姚朝瑞 馬 聘 李大鵬 李 莉 湯 蓉

(華中農業(yè)大學水產學院, 池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室, 武漢 430070)

硒(Selenium, Se)是動物的必需微量元素之一。自1957年Schwar等[1]研究發(fā)現硒是阻止大鼠(Raltus norvegicus)食餌性肝壞死的第三因子的主要組分, 首次證實動物需要硒元素。目前研究已顯示硒元素的重要生物功能包括抗氧化、抗應激、加強機體免疫力和抗腫瘤等[2,3]。Ferbal等[4]發(fā)現在鯉(Cyprinus carpio)飼料中添加適量硒元素, 能有效抵抗鉛導致的肝臟和腦部的氧化損傷。Talise等[5]發(fā)現, 在飼料中添加亞硒酸鈉能有效預防百草枯對斑馬魚(Danio rerio)的氧化損傷。Saffari等[6]證實在鯉幼魚飼料中補充納米硒能顯著提升鯉生長性能和飼料利用率。而硒缺乏會損傷幼齡草魚的免疫器官和免疫功能[7]。由于飼料中硒的利用率偏低及各種應激因子的不利影響, 養(yǎng)殖魚類對硒元素的需求可能會不斷提高[8]。

亞硝酸鹽是生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的一個天然組成部分, 養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽濃度偏高也是水產養(yǎng)殖過程中一個不容忽視的問題[9]。近年來高密度的集約化養(yǎng)殖方式造成的高蛋白殘餌和高含氮排泄物不斷沉積于池底, 造成水體內源性來源的亞硝酸鹽含量不斷增高[10]。淡水魚類對亞硝酸鹽的吸收主要是通過與CⅠ-有效地競爭鰓上氯化物的主動吸收機制[11—13]。高濃度或長時間的亞硝酸鹽暴露會致使魚體應激增強, 組織缺氧, 體內氧自由基積累, 抑制抗氧化系統(tǒng), 直接或間接的影響魚類的免疫活力[14—16], 嚴重時會引發(fā)生物的暴發(fā)性死亡, 如何提高養(yǎng)殖魚類對亞硝酸鹽暴露的抵抗能力成為近些年來的研究熱點。

Keap1-Nrf2介導的信號通路具有抗氧化應激和維持氧化還原平衡的功能, 能夠誘導其下游的抗氧化相關基因(如GPX、SOD和CAT等)表達, 提高機體抗氧化能力[17,18], Fontagne′-Dicharry等[19]發(fā)現膳食硒能通過上調Nrf2通路, 提高GPX和CAT等抗氧化酶活性, 來提高虹鱒育苗的抗氧化能力,Noha等[20]在大鼠中也有發(fā)現硒能通過上調Nrf2通路來抵抗肝臟砷中毒現象。

草魚(Ctenopharyngodon idella)屬于鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬, 生長速度快, 單位面積產出高, 而且肉質嫩白, 含豐富的營養(yǎng)成分, 具有可觀的經濟效益和營養(yǎng)價值。研究發(fā)現, 給草魚適當補充硒元素能有效提高肝臟抗氧化性, 維持組織結構完整[21]。肝臟是魚體重要的代謝和解毒器官, 本研究以草魚肝細胞為研究對象, 觀察和檢測硒孵育后肝細胞在不同濃度的亞硝酸鈉暴露后, 其氧化應激及細胞凋亡的狀況, 以探究硒對亞硝酸鈉導致的草魚肝細胞損傷的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚肝細胞系(L8824)購自中國典型培養(yǎng)物典藏中心; M199培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素雙抗(Penicillin Streptomycin, PS)均購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)購自四季青公司; 磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered solution, PBS)購自HyClone公司; 細胞增殖-毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8)購自同仁化學科技有限公司; 總蛋白定量(BCA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒均購自南京建成試劑公司; Annexin V-FITC /PI凋亡試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司; 熒光定量試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司; 亞硝酸鈉(NaNO2)為分析純, 購自國藥集團; 亞硒酸鈉(Na2SeO3)為分析純, 購自天津市化學試劑研究所。

1.2 草魚肝細胞L8824的培養(yǎng)

L8824細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、鏈霉素(100 μg/mL)和青霉素(100 IU/mL)的M199培養(yǎng)基中, 在28℃和5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。根據細胞生長狀況, 2—3d傳代1次, 傳代時用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化, 取生長狀態(tài)良好處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 細胞活性檢測

采用CCK-8法檢測細胞活性, 取生長良好處于對數生長期的L8824細胞(6—8×105個/mL)接種于96孔板中, 保證每孔數量不低于1000個, 每孔100 μL,培養(yǎng)12h, 待細胞在孔底鋪至70%—80%, 分別加入不同濃度的亞硒酸鈉和亞硝酸鈉, 使亞硒酸鈉的終濃度為0、0.5、1、2、5、10、15、20、25和35 μmol/L,培養(yǎng)3h、6h、12h、24h、36h和48h, 亞硝酸鈉終濃度為0、1、2.5、7.5、10、15、20、25、30和50 mg/L,培養(yǎng)24h, 空白組為基礎培養(yǎng)基, 每組8個復孔, 每孔加入10 μL的CCK-8, 28℃孵育2h, 置于多功能酶標儀上, 檢測波長為450 nm的吸光值(Optical density,OD), 細胞存活率(%)=[實驗組-空白組]/[對照組-空白組] ×100。

將實驗分為4組, 對照組: 加入等量M199培養(yǎng)基; Se組: 10 μmol/L的Na2SeO3作用36h; NaNO2組:不同濃度的NaNO2暴露, 使NaNO2的終濃度為5、10和25 mg/L, 暴露24h; Se+NaNO2組: 先加入終濃度為10 μmol/L的Na2SeO3預處理12h, 再加入5、10和25 mg/L的NaNO2, 暴露24h。

1.4 細胞形態(tài)學觀察

取生長狀態(tài)良好且處于對數生長期的L8824接種于12孔板中, 經對照組、Se組、NaNO2組和Se+NaNO2組的藥物處理完畢后, 用PBS洗滌2次, 在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化, 用CCD系統(tǒng)拍照。

1.5 氧化應激指標檢測

取生長狀態(tài)良好且處于對數生長期的L8824接種于12孔板中, 經對照組、Se組、NaNO2組和Se+NaNO2組的藥物處理完畢后, 胰蛋白酶消化,1000 r/min離心6min得到細胞沉淀, 用PBS洗滌2次,PBS懸浮細胞, 分裝至1.5 mL離心管中, 在液氮和28℃水浴鍋中反復凍融3次, -20℃凍存。BCA法測定樣品蛋白濃度, 按照試劑盒說明書進行操作, 用酶標儀在562 nm處測定, 并計算樣品蛋白活性; 超氧化物歧化酶(SOD): 按照SOD試劑盒操作, 用酶標儀在550 nm處測定, 并計算SOD的活性; 過氧化氫酶(CAT): 按照CAT試劑盒操作, 用酶標儀在405 nm處測定, 并計算CAT的活性; GSH-PX 活性測定: 按照GSH-PX試劑盒操作, 用酶標儀在 412 nm 處測定, 并計算 GSH-PX 的活性。

1.6 細胞凋亡檢測

取生長狀態(tài)良好且處于對數生長期的L8824接種于12孔板中, 經對照組、Se組、NaNO2組和Se+NaNO2組的藥物處理完畢后, 不含EDTA的胰蛋白酶消化, 300×g, 4℃離心5min收集細胞, 用預冷的PBS洗滌細胞2次, 每次均需300×g, 4℃離心5min,收集1—5×105細胞。吸棄PBS, 加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞, 再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution, 輕輕混勻, 然后避光, 室溫反應10—15min, 最后加入400 μL 1×Binding Buffer, 混勻后放置于冰上, 樣品在1h內用流式細胞儀檢測。

1.7 基因表達檢測

取生長狀態(tài)良好且處于對數生長期的L8824接種于6孔板中, 經對照組、Se組、NaNO2組和Se+NaNO2組的藥物處理完畢后, 每孔加入1 mL Trizol, 用Trizol法抽提細胞RNA, 并用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計檢測其濃度和質量。用Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒進行反轉錄, 實際操作根據試劑盒進行。得到cDNA后, 再用Hifair?qPCR SYBR Green Master Mix (Low Rox Plus) 試劑盒進行實時熒光定量分析,β-actin作為內參基因, 設計各個基因的引物(表 1), 反應體系為: Master Mix 10 μL,上游引物0.4 μL, 下游引物0.4 μL, cDNA1.2 μL,ddH2O 8 μL, 反應條件為: 95℃ 5min, 95℃ 10s,55—60℃ 20s, 40個循環(huán), 72℃ 20s, 每個樣品3個重復。

表1 qPCR引物Tab. 1 Primers used for qPCR

1.8 統(tǒng)計分析

實驗結果用平均值±標準差(Mean±SD)表示,數據分析由SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析, 然后通過 Duncan氏法進行多重比較, 顯著性水平P＜0.05。

2 結果

2.1 亞硒酸鈉和亞硝酸鈉對L8824細胞活力的影響

結果顯示, 低濃度亞硒酸鈉處理后的細胞活力高于對照組, 較對照組有顯著性差異(P＜0.05), 活力呈先上升后下降趨勢, 在10 μmol/L 3—36h階段活力值最高(圖 1), 在實驗分組時, 選擇10 μmol/L,12h作為Se+NaNO2組的預處理條件。在亞硝酸鈉暴露后, 細胞活力隨著濃度的升高而降低(圖 2)。

圖1 不同濃度亞硒酸鈉孵育不同時間對L8824細胞活力的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of sodium selenite incubation at different times on the viability of L8824 cells

圖2 不同濃度亞硝酸鈉暴露24h對L8824細胞活力的影響Fig. 2 Effect of sodium nitrite exposure for 24h on the viability of L8824 cells

2.2 亞硒酸鈉對亞硝酸鈉暴露后的L8824細胞形態(tài)的影響

結果顯示, 對照組L8824細胞呈梭形, 正常貼壁生長, 細胞邊界清晰, 圓潤, 未出現細胞空泡; Se組細胞正常貼壁生長, 形態(tài)清晰, 較對照組無明顯差異; 在NaNO2組中, 5 mg/L組細胞貼壁能力開始變弱, 有小范圍細胞脫落現象, 脫落細胞周圍開始出現空泡; 10 mg/L組細胞脫落范圍變大, 漂浮細胞增多, 細胞空泡較明顯; 25 mg/L組細胞開始大面積脫落, 皺縮, 毒性作用明顯; Se+NaNO2(5、10 和25 mg/L)組細胞貼壁良好, 邊界清晰, 無皺縮現象, 有極少數空泡, 經硒孵育后, 在亞硝酸鈉暴露下細胞仍生長良好(圖 3)。

圖3 亞硒酸鈉和亞硝酸鈉暴露后L8824細胞形態(tài)觀察(10×)Fig. 3 Morphological observation of L8824 cells after exposure to sodium selenite and sodium nitrite

2.3 亞硒酸鈉對亞硝酸鈉誘導L8824細胞凋亡的影響

結果表明, 不同濃度的NaNO2對L8824細胞有不同程度的促凋亡作用, 隨著濃度的增高, 早期和晚期凋亡細胞逐步增多, 較對照組有顯著性差異(P＜0.05), 當NaNO2濃度在25 mg/L時, 細胞凋亡率可達18.69%, 在Se+NaNO2組中, 細胞凋亡水平顯著下降, 平均凋亡率為11.34%。結果顯示, 硒的預孵育能有效緩解亞硝酸鹽暴露導致的細胞凋亡(圖 4)。

圖4 亞硒酸鈉預孵育對亞硝酸鈉誘導L8824細胞凋亡的影響Fig. 4 Effects of sodium selenite and sodium nitrite on apoptosis of L8824 cells

2.4 亞硒酸鈉對亞硝酸鈉誘導L8824細胞氧化損傷的影響

結果表明, 在NaNO2濃度為5 mg/L時, SOD顯著上升, GPX顯著降低(P＜0.05), CAT無明顯變化,在NaNO2濃度為10和25 mg/L時, GPX、SOD和CAT的活性均逐漸降低(P＜0.05), 在NaNO2濃度為25 mg/L時, SOD和CAT持續(xù)降低(P＜0.05), GPX無明顯變化, 在亞硒酸鈉預孵育12h后, 各組細胞的GPX、SOD和CAT的活性基本能維持在正常水平,較對照組無顯著性差異。結果顯示, 硒的預孵育能提高細胞抗氧化能力, 抵抗NaNO2暴露帶來的氧化損傷(P＞0.05; 圖 5)。

圖5 亞硒酸鈉預孵育對亞硝酸鈉誘導L8824細胞氧化損傷的影響Fig. 5 Effect of sodium selenite on oxidative damage of L8824 cells induced by sodium nitrite

2.5 亞硒酸鈉對亞硝酸鈉暴露后的L8824細胞抗氧化及凋亡相關基因的影響

結果顯示, 與對照組細胞相比, Se組細胞中的chop、bax、bcl-2和keap1 mRNA表達量差異不顯著(P＞0.05),Nrf2、gpx、sod和catmRNA表達量顯著上升(P＜0.05), NaNO2組細胞中,chop和baxmRNA表達量顯著上升(P＜0.05), 當NaNO2濃度為5 mg/L時,sodmRNA表達量顯著上升(P＜0.05), 濃度為10和25 mg/L時,sod、gpx和catmRNA表達量顯著下降(P＜0.05), 在Se+NaNO2組中,chop、bax、gpx、sod和catmRNA表達量差異不顯著(P＞0.05),其中NaNO2濃度為5和10 mg/L時,bcl-2 mRNA表達量顯著上升(P＜0.05)。結果表明, 細胞抗氧化能力的增強可能是通過Nrf2-Keap1通路來實現的(圖 6)。

圖6 亞硒酸鈉預孵育對L8824細胞酶活及凋亡相關基因的影響Fig. 6 Effect of sodium selenite preconditioning on enzyme activity and expression of apoptosis-related genes in L8824 cells

3 討論

3.1 硒對草魚肝細胞抗氧化功能的影響

已有研究表明, 硒可通過增強機體的抗氧化功能, 清除過氧化物, 保護生物膜和生物大分子免受氧化損傷, 降低水產動物的發(fā)病率和死亡率[22—25]。在草魚日糧中添加0.6—1.2 mg/kg的硒(Na2SeO3)能增強草魚機體抗氧化功能[21], 在鯉和虹鱒幼魚日糧中分別添加0.7和0.5—1.7 mg/kg的硒元素, 也發(fā)現了同樣的現象[6,19], 與本實驗中硒元素濃度基本一致。在本實驗中, 10 μmol/L 亞硒酸鈉的預孵育能有效提高肝細胞S O D、C A T 和G P X 的活性(P＜0.05)。GPX的活性中心是硒半胱氨酸, 是衡量機體硒水平的一項重要生化指標[19], 硒孵育后能顯著提高GPX的活性, 表明10 μmol/L 的亞硒酸鈉作用12h后, 硒元素已進入胞內并發(fā)揮作用。

高濃度亞硝酸鹽暴露會使魚體內產生大量活性氧(ROS), 如超氧陰離子自由基(), 羥自由基(·OH)和 H2O2等[26,27], 還會抑制細胞清除活性氧的相關酶的活性, 魚體對不良環(huán)境的抵抗能力下降,免疫代謝功能失調, 免疫力下降, 則會誘發(fā)魚類發(fā)病[28,29]。在NaNO2暴露后, 肝細胞SOD活性呈先上升后下降的趨勢, 較對照組有顯著性差異(P＜0.05),CAT和GPX活性均有顯著性抑制(P＜0.05)。這可能是由于低濃度短時間的亞硝酸鹽暴露激活了細胞自身抗氧化系統(tǒng), SOD升高, 清除胞內自由基; 而高濃度亞硝酸鹽使細胞產生大量的超氧陰離子自由基(), 消耗大量SOD, 隨著亞硝酸鈉濃度逐漸升高, 細胞自身清除的平衡機制被打破, SOD受到抑制。同樣, SOD在歧化反應及與其他抗氧化酶反應后會產生較多的H2O2, 消耗大量CAT和GPX, 且過氧化氫酶系統(tǒng)可能會通過氧化來解NaNO2的毒性機制[30], 在一段時間后, CAT和GPX便開始下降。

而在硒預孵育12h后再用亞硝酸鈉暴露, 肝細胞GPX、SOD和CAT均能基本維持在正常水平(P＞0.05)?？赡苁羌毎浳A孵育后, 胞內抗氧化酶活性升高, 當亞硝酸鹽暴露產生大量自由基后, 這些抗氧化酶能及時有效的清除自由基, 使細胞維持正常的生理機制, 表明此時細胞抗氧化能力增強, 并能抵抗一定濃度亞硝酸鹽暴露導致的氧化損傷。

3.2 硒對抗氧化基因和Nrf2/Keap1通路基因表達的影響

Nrf2/Keap1介導的信號通路具有抗氧化應激和維持氧化還原平衡的功能, 非應激狀態(tài)時,Keap1在細胞質和Nrf2相結合, 促進Nrf2蛋白泛素化和蛋白酶體降解, 維持Nrf2在低水平狀態(tài), 應激狀態(tài)時,Nrf2的泛素化和蛋白酶體降解被阻斷,Nrf2轉移至細胞核內, 誘導細胞保護相關基因的表達[31,32]。本實驗結果顯示, 在補硒組中,keap1、sod、cat和gpxmRNA表達量顯著上升(P＜0.05), 在硒預孵育后, 再經亞硝酸鹽暴露, 細胞中gpx、sod和catmRNA表達量也能維持在正常水平, 較正常組無顯著性差異(P＞0.05)。Nrf2/Keap1通路能夠誘導與ROS清除相關的基因表達, 如SOD和CAT等, 減少細胞內ROS含量[33]。在雞的肝細胞中也發(fā)現硒能通過激活Nrf2/Keap1通路來抵抗重金屬鎘誘導的細胞凋亡[34]。在本實驗中細胞可能通過上調Nrf2/Keap1通路, 誘導gpx、sod和cat基因表達, 提高抗氧化酶活性, 來增強細胞抗氧化能力, 并能在一定程度上抵抗亞硝酸鹽暴露帶來的抗氧化酶活性降低, 維持細胞抗氧化系統(tǒng)平衡。

3.3 硒對草魚肝細胞凋亡的作用

細胞凋亡是指為了維持內環(huán)境的穩(wěn)定, 由凋亡相關基因調控的細胞自主和有序的死亡, 又稱程序性細胞死亡, 是細胞為了更好的適應環(huán)境而采取的一種主動的方式[35]。長時間或高濃度的亞硝酸鹽暴露能誘導細胞凋亡[36]。本實驗從細胞形態(tài)上看, 隨著亞硝酸鹽的濃度升高, 細胞貼壁能力下降, 成片脫落, 而硒預孵育12h后的細胞生長良好, 形態(tài)正常, 基本接近正常細胞組, 表明硒的預孵育有利于細胞在亞硝酸鹽的暴露中維持正常生長形態(tài), 維持貼壁能力。在FITC和PI雙熒光染色后, 觀察細胞凋亡特點,由亞硝酸鹽引起的細胞凋亡具有濃度依賴性, 且主要變化集中在凋亡晚期, 較正常組及補硒組凋亡細胞顯著增加(P＜0.05), 相反的是, 硒的預孵育能顯著降低L8824的凋亡率, 并使其恢復至正常水平。

硒能有效降低細胞中bax/bcl-2比值[37], 而長時間高濃度亞硝酸鹽的暴露會誘導細胞凋亡[38], 在基因表達的結果中, 亞硝酸鹽暴露能上調L8824細胞中chop和bax的表達,bax/bcl-2比值顯著上升(P＜0.05), 而在硒預孵育12h后的細胞中,bcl-2上調,bax/bcl-2比值顯著下降(P＜0.05), 但在25 mg/L時,bcl-2下降到無顯著性差異(P＞0.05), 在亞硝酸鹽5 mg/L組下調了chop和bax的表達。從流式和凋亡基因結果分析, 隨著亞硝酸鹽暴露濃度升高, 硒的保護作用可能會逐漸失效。亞硝酸鹽能啟動凋亡信號通路, 引發(fā)了L8824的凋亡, 而亞硒酸鈉的預孵育能上調抗凋亡基因表達, 維持促凋亡基因表達在正常水平, 能有效緩解亞硝酸鹽帶來的細胞損傷和凋亡。

綜上所述, 給草魚肝細胞適當補充硒元素能在一定程度和范圍內有效緩解亞硝酸鹽暴露帶來的抗氧化系統(tǒng)失衡, 其中Keap1-Nrf2介導的信號通路可能發(fā)揮了重要作用, 同時可以降低細胞凋亡率,維持細胞正常生長, 但隨著亞硝酸鹽濃度的增高,硒的保護作用可能會逐漸失效。