周可欣 文 鑫 鄧 成 陳帥龍 齊興柱 駱 劍

(海南大學(xué)海洋學(xué)院, 海南省水產(chǎn)種業(yè)工程研究中心, 海洋生物國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 南海海洋資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南省熱帶水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, ?？?570228)

體色是魚(yú)類形態(tài)多樣性的特征之一, 魚(yú)類的體色是由色素細(xì)胞及其所含的色素體產(chǎn)生的, 色素細(xì)胞的類型、大小、形態(tài)及分布的不同形成了豐富的體色, 為發(fā)育和進(jìn)化提供了良好的材料[1]。魚(yú)類皮膚包括黑色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞和虹彩細(xì)胞等基本色素細(xì)胞[2]。魚(yú)類體色相關(guān)基因的突變和缺失能夠?qū)е缕つw著色的異常[3], 體色也受神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié), 隨著環(huán)境的改變而產(chǎn)生適應(yīng)性變化[4,5]。這種變化可以通過(guò)鱗片和皮膚中色素細(xì)胞內(nèi)的色素體選擇性地吸收特定波長(zhǎng)的光而反射其他波長(zhǎng)的光來(lái)完成[6]。魚(yú)類在生長(zhǎng)過(guò)程中, 會(huì)產(chǎn)生生理上的體色變化, 可以通過(guò)色素細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)改變魚(yú)類的體色[7—9], 同時(shí)也可通過(guò)色素細(xì)胞數(shù)量的增加或者減少對(duì)體色產(chǎn)生影響[10,11]。魚(yú)類在適應(yīng)環(huán)境過(guò)程中, 光感受也會(huì)導(dǎo)致體色變化,例如光照強(qiáng)度和光照周期等會(huì)影響內(nèi)分泌系統(tǒng)對(duì)色素細(xì)胞生成代謝的調(diào)控[12]。

石斑魚(yú)種類眾多, 是全球珊瑚礁、海草場(chǎng)和海藻場(chǎng)生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵種, 不同種類的石斑魚(yú)擁有著不同的體色, 豐富的體色變化為其提供了關(guān)鍵的偽裝[13]。豹紋鰓棘鱸(Plectropomus leopardus)是一種主要分布于熱帶和亞熱帶海域的名貴礁棲石斑魚(yú),其體色鮮艷呈紅色, 全身布滿藍(lán)白色斑點(diǎn), 既可作為觀賞魚(yú)類, 也可作為高食用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)物種。然而,豹紋鰓棘鱸的體色和斑紋會(huì)受到生理或環(huán)境因素的影響, 呈現(xiàn)出黑色和紅色, 并在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生顏色深淺的改變及斑紋的變異[14]。目前, 豹紋鰓棘鱸體色形成和變異的機(jī)理尚不明確, 因此, 深入探討豹紋鰓棘鱸的體色調(diào)控規(guī)律, 探究其皮膚色素細(xì)胞的種類和分布, 及應(yīng)激狀態(tài)下色素細(xì)胞的變化, 將為探究其體色發(fā)育與變異的機(jī)制提供組織學(xué)的支撐。

本文以紅色和黑色的豹紋鰓棘鱸為對(duì)象, 對(duì)其不同部位的皮膚進(jìn)行組織學(xué)切片和觀察, 揭示其色素細(xì)胞的組成、形態(tài)及分布規(guī)律, 并研究其受環(huán)境影響而產(chǎn)生應(yīng)激狀態(tài)下的色素細(xì)胞形態(tài)變化, 不僅能揭示石斑魚(yú)類體色變異的多樣性機(jī)制, 為培育優(yōu)良體色的石斑魚(yú)品種奠定理論基礎(chǔ), 也能夠加深對(duì)于色彩豐富的珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的理解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本文的實(shí)驗(yàn)用魚(yú)選自海南省瓊海市鴻茂水產(chǎn)有限公司基地, 選取呈現(xiàn)體色差異的豹紋鰓棘鱸成魚(yú), 黑色和紅色個(gè)體各30尾, 平均體重為(520.30±20.50) g, 平均每尾體長(zhǎng)為(35.50±5.40) cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分為8組: 黑色魚(yú)背部組(BB)、黑色魚(yú)腹部組(BF)、黑色魚(yú)尾部組(BW)、紅色魚(yú)背部組(RB)、紅色魚(yú)腹部組(RF)、紅色魚(yú)尾部組(RW)、紅色魚(yú)應(yīng)激組(RS)和紅色魚(yú)非應(yīng)激組(RE)。

1.3 體色觀察

將魚(yú)體擦拭干凈后, 用相機(jī)(DSC-WX500)拍照, 并用色差儀(KONICA MINOLTA-CR-10Plus)對(duì)應(yīng)激和非應(yīng)激魚(yú)體的背部、腹部和尾部進(jìn)行測(cè)量,色差儀使用標(biāo)準(zhǔn)白色板校準(zhǔn)后測(cè)量樣品顏色, 并輸出比色后的色差數(shù)據(jù)。

剪下相同大小的黑色和紅色豹紋鰓棘鱸第一背鰭到第二背鰭下方, 測(cè)線鱗上方的背部皮膚、腹鰭到臀鰭上方, 測(cè)線鱗下方的腹部皮膚和尾柄處皮膚, 用生理鹽水潤(rùn)洗后, 在體視顯微鏡下觀察, 利用五點(diǎn)取樣法[15]進(jìn)行色素體統(tǒng)計(jì), 來(lái)計(jì)算平均單位面積下黑色素體和紅色素體的數(shù)量, 從而得出色素體的密度。

1.4 石蠟切片

取豹紋鰓棘鱸的背部、腹部和尾部皮膚組織保存于Bouin氏液固定液中, 采用石蠟切片的方法,經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和展片、HE染色和封片等步驟后, 用組織切片掃描儀(Pannoramic MIDI)進(jìn)行掃描和光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 冰凍切片

取豹紋鰓棘鱸的尾部皮膚保存于4%多聚甲醛24h, 經(jīng)過(guò)蔗糖溶液脫水、OCT包埋和切片等步驟制成冰凍切片, 切片厚8—10 μm, 將組織貼于載玻片上, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 應(yīng)激和非應(yīng)激狀態(tài)處理

豹紋鰓棘鱸被捕撈即發(fā)生應(yīng)激反應(yīng), 皮膚斑紋出現(xiàn)顯著變化, 為應(yīng)激組; 在水體中緩慢加入魚(yú)用麻醉劑(MS-222), 麻醉后再撈出, 豹紋鰓棘鱸體色和斑紋不改變, 為非應(yīng)激組。用剪刀將2組魚(yú)體的背部、腹部和尾部剪下面積為1 cm×1 cm, 厚度為2 mm的皮膚組織, 用PBS清洗后制作成裝片置于體視鏡(Motic SMZ-168)下觀察。

2 結(jié)果

2.1 豹紋鰓棘鱸體色差異分析

豹紋鰓棘鱸在應(yīng)激狀態(tài)下呈現(xiàn)出快速的體色變化, b、d個(gè)體為非應(yīng)激狀態(tài), 分別呈現(xiàn)出較黑和較紅的體色, 個(gè)體體色較深, 顏色分布均勻(圖 1)。在應(yīng)激條件下, 3—5s即可發(fā)生變化, 色素體在不同的部位收縮情況有較大差異, 呈現(xiàn)出明顯的斑紋(a、c個(gè)體), 在側(cè)線上方黑色個(gè)體和紅色個(gè)體分別平均分布著黑色斑點(diǎn)和紅色斑點(diǎn), 均圍繞著魚(yú)體的藍(lán)點(diǎn)分布, 斑點(diǎn)的大小和顏色沒(méi)有明顯差異, 其他部位皮膚顏色偏白, 斑點(diǎn)和其他部位皮膚顏色有著顯著深淺差異。而鰭條變化程度較低, 顏色變淺,尾鰭和臀鰭呈現(xiàn)出斑塊狀花紋。測(cè)線下方的腹部皮膚呈現(xiàn)條帶狀斑塊, 皮膚顏色較背部更深。

圖1 豹紋鰓棘鱸應(yīng)激狀態(tài)和非應(yīng)激狀態(tài)Fig. 1 The body color in stressed and unstressed state of Plectropomus leopardus

利用色差儀分別對(duì)不同的身體部位進(jìn)行色差分析, 得出豹紋鰓棘鱸的背部和尾部顏色較深, 腹部顏色較淺。如表 1所示, 在紅色個(gè)體中非應(yīng)激狀態(tài)下的背部色差值顯著高于應(yīng)激狀態(tài), 在黑色個(gè)體中非應(yīng)激狀態(tài)下的背部和腹部色差值顯著高于應(yīng)激狀態(tài), 在應(yīng)激狀態(tài)下紅色個(gè)體的背部和腹部色差值顯著高于黑色個(gè)體; 在非應(yīng)激狀態(tài)下紅色個(gè)體的背部和尾部色差值顯著高于黑色個(gè)體。通過(guò)對(duì)不同體色豹紋鰓棘鱸色素細(xì)胞數(shù)量的觀察得出(圖 2),在黑色個(gè)體中, 黑色素體的分布較紅色個(gè)體更密;在紅色個(gè)體中, 僅存在少量的黑色素細(xì)胞。

圖2 非應(yīng)激狀態(tài)下豹紋鰓棘鱸皮膚色素體密度比較Fig. 2 Comparison of pigment density of Plectropomus leopardus under non-stress state

表1 豹紋鰓棘鱸皮膚色差值比較Tab. 1 Comparison of color difference of Plectropomus leopardus

2.2 豹紋鰓棘鱸皮膚黑色素細(xì)胞組織學(xué)分析

觀察豹紋鰓棘鱸的皮膚石蠟切片(圖 3)可以得出, 皮膚的表皮層是由5—8層上皮細(xì)胞組成, 色素細(xì)胞主要分布于真皮層中, 色素細(xì)胞平行于表皮層排列緊密, 形成一條連續(xù)的色素條帶。

圖3 豹紋鰓棘鱸皮膚組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig. 3 Microscopical observation on skin section of Plectropomus leopardus

分別觀察豹紋鰓棘鱸的紅色和黑色個(gè)體不同部位的皮膚切片(圖 4), 可以得出不同部位的皮膚黑色素細(xì)胞的分布數(shù)量也不相同。背部和尾部皮膚黑色素細(xì)胞密度比較大, 腹部的黑色素細(xì)胞數(shù)量較少; 對(duì)不同體色豹紋鰓棘鱸的腹部進(jìn)行觀察, 可以得出黑色個(gè)體的黑色素細(xì)胞呈塊狀聚集在一起,而紅色個(gè)體的黑色素細(xì)胞分布比較稀疏; 觀察尾部皮膚, 可以看出黑色個(gè)體的黑色素細(xì)胞連續(xù)分布,數(shù)量顯著多于紅色個(gè)體, 而紅色個(gè)體的黑色素細(xì)胞則局部分散于尾部。

圖4 豹紋鰓棘鱸皮膚組織切片顯微結(jié)構(gòu)Fig. 4 Microscopical observation on skin section of Plectropomus leopardus

觀察不同體色豹紋鰓棘鱸皮膚冰凍切片可得出(圖 5), 黑色豹紋鰓棘鱸的尾部中含有大量的黑色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞, 相間分布。在紅色豹紋鰓棘鱸的尾部皮膚中, 可以明顯觀察到大面積分布的紅色素體, 幾乎不存在黑色素細(xì)胞。尾部皮膚組織中不僅色素細(xì)胞數(shù)量存在較大差異, 色素細(xì)胞的分布也存在差異, 在黑色個(gè)體中, 色素細(xì)胞平行于表皮基底層分布; 在紅色個(gè)體中, 色素細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則分布。

圖5 豹紋鰓棘鱸組織冰凍切片顯微結(jié)構(gòu)Fig. 5 microscopical observation of frozen section of tail tissue in Plectropomus leopardus

2.3 豹紋鰓棘鱸應(yīng)激和非應(yīng)激狀態(tài)下色素細(xì)胞觀察

對(duì)豹紋鰓棘鱸在應(yīng)激狀態(tài)和非應(yīng)激狀態(tài)下的觀察可以發(fā)現(xiàn), 應(yīng)激狀態(tài)時(shí)體色會(huì)迅速變淺, 如圖 6，通過(guò)體視鏡顯微觀察可以發(fā)現(xiàn)不同狀態(tài)下色素細(xì)胞的形態(tài)。

圖6 非應(yīng)激狀態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下的豹紋鰓棘鱸表皮色素體Fig. 6 Microscopic observation results of the Plectropomus leopardus in unstress state and stress state

在非應(yīng)激狀態(tài)下, 大多數(shù)的紅色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞為樹(shù)突狀、散射狀, 少數(shù)細(xì)胞形態(tài)為點(diǎn)狀。在非應(yīng)激狀態(tài)下色素細(xì)胞體積較大、顏色較淺。其中, 黑色素細(xì)胞大小為20—35 μm, 紅色素細(xì)胞相較于黑色素細(xì)胞較小為20—25 μm。在應(yīng)激狀態(tài)下, 色素細(xì)胞體積較小、顏色較深, 呈點(diǎn)狀、團(tuán)塊狀分布, 細(xì)胞為圓形或橢圓形。其中, 黑色素細(xì)胞大小為15—30 μm, 紅色素細(xì)胞較小為10—15 μm。

3 討論

3.1 色素細(xì)胞與豹紋鰓棘鱸體色的關(guān)系

魚(yú)類的體色呈現(xiàn)出多樣性, 這主要是由色素細(xì)胞及其色素體的的分布、數(shù)量和種類決定的, 在大口黑鱸(Micropterus salmoides)、羅非魚(yú)(Tilapia)鰓細(xì)胞和斑馬魚(yú)(Brachydanio rerio var)幼魚(yú)中黑色素細(xì)胞主要分布在真皮層的疏松層中[16]。在黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)的色素細(xì)胞遷移和分化研究中, 在表皮上也提取出了黑色素細(xì)胞[17]; 通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)匙吻鱘(Polyodon spathula)在表皮和真皮中均可觀察到色素體, 其黑色素細(xì)胞為圓形或不規(guī)則, 可以自由流動(dòng)[18]。這說(shuō)明色素細(xì)胞在表皮層和真皮層中均可分布。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)紅色和黑色豹紋鰓棘鱸不同部位進(jìn)行組織學(xué)觀察, 其皮膚主要可以分為表皮層和真皮層, 其色素細(xì)胞均分布于真皮層的疏松層中, 與大口黑鱸和羅非魚(yú)中色素細(xì)胞的分布特征較為一致。

當(dāng)魚(yú)類受到環(huán)境因子[19]、飼料[20]和基因遺傳等因素的影響[21]時(shí), 體色會(huì)通過(guò)色素細(xì)胞的種類、大小、形狀、數(shù)量和排列方式[22]及色素細(xì)胞的比例和色素小體的分布發(fā)生改變[23,24]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察豹紋鰓棘鱸的皮膚得出不同部位的色素細(xì)胞數(shù)量存在著顯著的差異, 其中背部和尾部黑色素細(xì)胞分布較多, 呈現(xiàn)出明顯的色素條帶, 而腹部色素細(xì)胞數(shù)量較少, 呈團(tuán)塊狀分布, 并且在紅色的豹紋鰓棘鱸中, 紅色素細(xì)胞的比例顯著高于黑色的豹紋鰓棘鱸。在對(duì)不同魚(yú)類的研究中發(fā)現(xiàn), 隨著魚(yú)體的發(fā)育，色素細(xì)胞的類型也會(huì)發(fā)生改變, 當(dāng)色素細(xì)胞聚集在一起時(shí)，魚(yú)類體表就會(huì)出現(xiàn)色素條帶和斑塊[25]。已有的研究發(fā)現(xiàn), 在紅、藍(lán)和金屬色系的暹羅斗魚(yú)(Betta splendensRegan)中, 影響紅色系深淺的關(guān)鍵因素是紅、黃色素細(xì)胞的比例, 當(dāng)黑色素細(xì)胞越多, 魚(yú)體體色越深[26]。橘色雙冠麗魚(yú)(Amphilophus citrinellus)的體色鮮艷程度在發(fā)育過(guò)程中和其色素細(xì)胞數(shù)量變化是一致的, 黑色素細(xì)胞的減少及黃色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞的增多有可能和魚(yú)體體色變淺相關(guān), 不同種類色素細(xì)胞的比例和分布有可能導(dǎo)致魚(yú)類體色的變化[27]。這與本實(shí)驗(yàn)中不同體色豹紋鰓棘鱸紅色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞比例存在差異的現(xiàn)象一致, 因此, 魚(yú)體不同部位的呈色程度受到色素細(xì)胞數(shù)量的影響, 呈色較深的部位色素細(xì)胞數(shù)量多, 分布密集。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果中不同部位色素細(xì)胞的分布差異可能與豹紋鰓棘鱸生長(zhǎng)過(guò)程中規(guī)避敵害和自我保護(hù)有關(guān), 其腹部色素細(xì)胞較少呈色較淺有利于自我隱蔽, 而背部和尾部色素細(xì)胞較多呈色較深可能與皮膚中感光調(diào)節(jié)有關(guān)。

3.2 在應(yīng)激狀態(tài)下豹紋鰓棘鱸的體色變化

兩棲動(dòng)物及其他的變色動(dòng)物的體色改變, 主要是由于色素細(xì)胞及色素體的分布不同而導(dǎo)致的[28],包括色素體的聚集和分散, 使得皮膚的顏色發(fā)生改變[11]。通過(guò)觀察得到豹紋鰓棘鱸的皮膚中主要有紅色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞, 其中呈樹(shù)突狀的黑色素細(xì)胞大量分布在體表。色素細(xì)胞的體積影響著其細(xì)胞分支, 體積越大, 色素細(xì)胞分支越多, 則含有更多的色素小體, 使得皮膚顏色加深[29]。例如在尼羅羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus)的研究中, 通過(guò)使用低劑量的MCH使黑色素細(xì)胞分支增多, 從而加深了魚(yú)的體色[30]。這和本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致, 豹紋鰓棘鱸色素體聚集會(huì)導(dǎo)致色素在皮膚上的覆蓋度顯著降低, 從而呈現(xiàn)淺色; 而色素體的分散使得覆蓋度增加, 導(dǎo)致表觀體色加深。

一些魚(yú)類所處環(huán)境改變或應(yīng)激時(shí), 其體表的色素細(xì)胞會(huì)發(fā)生聚集或分散, 當(dāng)色素細(xì)胞分散時(shí)魚(yú)的體色會(huì)變深, 而當(dāng)色素細(xì)胞聚集時(shí), 魚(yú)的體色會(huì)變淺[31,32]。在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中, 豹紋鰓棘鱸在環(huán)境條件發(fā)生改變時(shí)能夠迅速變?yōu)閼?yīng)激狀態(tài), 黑色素細(xì)胞和紅色素細(xì)胞變小呈顆粒狀聚集在一起, 使得魚(yú)的體色變淺。有關(guān)研究結(jié)果表明, 雄性雨蛙(Litoria wilcoxii)在抱合期間經(jīng)歷從棕色到黃色的快速顏色變化, 并在被捕獲后逐漸失去黃色, 這可能是受到外界壓力后黑色素細(xì)胞移位的結(jié)果[11]。在大口黑鱸的研究中發(fā)現(xiàn), 色素細(xì)胞膨大時(shí), 色素展開(kāi),體色格外鮮明, 而當(dāng)色素細(xì)胞收縮時(shí), 色素隱沒(méi), 體色亦隨之黯淡或隱沒(méi)[16]。在大黃魚(yú)(Larimichthys crocea)的相關(guān)研究中表明, MSH多肽可以分散大黃魚(yú)的黃色素細(xì)胞, 使其體色緩慢變黃[33]。比目魚(yú)(Pleuronectiformes)能夠相當(dāng)逼真地與多種環(huán)境相匹配, 調(diào)整體表斑塊, 其變色時(shí)間為2—8s[34]。綜上所述, 豹紋鰓棘鱸的體色變化原因與已有報(bào)道一致,是由色素細(xì)胞的形態(tài)導(dǎo)致。然而當(dāng)豹紋鰓棘鱸受到外界環(huán)境的刺激時(shí), 可能由神經(jīng)調(diào)控其紅色素細(xì)胞和黑色素細(xì)胞色素體發(fā)生迅速的運(yùn)動(dòng), 使背部和腹部呈現(xiàn)出不同的斑紋和顏色, 可能與珊瑚礁魚(yú)類躲避敵害有關(guān), 3—5s即可完成變化, 其體色變化的速度與其他魚(yú)類存在顯著差異。