倪建騰，馬致潔，趙奎君，章從恩，陳 熹

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科，北京 100050)

近年來，鮑曼不動桿菌已成為全球衛(wèi)生領(lǐng)域的最大難題[1-9]。目前臨床的主要治療藥物為抗菌藥物，但課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于鮑曼不動桿菌耐藥性強、抗菌藥物濫用等原因，導(dǎo)致其治療一直受到很大阻力[10-11]。鹽酸小檗堿與黃芩苷對鮑曼不動桿菌有一定的體外抑制作用[12-16]。代謝組學(xué)可以從整體層面上以微觀角度研究機體代謝的狀況，發(fā)現(xiàn)可觀測、可認識的物質(zhì)基礎(chǔ)，并分析推理，篩選出有意義的功能信息進行歸納和整合，清晰并系統(tǒng)地認識復(fù)雜體系[17]。利用代謝組學(xué)可確定中藥干擾鮑曼不動桿菌代謝物質(zhì)的變化，對研究中藥抑菌能力具有重要的意義。

1 材料

1.1 儀器

NV-425-400s Labgard型生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司)；99234型麥氏比濁儀(梅里埃生物制品有限公司)；12孔平底培養(yǎng)板(康寧公司)；NV-5510E型恒溫細菌培養(yǎng)箱(北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司)；101-1A型干燥器(泰斯特)；渦旋混合器(上海五相儀器儀表有限公司)；5424R型離心機(艾本德股份公司)；10、200及1 000 μl的移液器(艾本德股份公司)；BSA224S-CW型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Gradient A10 Mill-Q超純水器(法國 Millipore 公司)；LC-IT-TOF/MS型液相色譜串聯(lián)離子阱飛行時間質(zhì)譜(日本島津公司)，Inertsil ODS-SPC18色譜柱(日本島津公司)，LC-MS solution 工作站。

1.2 菌株

鮑曼不動桿菌標準菌株(中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心)。

1.3 藥品與試劑

黃芩苷(中國藥品生物制品檢定所)；鹽酸小檗堿標準品(中國藥品生物制品檢定所)；替加環(huán)素標準品(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)；肉湯粉(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；吐溫-80(邁瑞達)；二甲基亞砜(Sigma公司)；0.9%氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司)；甲醇(Fisher Scientific)；三氯甲烷(北京化工廠)；甲酸(Dikmapure公司)。

2 方法

2.1 菌株復(fù)蘇

取凍存的鮑曼不動桿菌標準菌株干粉用肉湯溶解稀釋，35 ℃條件下培養(yǎng)24 h復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌株用細菌接種環(huán)蘸取少量菌液劃種于血平板，繼續(xù)在35 ℃條件下培養(yǎng)24 h。選取單克隆菌株置于肉湯中增菌(此時為對數(shù)生長期，對數(shù)生長期的細菌對外界環(huán)境因素敏感，代謝旺盛)。最后用肉湯稀釋至濃度為(1.00～1.50)×106CFU/ml，混勻備用。

2.2 藥物制備

2.2.1 黃芩苷溶液制備：取適量黃芩苷標準品置于干燥器中30 min后溶于二甲基亞砜中，配至濃度為10.34 mmol/L，取290 μl于鹽缽中，加入吐溫-80 0.40 ml研勻，用肉湯定容至1.50 ml，得到2 000.00 μmol/L黃芩苷工作液，進一步稀釋至200.00 μmol/L，混勻備用。

2.2.2 鹽酸小檗堿溶液制備：同“2.2.1”項下黃芩苷溶液制備方法，得到200.00 μmol/L鹽酸小檗堿溶液，混勻備用。

2.3 樣品制備與處理

2.3.1 樣品制備：取鹽酸小檗堿溶液400 μl依次加入12孔板的A行1至6列、B行1至3列，取菌液400 μl加入A行1至6列、B行4至6列，不滿1 ml的孔均用肉湯補齊。此時B行1至3列為空白組，B行4至6列為對照組，A行1至6列為鹽酸小檗堿組。黃芩苷標本制備方法同鹽酸小檗堿。此時，鹽酸小檗堿與黃芩苷的終濃度均為80.00 μmol/L，鮑曼不動桿菌的終濃度為(2.00～3.00)×105CFU/ml(上述體系中DMSO含量均≤1%，可忽略其對菌體生長的影響)，輕微震蕩混勻并在35 ℃條件下培養(yǎng)16 h[18]。

2.3.2 樣品處理：為提高樣品制備的效率，本研究對提取溶劑種類和提取條件等參數(shù)進行優(yōu)化。經(jīng)測試后，氯仿-甲醇-水混合物(V∶V∶V=1∶3∶1)產(chǎn)生最大數(shù)量的峰，故選擇其為提取溶劑。收集各組細菌培養(yǎng)液1 ml，并立即將其轉(zhuǎn)移到冰上，并在冰上迅速進行以下步驟，將1 ml細菌培養(yǎng)液離心10 min(3 220轉(zhuǎn)，4 ℃)，取上清液，并迅速使用0.22 μmol/L膜過濾器過濾，取濾液50 μl與氯仿-甲醇-水(V∶V∶V=1∶3∶1)1.25 ml輕搖混勻，離心10 min(14 000轉(zhuǎn)，4 ℃)，收集上清液，得到細胞外代謝物溶液，備用。

2.3.3 色譜條件：色譜柱為Inertsil ODS-SPC18柱；流動相為水(A)-甲醇(B)，色譜梯度洗脫條件見表1；流速為0.3 ml/min；進樣量為5 μl；柱溫為25 ℃；樣品溫度為4 ℃；檢測波長為420 nm。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Chromatographic gradient elution conditions

2.3.4 質(zhì)譜條件：電噴霧化離子源，ESI-(120 ℃)；毛細管電壓為3 200 V；質(zhì)量掃描范圍(m/z)為50～1 000；脫溶劑氣流量為6.0 L/min；脫溶劑溫度為180 ℃。

2.4 數(shù)據(jù)分析

將所有數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，并進行歸一化，后導(dǎo)入SIMCA-P11.0軟件中進行多變量數(shù)據(jù)分析，包括主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)。其中，使用OPLS-DA分析方法挖掘黃芩苷組與對照組、鹽酸小檗堿組與對照組間的內(nèi)在差異，利用OPLS-DA模型中的S-plot圖與VIP值(與預(yù)測變量相關(guān)性高的變量)初步篩選差異代謝物。篩選條件為VIP>2，∣p(corr)∣≥0.58。并進一步利用MetaboAnalyst在線軟件對上述條件得到的差異代謝物進行T檢驗與ANOVA檢驗，篩選條件為P<0.05、FC<0.5或>2、FDR<0.05，即得到候選差異代謝物。最后，利用Metlin數(shù)據(jù)庫初步分析候選差異代謝物的質(zhì)核比，依據(jù)各變量的精確分子量并結(jié)合同位素豐度信息進行初步鑒定，質(zhì)量誤差在10 ppm以內(nèi)。再利用MetaboAnalyst在線軟件進行代謝通路富集分析。

3 結(jié)果

3.1 數(shù)據(jù)主成分分析

觀察三組鮑曼不動桿菌樣品的PCA得分圖(見圖1)，在正離子模式下，質(zhì)量控制組與其他三組分離程度較好，且聚集程度較高，表明在分析過程中實驗條件較穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可信度高；質(zhì)量控制組分類趨勢較好，說明在分析過程中方法穩(wěn)定性較好；另外，黃芩苷組、鹽酸小檗堿組均從對照組中分離出來，且分離程度較好，可證明三組的代謝差異比較明顯，外源性代謝物水平分別受到黃芩苷與鹽酸小檗堿的干擾。

圖1 對照組、質(zhì)量控制組、鹽酸小檗堿組和黃芩苷組鮑曼不動桿菌的PCA得分圖Fig 1 PCA scores of Acinetobacter baumannii in the control group, quality control group, berberine hydrochloride group and baicalin group

3.2 黃芩苷與鹽酸小檗堿差異代謝物的初步篩選

對照組和黃芩苷組在OPLS-DA模型中分離度良好，見圖2；對照組和鹽酸小檗堿組在OPLS-DA模型中分離度良好，見圖3；而且，各模型關(guān)鍵參數(shù)R2Y (cum) 和Q2Y (cum)在配對組均>0.5，說明各模型均具有較強的可信度與較好的預(yù)測性。使用OPLS-DA中的S-plot圖與VIP值對所有變量進行初步篩選。篩選條件為VIP>2，∣p(corr)∣≥0.58，見圖4—5(圖中深色圓點即為篩選結(jié)果)。使用MetaboAnalyst進行T檢驗與ANOVA檢驗，篩選條件為FDR<0.05、P<0.05、FC<0.5或>2，初步確定鮑曼不動桿菌被不同藥物干預(yù)后的差異代謝物，即候選差異代謝物。

圖2 對照組、黃芩苷組之間配對比較的OPLS-DA得分圖Fig 2 OPLS-DA scores of paired comparison between the control group and the baicalin group

圖3 對照組、鹽酸小檗堿組之間配對比較的OPLS-DA得分圖Fig 3 OPLS-DA scores of paired comparison between the control group and the berberine hydrochloride group

圖4 對照組、黃芩苷組之間配對比較的S-plot得分圖Fig 4 S-plot score of paired comparison between control group and baicalin group

圖5 對照組、鹽酸小檗堿組之間配對比較的S-plot得分圖Fig 5 S-plot scores of paired comparison between the control group and the berberine hydrochloride group

3.3 黃芩苷與鹽酸小檗堿候選差異代謝物的初步鑒定

將上述候選差異代謝物的質(zhì)核比導(dǎo)入Melin數(shù)據(jù)庫進行初步鑒定，鑒定過程相關(guān)數(shù)據(jù)見表2—4。

綜合表2—4的結(jié)果可知，初步鑒定差異代謝物14個。黃芩苷給藥后的差異代謝物共有9種，包括“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“Glycerophosphoglycerol”“Succinyladenosine”“UDP-N-acetyl-D-glucosamine”“Caproylcholine”(己基膽堿)、“N-Acetyl-L-leucine”“Aspartylysine”(天冬氨酸)和“L-Cysteine”(L-半胱氨酸)等；鹽酸小檗堿給藥后的差異代謝物共有9種，包括“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“N-(L-Arginino)succinate”“Uridine triphosphate”(尿苷三磷酸)、“Xanthosine 5′-phosphate”“D-Erythrose 4-phosphate”“N-Acetyl-L-leucine”“Aspartylysine”(天冬氨酸)和“Glutathione disulfide”等。其中，共有差異代謝物共有4種，包括“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“N-Acetyl-L-leucine”和“Aspartylysine”(天冬氨酸)等。另外，觀察表2中的FC值可知，14種差異代謝物的含量在給藥后發(fā)生了顯著變化。

表2 黃芩苷組和對照組、鹽酸小檗堿組和對照組差異代謝物的篩選過程數(shù)據(jù)Tab 2 Screening process data of different metabolites in the baicalin group and the control group, the berberine hydrochloride group and the control group

在黃芩苷組與對照組的評估中，共有“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“Glycerophosphoglycerol”“Caproylcholine”(已基膽堿)、“N-Acetyl-L-leucine”“Aspartylysine”(天冬氨酸)和“L-Cysteine”(L-半胱氨酸)等7種差異代謝物含量顯著下調(diào)；僅有“Succinyladenosine”“UDP-N-acetyl-D-glucosamine”等2種差異代謝物含量顯著上調(diào)，見圖6。表明黃芩苷以不同的方式干擾了鮑曼不動桿菌的代謝途徑。

表3 黃芩苷組和對照組、鹽酸小檗堿組和對照組差異代謝物的篩選過程數(shù)據(jù)續(xù)Tab 3 Screening process data of different metabolites in the baicalin group and the control group, the berberine hydrochloride group and the control group

表4 差異代謝物的鑒定結(jié)果Tab 4 Identification results of different metabolites

在鹽酸小檗堿與對照組的評估中，共有9種代謝產(chǎn)物發(fā)生了顯著變化，其中，“Tyramine”(酪胺)、“Melibionate”“Xanthosine 5′-phosphate”“N-Acetyl-L-leucine”和“Aspartylysine”(天冬氨酸)等5種差異代謝物含量顯著下調(diào)；“N-(L-Arginino)succinate”“Uridine triphosphate”(尿苷三磷酸)、“D-Erythrose 4-phosphate”和“Glutathione disulfide”等4種差異代謝物含量顯著上調(diào)，見圖7。表明鹽酸小檗堿以不同的方式干擾了鮑曼不動桿菌的代謝途徑。

3.4 基于黃芩苷與鹽酸小檗堿的代謝通路富集分析

3.4.1 黃芩苷代謝通路富集分析：對上述9個差異代謝物進行通路富集分析，主要有10個代謝通路受到了影響，見圖8—10。主要的通路包括：“Homocysteine Degradation”“Taurine and Hypotaurine Metabolism”“Glutathione Metabolism”(谷胱甘肽代謝)、“Pantothenate and CoA Biosynthesis”“Cysteine Metabolism”(半胱氨酸代謝)、“Galactose Metabolism”(半乳糖代謝)、“Methionine Metabolism”“Glutamate Metabolism”(谷氨酸代謝)、“Glycine and Serine Metabolism”及“Tyrosine Metabolism”(酪氨酸代謝)等。

A.對照組和黃芩苷組之間的Fold Change值對比圖(n=6，F(xiàn)C<1)； B.對照組和黃芩苷組之間的Fold Change值對比圖(n=6，F(xiàn)C>1)；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01A.comparison of Fold Change values between the control group and the baicalin group (n=6, FC<1)；B.comparison of Fold Change values between the control group and the baicalin group (n=6, FC>1)；vs. the control group, *P<0.05，**P<0.01圖6 對照組和黃芩苷組之間的Fold Change值對比圖(n=6)Fig 6 Comparison of Fold Change values between the control group and the baicalin group (n=6)

A. 對照組和鹽酸小檗堿組之間的Fold Change值對比圖(n=6, FC<1)；B. 對照組和鹽酸小檗堿組之間的Fold Change值對比圖(n=6, FC>1)； 與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01A.comparison of Fold Change values between the control group and the berberine hydrochloride group (n=6, FC<1)；B. comparison of Fold Change values between the control group and the berberine hydrochloride group (n=6, FC>1)；vs. the control group, *P<0.05，**P<0.01圖7 對照組和鹽酸小檗堿組之間的Fold Change值對比圖(n=6)Fig 7 Comparison of Fold Change values between the control group and the berberine hydrochloride group (n=6)

圖8 黃芩苷組9種差異代謝物代謝通路富集分析圖Fig 8 Enrichment analysis of 9 differential metabolite metabolic pathways in the baicalin group

3.4.2 鹽酸小檗堿代謝通路富集分析：對9個差異代謝物進行通路富集分析，主要有16個代謝通路受到了影響，見圖11—13。主要的通路包括：“Glutamate Metabolism”(谷氨酸代謝)、“Nucleotide Sugars Metabolism”(核苷酸糖代謝)、“Lactose Synthesis”(乳糖合成)、“Glutathione Metabolism”(谷胱甘肽代謝)、“Pentose Phosphate Pathway”(戊糖磷酸途徑)、“Urea Cycle”(尿素循環(huán))、“Starch and Sucrose Metabolism”“Amino Sugar Metabolism”(氨基糖代謝)、“Aspartate Metabolism”(天冬氨酸代謝)、“Galactose Metabolism”(半乳糖代謝)、“Arginine and Proline Metabolism”“Warburg Effect”“Pyrimidine Metabolism”(嘧啶代謝)、“Arachidonic Acid Metabolism” “Tyrosine Metabolism”(酪氨酸代謝)及“Purine Metaboli”等。

4 討論

本研究通過OPLS-DA分析，從中初步篩選差異代謝物。篩選結(jié)果表明，黃芩苷、鹽酸小檗堿存在一定的代謝物水平差異，二者存在差別。

L-半胱氨酸是一種存在生物體內(nèi)具有生理功能的常見的氨基酸，可抗衰老。有研究結(jié)果表明，其能有效抑制NADPH氧化酶的活性，提高氧化損傷胚胎的抗氧化能力，利于胚胎發(fā)育。因此，推測L-半胱氨酸可能具有提高細菌某種合成反應(yīng)的活力，進而增強細菌的生存能力[19]。黃芩苷可降低L-半胱氨酸的含量，降低鮑曼不動桿菌的生存活力，進而影響其繁衍增殖。

尿苷三磷酸主要用于RNA合成，也可用作能量來源[20]。RNA是遺傳信息的載體，主要包括信使RNA和轉(zhuǎn)運RNA，DNA序列需要轉(zhuǎn)錄成RNA，RNA才能被翻譯為蛋白質(zhì)。因此，可以推測在鹽酸小檗堿的壓力下，鮑曼不動桿菌內(nèi)的尿苷三磷酸含量發(fā)生顯著變化，以干擾鮑曼不動桿菌的DNA合成，進而影響其繁衍增殖。

綜上所述，本研究利用液相色譜-質(zhì)譜代謝組學(xué)技術(shù)，初步探討了黃芩苷和鹽酸小檗堿體外抑制鮑曼不動桿菌的作用機制，篩選出黃芩苷和鹽酸小檗堿各9種代謝差異物；進一步將差異代謝物進行代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)黃芩苷與鹽酸小檗堿在抑制鮑曼不動桿菌的機制上存在差異。黃芩苷可干擾谷氨酸代謝和半胱氨酸代謝通路等，可下調(diào)L-半胱氨酸在谷氨酸代謝通路中的含量；鹽酸小檗堿可干擾嘧啶代謝和氨基糖代謝等，可上調(diào)尿苷三磷酸在嘧啶代謝通路中的含量。本研究從代謝角度為中藥抑制鮑曼不動桿菌提供了參考。

圖9 黃芩苷組9種差異代謝物代謝通路富集分析圖(附表)Fig 9 Enrichment analysis of 9 differential metabolite metabolic pathways in the baicalin group (attached table)

圖中圈內(nèi)為差異代謝物L(fēng)-Cysteine(L-半胱氨酸)the differential metabolite L-Cysteine (L-cysteine) is circled in the figure圖10 谷氨酸代謝通路圖Fig 10 Diagram of glutamate metabolite metabolic pathway

圖11 鹽酸小檗堿組8種差異代謝物代謝通路富集分析圖Fig 11 Enrichment analysis of 8 different metabolite metabolic pathways in the berberine hydrochloride group

圖12 鹽酸小檗堿組8種差異代謝物代謝通路富集分析圖(附表)Fig 12 Enrichment analysis of 8 different metabolite metabolic pathways in the berberine hydrochloride group (attached table)

差異代謝物Uridine triphosphate是圖中圈內(nèi)的磷酸形式the differential metabolite Uridine triphosphate is the phosphate form in the circle in the figure圖13 嘧啶代謝通路圖Fig 13 Diagram of pyrimidine metabolite metabolic pathway