張文馨 潘 霞 沈錫權(quán) 徐永健

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院, 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧波 315211)

海馬是一種深受東南亞國(guó)家喜愛(ài)的傳統(tǒng)中藥[1]。當(dāng)前, 因全球野生海馬種群的棲息地遭到破壞而導(dǎo)致其資源數(shù)量驟減, 但海馬的市場(chǎng)需求卻與日俱增。因此, 海馬養(yǎng)殖業(yè)極具潛力, 不僅可以滿足市場(chǎng)需求，還能夠保護(hù)其野生資源[2]。盡管多年來(lái)針對(duì)海馬的繁殖和培育開(kāi)展了許多研究工作, 但仍然存在諸多養(yǎng)殖技術(shù)難題[3], 這些問(wèn)題主要由養(yǎng)殖環(huán)境的脅迫所致。

鹽度是魚(yú)類生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因素之一, 鹽度變化對(duì)海馬的生長(zhǎng)發(fā)育及生理生化等方面存在很大影響[4]。已有一些研究涉及其他海洋魚(yú)類, 證明鹽度變化會(huì)影響魚(yú)類的存活和生長(zhǎng)[5], 甚至影響魚(yú)類的性別決定和早期發(fā)育[6]。而鹽度脅迫會(huì)引起滲透脅迫, 導(dǎo)致魚(yú)類血漿應(yīng)激相關(guān)激素增多, 能量代謝受到影響, 電解質(zhì)平衡被破壞, 進(jìn)而影響生物體內(nèi)的滲透壓穩(wěn)態(tài)和免疫穩(wěn)態(tài)[7]。Lu等[8]的研究發(fā)現(xiàn), 高鹽脅迫使黃鱔(Nibea albiflora)肝胰腺抗氧化酶和非特異性免疫酶活性發(fā)生顯著變化。有報(bào)道指出, 長(zhǎng)期低鹽脅迫顯著降低了小龍蝦(Cherax quadricarinatus)免疫相關(guān)基因(Toll基因和ProPO基因)的表達(dá)水平[9]。這些工作對(duì)于海馬養(yǎng)殖條件的研究都有很好的借鑒。海馬屬于廣鹽性魚(yú)類, 可以存活于10‰—32‰鹽度的環(huán)境中[10], 但海馬幼體對(duì)鹽度變化的適應(yīng)能力差, 鹽度急劇變化會(huì)導(dǎo)致滲透脅迫,并增加滲透調(diào)節(jié)和其他幾種生物過(guò)程所需的能量需求[11,12], 因此鹽度波動(dòng)對(duì)海馬幼體的影響較大。為減輕和避免鹽度變化帶來(lái)的不利影響, 本研究以養(yǎng)殖大海馬(Hippocampus kuda)幼體為研究對(duì)象,采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)鹽度脅迫下大海馬幼體的肝臟組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序, 分析其肝臟組織在高/低鹽度脅迫下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況, 揭示了大海馬鹽度應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制, 并從中挖掘響應(yīng)鹽度應(yīng)激的候選基因, 作為海馬養(yǎng)殖過(guò)程中的生物標(biāo)記指示物。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)用生物大海馬幼體由寧波大學(xué)海馬養(yǎng)殖研究實(shí)驗(yàn)室培育。挑選健康無(wú)病且活力良好的個(gè)體 [個(gè)體質(zhì)量: (0.46±0.07) g, 體長(zhǎng): (5.78±0.42) cm(P＞0.05)], 于實(shí)驗(yàn)前置于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周。暫養(yǎng)期間使用鹽度25‰、溫度(25±0.5)℃、含氧量DO＞5 mg/L過(guò)經(jīng)砂濾后的天然海水, 每日定時(shí)投喂 2 次, 攝食 2h 后吸污并換水50%。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后, 各組鹽度設(shè)置如下: 對(duì)照組鹽度25‰(Control,CK)、高鹽脅迫組31‰(HS-test)和低鹽脅迫組17‰(LS-test), 各組水溫均保持25℃。急性鹽度脅迫 12h 后, 每組隨機(jī)取 3 尾大海馬的肝臟置于同一凍存管中制成一個(gè)混樣以消除個(gè)體誤差, 以此每組各設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)[13]。樣品組織以液氮速凍,置于-80℃ 冰箱中保存。

1.2 RNA 提取、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

采用 RNAiso plus 試劑盒(大連寶生生物有限公司)提取肝臟總 RNA。采用Multiskan SkyHigh微孔板分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))檢驗(yàn)RNA樣品的濃度(ng/μL)和純度(A260/A280值), 利用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查 RNA 樣品的完整性,采用 Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)(Agilent Technologies,美國(guó))評(píng)估 RNA 的濃度和完整性。取每組2 μg RNA樣品, 采用 NEBNext UltraTMRNA 文庫(kù)制備試劑盒(New England Biolabs, 美國(guó))構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并在 Illumina 平臺(tái)上測(cè)序, 測(cè)序策略為 PE150 [安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司]。

1.3 轉(zhuǎn)錄組的組裝, 注釋和DEGs分析

使用 Perl 腳本處理原始數(shù)據(jù), 以確保后續(xù)用于信息分析的數(shù)據(jù)質(zhì)量, 包括去除接頭污染的 Reads、低質(zhì)量的 Reads 及含N 比例大于5%的Reads。對(duì)過(guò)濾后所得到的 Clean Data的質(zhì)量和數(shù)據(jù)量等性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 包括過(guò)濾后的總序列中質(zhì)量值大于30(錯(cuò)誤率＜0.1%) 的堿基數(shù)的比例(Clean Q30 bases rate,Q30)、數(shù)據(jù)量和堿基含量等。采用 Trinity 軟件對(duì)進(jìn)行組裝, 對(duì)得到的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行評(píng)估, 然后進(jìn)行開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)預(yù)測(cè)和功能分析[14]。采用 RPKM法計(jì)算基因表達(dá)量[15], 采用DEGseq v1.18.0 軟件[16]對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。對(duì)DEGs(Q≤0.05 且| log2 ratio |≥1)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology, GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)通路富集分析。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR) 分析

本實(shí)驗(yàn)以 β2-微球蛋白(beta-2 microglobulin,B2M)作為內(nèi)參基因[14], 對(duì)10 個(gè)差異表達(dá)基因的RNA-Seq 結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中的Unigene 序列, 用 Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表 1)。使用Eppendorf Mastercycler ep realplex4(Eppendorf, 德國(guó))和TB Green Premix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus; TaKaRa, 大連)試劑盒對(duì)差異表達(dá)基因的表達(dá)量進(jìn)行定量測(cè)定, 采用 2-ΔΔCt法[17]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR所用基因及其引物序列Tab. 1 Primers used for RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 大海馬肝臟 mRNA 測(cè)序結(jié)果及從頭組裝

高通量測(cè)序結(jié)果顯示(表 2), CK、HS-test、CK和 LS-test 組分別獲得55510236、58040146和55840746個(gè)原始讀段(Raw reads)。過(guò)濾后分別獲得54453888(CK)、56489512(HS-test)和54407308(LS-test)個(gè)Clean reads。Q30分別為97.80%(CK)、95.88%(HS-test)和95.84%(LS-test), 均大于95%, 證明數(shù)據(jù)可靠。Trinity 軟件組裝高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)后(表 3), 共生成154430個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 最大長(zhǎng)度為15866 bp, 最小長(zhǎng)度為201 bp, 平均長(zhǎng)度為1234.69 bp,N50 長(zhǎng)度為2318 bp。所得轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)一步組裝處理后獲得71794個(gè)單基因簇(Unigene), 平均長(zhǎng)度為820.71 bp, N50為1780 bp。其中68.07%的Unigenes在200—600 bp, 9.96%的Unigenes在600—1000 bp, 1000—2000 bp占10.87%, 11.10%的Unigenes在2000 bp以上。

表2 大海馬測(cè)序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)匯總Tab. 2 Statistic summary of the sequencing data of H. kuda

表3 組裝結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab. 3 Statistics of assembly results

2.2 基因功能注釋

將獲得的 Unigene 數(shù)據(jù)信息分別在蛋白質(zhì)家族域數(shù)據(jù)庫(kù)(Pfam)、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss-Prot)、非冗余蛋白數(shù)據(jù)(Nr)、真核生物蛋白相鄰類的聚簇(KOG)、基因本體論(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)和東京基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)等數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋。結(jié)果顯示(表 4), 37.61%的 Unigenes在Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋, 占比最多;核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Nt)注釋的Unigenes占 31.19%; 4781 個(gè)Unigenes在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋, 僅占比6.66%; 24450個(gè)Unigenes 在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了注釋, 占比34.06%。GO數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋3個(gè)方面(圖 1): 生物過(guò)程(Biological process)、細(xì)胞組成(Cellular component)和分子功能(Molecular function)。利用Trinotate的注釋結(jié)果, 統(tǒng)計(jì)每個(gè)GO條目中注釋到的基因, 并根據(jù)二級(jí)GO條目得到統(tǒng)計(jì)結(jié)果。生物學(xué)過(guò)程中, 占比前5的主要類別依次為細(xì)胞過(guò)程(72.75%)、生物調(diào)節(jié)(50.84%)、代謝過(guò)程(51.46%)、生物過(guò)程調(diào)節(jié)(47.50%)和刺激反應(yīng)(36.05%); 在分子功能類別中代表性的類別分別是結(jié)合功能(63.10%)、催化活性(34.67%)和分子功能調(diào)節(jié)(7.62%); 細(xì)胞組成部分中最主要的類別為分別為細(xì)胞(79.42%)、細(xì)胞組分(79.26%)、細(xì)胞器(63.61%)和膜(46.63%)。

圖1 GO 統(tǒng)計(jì)柱狀圖Fig. 1 GO statistics histogram

表4 各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋匯總表Tab. 4 Summary of comments in each database

在 KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)中, 14428個(gè)基因注釋到了 25個(gè)直系同源組(圖 2), 其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(T,23.61%)與一般功能預(yù)測(cè)(R, 13.54%)代表了最大的類群, 其次是轉(zhuǎn)錄(K, 11.73%)、翻譯后修飾/蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)/分子伴侶(O, 8.18%)和細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸/分泌和囊泡運(yùn)輸(U, 6.10%)。

圖2 KOG統(tǒng)計(jì)圖Fig. 2 KOG chart

由圖 3 可知,HS-testvs. CK 共獲得2740 個(gè)差異表達(dá)基因(P＜0.05), 其中顯著下調(diào)495 個(gè), 顯著上調(diào) 2245 個(gè); LS-testvs. CK 共獲得 3715 個(gè)差異表達(dá)基因, 1854 個(gè)顯著上調(diào), 1861 個(gè)顯著下調(diào)。高溫脅迫組的上調(diào)基因數(shù)量低于下調(diào)基因; 而在低溫脅迫組中, 上下調(diào)基因數(shù)量占比相當(dāng)。

圖3 大海馬肝臟轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖Fig. 3 Statistical diagram of differentially expressed genes in liver transcriptome of H. kuda

肝臟轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖 4), 兩兩比對(duì)后三組均顯著差異表達(dá)的基因共計(jì)161個(gè), HS-testvs. CK 與 LS-testvs. CK有1260個(gè)相同的差異表達(dá)基因, 而 1480 個(gè)差異基因僅在 HS-testvs. CK顯著表達(dá), 共有2455 個(gè)差異基因僅在 LS-testvs. CK顯著表達(dá)。

圖4 大海馬肝臟轉(zhuǎn)錄組中差異基因韋恩圖Fig. 4 Venn diagram of differential gene in liver transcriptome of H. kuda

2.3 差異表達(dá)基因的 KEGG 富集分析

KEGG 是一個(gè)實(shí)用程序數(shù)據(jù)庫(kù), 整合了系統(tǒng)功能信息、基因組信息和化學(xué)信息, 有助于了解生物系統(tǒng)的高級(jí)功能和實(shí)用性, 如在分子水平探究細(xì)胞、生物和生態(tài)系統(tǒng)的信息, 而差異表達(dá)基因的Pathway 注釋分析有助于在被整合的分子互動(dòng)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)一步解讀基因的功能[18], 是國(guó)際最常用的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)之一。將獲得的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因在KEGG中進(jìn)行富集比對(duì)時(shí), 對(duì) KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的Pathway 信息應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析, 歸納差異表達(dá)基因中顯著富集的 Pathway(Q＜0. 05)[14]。其中Q值為多重假設(shè)檢驗(yàn)校正之后的P值,Q值越小, 表示差異表達(dá)基因在該通路中的富集顯著性越高[19]。在本研究中, HS-testvs. CK 的差異表達(dá)基因共富集到 227 條代謝調(diào)節(jié)通路, 其中顯著富集的通路是類固醇生物合成(Steroid biosynthesis)。LS-testvs. CK 的差異表達(dá)基因富集到252條代謝調(diào)節(jié)通路,其中顯著富集的通路有蛋白酶體(Proteasome)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、類固醇生物合成(Steroid biosynthesis)及檸檬酸循環(huán)(Citrate cycle)等。

表 5和表 6 分別為HS-testvs.CK和LS-testvs.CK的差異表達(dá)基因富集得到的前 20 個(gè) KEGG 代謝通路, 其中高鹽脅迫組中代謝途徑 (如類固醇生物合成、維生素消化吸收、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等氨基酸代謝、甘油磷脂代謝、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、磷酸鹽和次磷酸鹽代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、類固醇激素生物合成等)和免疫途徑(如PPAR信號(hào)通路、抗原加工提呈、NF-κB信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞色素P450對(duì)異生素的代謝等)受到影響。低鹽脅迫組富集得到的代謝通路主要涉及氨基酸相關(guān)代謝有關(guān)通路 (如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、賴氨酸降解、賴氨酸生物合成)、能量和脂肪酸代謝有關(guān)通路 [如類固醇生物合成、氧化磷酸化、檸檬酸循環(huán)、碳代謝、淀粉和蔗糖代謝、核糖體生物發(fā)生 (真核生物)]和免疫代謝相關(guān)通路(如蛋白酶體、抗原加工提呈、抗壞血酸和藻酸鹽代謝)等。

根據(jù)表 5和表 6富集通路中的有關(guān)基因, 結(jié)合所查閱的相關(guān)文獻(xiàn), 最終篩選得到Gst、Hsp70、Hsp90、Sod、Bcl-2、Gadd45α、Tcrβ、Tap2和Traf3等免疫相關(guān)基因,Fadsd6、Fas、Sqle、Cyp51、Elovl6和Slc27a6等脂肪酸代謝相關(guān)基因,Vlcad、Pdha1、Mdh1、Idh3b、G6pd和Sdhd等能量代謝相關(guān)基因, 及Gldc、Atp6v1e1、Sms、Fadh、Asl、Ass1和Glud1等與氨基酸代謝以及滲透轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因在鹽度應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。

本研究共篩選出了Gst、Hsp70、Hsp90、Sod、Bcl-2、Gadd45α、Fadsd6、Fas、Sqle、Cyp51、Elovl6、Pdha1、Mdh1、Idh3b、G6pd、Sms、Asl和Glud1 等對(duì)鹽度脅迫敏感的候選基因。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-Seq檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性, 通過(guò)查閱文獻(xiàn)共選取 10個(gè)差異表達(dá)基因 (表 1)進(jìn)行驗(yàn)證。以B2M作為內(nèi)參基因, 采用 RT-qPCR 相對(duì)定量方法, 檢測(cè)這些差異表達(dá)基因在試驗(yàn)組與處理組中的表達(dá)量差異。將 RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果進(jìn)行比較, 結(jié)果表明, 10個(gè)差異表達(dá)基因的RNA-seq 相對(duì)表達(dá)水平與 RT-qPCR 相對(duì)表達(dá)趨勢(shì)基本一致 (圖 5和圖 6), 證明了轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的可靠性。

圖5 高鹽脅迫組 (HS-test) RT-qPCR 及 RNA-Seq 的比較分析Fig. 5 Comparative analysis of RT-qPCR and RNA-Seq in HStest

圖6 低鹽脅迫組 (LS-test) RT-qPCR 及 RNA-Seq 的比較分析Fig. 6 Comparative analysis of RT-qPCR and RNA-Seq in LS-test

3 討論

水環(huán)境中鹽度的變化能夠?qū)λa(chǎn)動(dòng)物的行為和生理生化等方面產(chǎn)生十分復(fù)雜的影響, 從行為至分子水平的影響均十分嚴(yán)重, 且影響程度存在物種差異性[20]。鹽度變化一般會(huì)直接破壞水產(chǎn)動(dòng)物的電解質(zhì)平衡, 導(dǎo)致滲透壓改變, 此外還會(huì)影響氨基酸代謝、能量代謝、免疫代謝和應(yīng)激激素水平等方面[21]。有研究表明, 魚(yú)類和甲殼類水產(chǎn)動(dòng)物的鰓[22,23]、肌肉[24]和肝臟[25,26]等組織器官都會(huì)因鹽度變化而受到影響。本研究結(jié)果也表明, 高鹽和低鹽對(duì)大海馬幼體造成的影響是不同的 (表 5和表 6): 在暴露于低鹽時(shí), 主要涉及與氨基酸代謝 (大部分基因上調(diào))、能量代謝 (大部分基因上調(diào))和免疫功能 (大部分基因上調(diào))相關(guān)的途徑發(fā)生改變; 而暴露于高鹽時(shí), 免疫功能 (大部分基因上調(diào))和脂質(zhì)代謝 (大部分基因下調(diào))相關(guān)的途徑發(fā)生了明顯變化。

3.1 鹽度對(duì)大海馬免疫功能的影響

鹽度脅迫會(huì)造成水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)氧化損傷, 其中氧化應(yīng)激下的酶活性變化及其相關(guān)機(jī)制已有許多報(bào)道[22,27]。在本研究中的低鹽脅迫下, 蛋白酶體途徑顯著富集, 且富集于此途徑的基因均顯著上調(diào)(如26s蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞單位11A、B等)。蛋白酶體途徑可以響應(yīng)感染、熱休克或氧化損傷等多種細(xì)胞應(yīng)激, 此途徑具有重要且復(fù)雜的功能。熱休克蛋白 (HSP)可以識(shí)別錯(cuò)誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì), 通過(guò)蛋白酶體的水解作用降解蛋白[28]。本研究發(fā)現(xiàn), 低鹽脅迫會(huì)使大海馬幼體體內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷, DEGs中抗氧化基因 (如Sod和Gst)和熱休克蛋白基因 (如Hsp70和Hsp90)的顯著上調(diào)證實(shí)了這一點(diǎn)。此外, 表 5和表 6的結(jié)果發(fā)現(xiàn)了多個(gè)免疫相關(guān)通路, 如抗原加工提呈、NF-κB信號(hào)通路和IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等, 經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)高/低鹽脅迫組中多數(shù)免疫相關(guān)基因顯著上調(diào), 如Tcrβ、Tap2、Traf3和Gadd45α等。在水體鹽度變化時(shí), 大海馬免疫防御系統(tǒng)中的免疫分子轉(zhuǎn)錄增加, 推測(cè)是為環(huán)境應(yīng)激可能導(dǎo)致的疾病做準(zhǔn)備[29]。

表5 HS-test vs. CK差異基因富集的前20個(gè)KEGG代謝通路Tab. 5 Top 20 KEGG metabolic pathways enriched for HS-test vs. CK differential genes

3.2 鹽度對(duì)大海馬幼體氨基酸代謝的影響

游離氨基酸、離子通道和水通道蛋白是已知的3種鹽度脅迫效應(yīng)物[30]。據(jù)報(bào)道游離氨基酸在細(xì)胞體積變化和滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中具有重要功能, 且大多數(shù)水生物種在環(huán)境鹽度變化時(shí), 將體內(nèi)的游離氨基酸積累在細(xì)胞內(nèi)[31]。在本研究中, 表 6的前20個(gè)KEGG通路中低鹽脅迫組富集了多個(gè)氨基酸代謝通路, 如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、賴氨酸降解和生物合成及β-丙氨酸代謝等代謝途徑。除表 6外, 本研究還富集到了半胱氨酸和蛋氨酸代謝、組氨酸代謝、精氨酸生物合成及精氨酸和脯氨酸代謝等通路。以上通路中富集的基因多數(shù)顯著上調(diào), 表明氨基酸代謝的增加可能是大海馬幼體應(yīng)對(duì)低鹽脅迫的一個(gè)重要調(diào)節(jié)途徑, 類似結(jié)果也在牡蠣 (Crassostrea gigas)[32]、尼羅羅非魚(yú) (Oreochromis niloticus)[33]及凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei)[26]等水產(chǎn)動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)。但研究發(fā)現(xiàn)不同物種中重要的游離氨基酸種類并不一樣[32], 因此可以將氨基酸的定性及定量作為今后研究的重要內(nèi)容之一, 將氨基酸代謝相關(guān)的潛在標(biāo)志基因與氨基酸含量相聯(lián)系, 進(jìn)一步了解鹽度脅迫下大海馬幼體滲透調(diào)解過(guò)程中氨基酸代謝的機(jī)制。

表6 LS-test vs. CK差異基因富集的前20個(gè)KEGG代謝通路Tab. 6 Top 20 KEGG metabolic pathways enriched for LS-test vs. CK differential genes

3.3 鹽度對(duì)大海馬幼體滲透調(diào)節(jié)的影響

肝臟是魚(yú)類代謝的主要器官, 同時(shí)可以為滲透調(diào)節(jié)作用提供能量[34]。關(guān)于滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中能量代謝的研究主要集中在魚(yú)類的生理生化反應(yīng)、氧氣消耗和氨排泄等方面, 而在分子水平上的研究較少。水產(chǎn)動(dòng)物的能量代謝途徑在響應(yīng)鹽度應(yīng)激時(shí)起關(guān)鍵作用[35], 有研究發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下斑點(diǎn)鱸(Lateolabrax maculatus)肝臟中能量代謝相關(guān)的許多基因顯著上調(diào)[25]。而本研究在低鹽脅迫下大部分能量代謝的關(guān)鍵基因 (如Vlcad、Pdha1、Mdh1、Idh3b和G6pd等)顯著上調(diào), 說(shuō)明大海馬幼體肝臟在低鹽脅迫時(shí)的能量代謝過(guò)程可能承擔(dān)了重要的角色。推測(cè)大量能量用于合成關(guān)鍵蛋白、離子調(diào)節(jié)和滲透調(diào)節(jié)等過(guò)程, 以維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和滲透平衡[36]。

3.4 鹽度對(duì)大海馬幼體脂肪酸代謝的影響

水產(chǎn)動(dòng)物的脂肪酸代謝在鹽度脅迫下也承擔(dān)了多種功能, 一種是提供能量維持離子轉(zhuǎn)運(yùn)并調(diào)節(jié)滲透壓, 另一種是調(diào)整細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)[26]。在本研究中高鹽脅迫下大海馬幼體肝臟中富集了多個(gè)脂肪酸合成和降解途徑 (如不飽和脂肪酸的生物合成、類固醇生物合成、類固醇激素生物合成、脂肪酸代謝、脂肪酸降解和甘油磷脂代謝等), 且通路中的大部分基因顯著下調(diào), 如Fadsd6、Cyp51、Sqle、Fabp和Slc27a6等脂肪代謝基因在高鹽脅迫下均顯著下調(diào), 由此推測(cè)大海馬幼體體內(nèi)可能有足夠的能量用于抵抗高鹽脅迫。