聲檢查結(jié)果與病理診斷的符合率在60%和90%之間波動(dòng)，診斷差異性較大[14]。

在腫瘤患者中，cfDNA 被增殖腫瘤細(xì)胞釋放，通常攜帶有原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移灶相同生物學(xué)特性的基因組信息。其濃度的改變及其基因特性變化可間接反映腫瘤的生物學(xué)行為[20-23]。亦有研究證實(shí)：cfDNA 可用于腫瘤診斷,治療及預(yù)后監(jiān)測(cè)[24-25]。在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者中，cfDNA 濃度在治療前后的變化可作為腫瘤負(fù)荷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[26]。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，化療前cfDNA 低水平患者比高水平者具有更長的生存期，治療后cfDNA 水平低于中位數(shù)的患者總體生存有改善，并且治療反應(yīng)良好[27]。在胃癌患者中，血漿cfDNA 含量與腫瘤大小正相關(guān)。cfDNA 基因改變與組織活檢結(jié)果高度一致。cfDNA 還可預(yù)測(cè)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移性胃癌患者中，cfDNA 濃度中位數(shù)比無轉(zhuǎn)移者高約60 倍[28]。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，cfDNA 濃度較高患者的中位無進(jìn)展生存期（PFS）和總體生存期（OS）時(shí)間較短。cfDNA 可以作為NSCLC 患者預(yù)后預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物[29]。在小細(xì)胞肺癌中，cfDNA 同樣可用于化療療效評(píng)估及腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)[30]。乳腺癌患者cfDNA 高水平與患者不良的PFS 和OS 相關(guān)[31]。在本項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)：甲狀腺惡性結(jié)節(jié)患者cfDNA 濃度高于甲狀腺良性結(jié)節(jié)者，cfDNA 可作為甲狀腺癌診斷分子標(biāo)志物。

考慮到上述甲狀腺超聲檢查聯(lián)合細(xì)針穿刺抽吸活（US-FNAB）自身特點(diǎn)的局限性。并分析了cfDNA 在腫瘤診療中臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究基于甲狀腺癌超聲聲學(xué)特征性改變聯(lián)合cfDNA 構(gòu)建的評(píng)分系統(tǒng)診斷模型。在本研究中，ROC 曲線結(jié)果表明：當(dāng)cfDNA 濃度≥56.84 ng/mL 對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性具有較好的鑒別價(jià)值。甲狀腺癌超聲聲學(xué)表現(xiàn)為縱橫比≥1 低回聲，鈣化，包膜不完整及非囊性病變，與既往的研究相一致[32-34]。值得關(guān)注的是，在本研究中，cfDNA 的濃度聯(lián)合甲狀腺癌5 個(gè)超聲聲學(xué)特征構(gòu)建基于評(píng)分系統(tǒng)的無創(chuàng)診斷模型用于甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性鑒別。該模型cfDNA 評(píng)分權(quán)值為1.2，均低于另外的超聲學(xué)特征，可能存在的原因：⑴選取樣本量相對(duì)較小。⑵選取臨床病例大部分甲狀腺癌腫瘤負(fù)荷較小，釋放到外周血中cfDNA 含量有限。⑶cfDNA 濃度變化與腫瘤臨床分期具有明顯相關(guān)性。通常，腫瘤TNM 分期越晚，cfDNA 水平越高[35]。本研究中選取大部分早期甲狀腺癌臨床病例。ROC 曲線分析結(jié)果提示該評(píng)分系統(tǒng)診斷模型具有較高的診斷效能（AUC=0.958，95%CI=0.926～0.989），且模型最佳截?cái)嘀禐?.5 分。建模組和驗(yàn)證組結(jié)果均顯示：當(dāng)評(píng)分≥5.5 分診斷甲狀腺癌具有良好的敏感度和特異度，陽性預(yù)測(cè)值，陰性預(yù)測(cè)值，高于傳統(tǒng)的單一指標(biāo)檢測(cè)的預(yù)測(cè)價(jià)值。 該模型對(duì)比FNAB+BRAF+超聲診斷方法具有無創(chuàng)，可實(shí)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。對(duì)于存在區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，也具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。BRAF 基因在中國甲狀腺乳頭狀甲狀腺癌中突變率為71.2%[36]。其他病理類型甲狀腺癌伴有BRAF 基因突變相對(duì)較低。對(duì)于直徑＜1 cm 或位置較深，富血供的甲狀腺結(jié)節(jié)，F(xiàn)NAB 穿刺更易出現(xiàn)取材結(jié)果不滿意[37-38]，導(dǎo)致診斷甲狀腺癌假陰性率較高，該模型可有效彌補(bǔ)上述方法缺陷。同時(shí)，本研究也存在一些局限性：⑴本研究總體樣本量較少，需要多中心更大樣本量的檢驗(yàn)診斷效能；⑵本研究尚未進(jìn)一步分析該模型在不同臨床分期甲狀腺癌中診斷價(jià)值以及在不同甲狀腺癌病理分型中的診斷效能，后續(xù)將開展相關(guān)研究。

總之，本研究基于cfDNA 的濃度和甲狀腺癌超聲特征性聲學(xué)改變建立評(píng)分系統(tǒng)診斷模型用于甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)鑒別，為甲狀腺癌的無創(chuàng)診斷提供了新思路。更值得關(guān)注的是這個(gè)診斷模型也可用于甲狀腺良性結(jié)節(jié)動(dòng)態(tài)無創(chuàng)監(jiān)測(cè)，在甲狀腺結(jié)節(jié)的診斷和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中具有重要的臨床價(jià)值。