葉 歡 武夢斌 危起偉 岳華梅 阮 瑞 杜 浩 冷小茜 李創(chuàng)舉

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430223)

魚類有30000余種, 其卵母細(xì)胞發(fā)育方式和產(chǎn)卵策略不盡相同, 但大多數(shù)魚類卵子發(fā)生具有一些共同的特征[1]。光學(xué)和電子顯微鏡的研究結(jié)果表明: 魚類卵巢腔中初級卵母細(xì)胞發(fā)育為成熟的卵子, 其形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化, 主要包括以下幾個(gè)階段: 小生長期、皮層小泡期、卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生后期和成熟期[2]。在卵黃生成期, 卵母細(xì)胞需要積累其成熟所必需的多種蛋白質(zhì)、脂類和RNA等物質(zhì)[1]。然而, 目前有關(guān)魚類卵子和卵黃發(fā)生相關(guān)基因的研究不多, 常見的有bmp15[3]、gdf9[4,5]、figla[6,7]、foxl2[8—10]和vtg[11]等; 尤其是卵巢特異表達(dá)的基因幾乎沒有報(bào)道, 僅見斑馬魚zorg基因[12]和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的fbxoo基因[13]的相關(guān)研究, 它們特異地表達(dá)于卵母細(xì)胞, 且大量存在于卵黃發(fā)生前期的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì), 推測其可能在卵子發(fā)生過程中起著重要作用。

長江鱘(Acipenser dabryanus)又名達(dá)氏鱘、沙臘子, 隸屬硬骨魚綱、軟骨硬鱗總目、鱘形目、鱘科、鱘屬魚類, 是我國長江流域特有的三種鱘魚之一。20世紀(jì)80年代后, 由于水利工程建設(shè)導(dǎo)致的棲息地退化、過度捕撈及環(huán)境污染等因素, 長江鱘自然種群嚴(yán)重衰退, 其自然繁殖活動(dòng)在2000年前后停止, 野外種群幾乎滅絕[14], 2010年被國際自然保護(hù)聯(lián)盟列為極度瀕危(CR)物種, 現(xiàn)為國家一級重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。近30年來, 科研工作者圍繞長江鱘的物種保護(hù)開展了全人工繁殖[15,16]、資源修復(fù)[17]、營養(yǎng)[18,19]和疾病[20,21]等方面開展了諸多研究。長江鱘性成熟周期長, 雌性初次性成熟為6—8齡, 雄性為3—5齡[22]。前期我們嘗試通過在飼料中添加外源的生長激素及促性腺激素投喂不同年齡段的幼魚[23]和注射Kisspeptin多肽等手段來研究長江鱘生長生殖的調(diào)控機(jī)制[24], 以期縮短其性成熟時(shí)間。然而,它們對長江鱘卵巢發(fā)育的促進(jìn)作用并不明顯。因此, 有必要開展長江鱘卵子發(fā)生相關(guān)基因的研究,以期為長江鱘的生殖調(diào)控提供新思路。

通過分析長江鱘性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 我們鑒定了卵巢特異表達(dá)基因zorg的同源基因。基于此, 本研究從長江鱘卵巢中克隆得到了Adorg的cDNA序列, 并進(jìn)行了序列特征分析, 研究了AdorgmRNA在長江鱘不同組織和不同發(fā)育時(shí)期胚胎的表達(dá)特征, 進(jìn)一步分析了卵子發(fā)生過程中Adorg表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律和性腺中的細(xì)胞定位。研究結(jié)果為探討Adorg基因?qū)﹂L江鱘卵子發(fā)生的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ), 對深入了解鱘卵子發(fā)生過程及其生殖調(diào)控積累資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

長江鱘來自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所太湖試驗(yàn)場(荊州)。取2.5齡長江鱘不同組織,包括肝、腸、脾、腎、心、卵巢、精巢、肌肉、鰓、垂體和下丘腦。在長江鱘子二代全人工繁殖期間, 取3組來自不同親本的胚胎, 包括2細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、心臟原基期、心跳期和出膜期; 同時(shí), 還采集了未受精卵樣品。另外, 采集不同發(fā)育時(shí)期性腺樣品, 包括未分化性腺[出膜后45d幼魚, 體長為(10.2±0.3) cm, 體重為(3.4±0.2) g]、Ⅰ期卵巢[1.5齡幼魚, 體長為(59.6±2.4) cm,體重為(1452.3±38.2) g]、Ⅱ期卵巢和精巢[2.5齡幼魚, 體長為(81.8±4.6) cm, 體重為(2521.6±96.5) g]、Ⅲ期卵巢[5齡成魚, 體長為(103.4±8.2) cm, 體重為(8321.7±486.2) g]和Ⅳ期卵巢[7齡成魚, 體長為(121.3±12.4) cm, 體重為(15050.1±1384.7) g], 其中Ⅲ期和Ⅳ期長江鱘卵巢為活體手術(shù)取樣所得。用于后續(xù)RNA提取和定量PCR分析的樣品置于RNA later (Biological Industries, 以色列)保存, 每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù); 同時(shí), 各發(fā)育時(shí)期性腺樣本置于波恩溶液固定, 用于組織切片。取2.5齡長江鱘精巢和卵巢用4%多聚甲醛固定, 用于原位雜交。本研究實(shí)驗(yàn)魚的使用得到了中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn), 采樣過程遵守了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和相關(guān)制度。

1.2 長江鱘Adorg 基因cDNA全長克隆

按照RNeasy Plus Mini Kit試劑盒(Qiagen)說明書步驟提取卵巢組織總RNA, 取1 μL RNA樣品分別用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)(Nano-Drop? Lite, Thermo)檢測其質(zhì)量和濃度。按照SMARTer?RACE 5′/3′Kit(TaKaRa)操作手冊的方法, 以長江鱘卵巢RNA為模板, 分別合成SMART 3′cDNA和5′ cDNA, 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

從長江鱘卵巢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋結(jié)果中獲得Adorg基因的部分序列, 用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)RACE引物(表 1), 進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增。以合成的卵巢SMART cDNA為模板, 使用引物Adorg-5gsp1和Adorg-3gsp1與引物UPM分別進(jìn)行5′和3′RACE的第一次PCR擴(kuò)增; 將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第二次PCR的模板, 相應(yīng)的引物為Adorg-5gsp2和Adorg-3gsp2與NUP。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物, 并回收目的產(chǎn)物, 連接到pMD19-T克隆載體, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α, 菌落PCR篩選陽性克隆并測序。根據(jù)3′和5′端序列所包含的重疊序列進(jìn)行拼接, 得到Adorg基因全長cDNA序列。

1.3 長江鱘Adorg 基因序列分析及特征

將已獲得的長江鱘AdorgcDNA全長序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源分析; 用ORF Finder進(jìn)行開放閱讀框查找, 并推導(dǎo)其相應(yīng)的氨基酸序列; 氨基酸序列同源性分析采用Clustal W軟件和BOXSHADE 3.21。

1.4 長江鱘Adorg 基因在不同組織及胚胎發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征

提取2.5齡長江鱘不同組織(肝、腸、脾、脾、腎、心、卵巢、精巢、肌肉、鰓、垂體和下丘腦)和各發(fā)育時(shí)期胚胎(未受精期、2細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、心臟原基期、心跳期和出膜期)總RNA, 然后利用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。根據(jù)Adorg基因序列設(shè)計(jì)定量PCR引物(Adorg-qF和Adorg-qR, 表 1), 將卵巢cDNA按照1﹕10的比例梯度稀釋, 以其為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物特異, 擴(kuò)增效率為97.32%, 相關(guān)系數(shù)為0.995, 說明該對引物滿足qPCR要求。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期對長江鱘最適內(nèi)參基因的分析[25], 選取延伸因子1α(EF-1α)作為內(nèi)參基因。用熒光定量儀QuantStudio6 Flex(Life Techonologies)進(jìn)行qPCR, 反應(yīng)體系為20.0 μL﹕cDNA模板1 μL, 2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL(ABI), 10 nmol/L正、反引物各0.4 μL, ddH2O 8.2 μL;反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性10min; 95℃變性15s, 58℃,15s, 72℃, 15s, 共40個(gè)循環(huán); 熔解曲線分析, 95℃變性15s, 從60℃開始, 以0.05℃/s的速度上升到95℃。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù), 采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers used in this study

1.5 長江鱘Adorg 基因在不同發(fā)育時(shí)期卵巢的表達(dá)特征

將波恩溶液固定的不同發(fā)育時(shí)期性腺的樣品經(jīng)酒精梯度脫水1h(70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精Ⅰ和100%酒精Ⅱ), 然后經(jīng)二甲苯透化(2次, 每次30min), 接著浸蠟(2次, 每次30min), 隨后包埋和切片, 厚度為5 μm。用蘇木精-伊紅染色, 封片膠Entellan?(Merck)封片, 最后在正置顯微鏡下拍照(DM5000B, Leica)。卵巢經(jīng)確定發(fā)育時(shí)期后, 提取相應(yīng)的RNA, 然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件和程序開展Adorg基因在不同發(fā)育時(shí)期卵巢的表達(dá)量分析, 內(nèi)參基因?yàn)镽PL8。

1.6 原位雜交

設(shè)計(jì)引物(表 1)從卵巢cDNA中擴(kuò)增Adorg基因片段, 瓊脂糖電泳膠回收, 克隆并連接到PGEM-T Easy載體(Promega), 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài), 挑選陽性克隆并測序。選擇正確插入方向的單克隆, 提取質(zhì)粒PGEM-Adorg。采用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ線性化PGEM-Adorg質(zhì)粒, 酶切完全后純化得到相應(yīng)DNA, 測定濃度后用T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶合成Adorg反義和正義的地高辛探針。將經(jīng)4% PFA固定過夜的2.5齡長江鱘卵巢和精巢用30%蔗糖通透, OTC(SAKURA)包埋后冰凍切片, 切片的厚度為7 μm。利用合成的地高辛反義和正義RNA探針進(jìn)行切片原位雜交[26]。在染色達(dá)到合適的效果后, 終止染色反應(yīng), 封片并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示, 利用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA), 采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)分析組間的差異顯著性, 顯著水平定為P＜0.05。使用Origin 2019軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 長江鱘Adorg基因序列特征分析

通過RACE-PCR得到了Adorg基因的全長cDNA序列, 為1031 bp(不包括Poly A), 開放閱讀框?yàn)?02 bp, 編碼233個(gè)氨基酸, 5′非編碼區(qū)長24 bp,3′非編碼區(qū)長305 bp。該序列在GenBank中的登錄號為MT424753。通過PROSITE和BLAST比對, 發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有已知的結(jié)構(gòu)域, 僅在斑馬魚(NP_001093540)、大西洋鮭(Salmo salar, ADJ38821)和鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus, XP_03347 8614)中有同源基因的注釋結(jié)果, 為卵子發(fā)生相關(guān)的基因。多重比對結(jié)果表明, 長江鱘Org與斑馬魚、大西洋鮭和鞍帶石斑魚該蛋白序列的一致性分別為49.5%、45.9%和43.5%(圖 1)。

圖1 長江鱘AdOrg與其他魚類Org蛋白序列比對Fig. 1 Protein sequence alignment of Yangtze sturgeon AdOrg with that of other fish homologues

2.2 長江鱘Adorg基因在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期胚胎的表達(dá)特征

利用熒光定量PCR方法檢測了長江鱘成魚不同組織和不同發(fā)育時(shí)期胚胎中AdorgmRNA表達(dá)水平, 結(jié)果顯示:Adorg僅在精巢和卵巢中表達(dá), 且其在卵巢的表達(dá)量遠(yuǎn)高于精巢(圖 2,P＜0.05)。進(jìn)一步通過石蠟切片, 發(fā)現(xiàn)該時(shí)期卵巢組織處于卵母細(xì)胞初級生長期, 可觀察到少量卵原細(xì)胞和大量初級卵母細(xì)胞, 卵徑約為150 μm(圖 3C); 而精巢已形成了精小葉, 主要由A型精原細(xì)胞, B型精原細(xì)胞和初級精母細(xì)胞組成(圖 3F)。在不同發(fā)育時(shí)期胚胎中,發(fā)現(xiàn)Adorg為母源表達(dá), 在原腸胚之前均具有較高的表達(dá)水平; 之后,AdorgmRNA的表達(dá)量顯著減少(圖 4,P＜0.05)。以上結(jié)果表明, 長江鱘Adorg不僅是一個(gè)母源基因, 還是卵巢高表達(dá)基因。

圖2 長江鱘Adorg基因在成魚不同組織的表達(dá)水平Fig. 2 The expression of Adorg gene in different adult tissues of Yangtze sturgeon

圖3 長江鱘不同發(fā)育時(shí)期性腺的組織學(xué)特征Fig. 3 Histological characteristics of different stages of Yangtze sturgeon gonads

圖4 長江鱘Adorg基因在未受精卵和不同發(fā)育時(shí)期胚胎的表達(dá)量Fig. 4 Expression levels of Adorg in unfertilized eggs and different development stages of Yangtze sturgeon embryos

2.3 長江鱘Adorg基因在不同發(fā)育時(shí)期卵巢的表達(dá)特征

為了揭示Adorg基因在卵子發(fā)生過程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化, 進(jìn)一步研究其在不同發(fā)育時(shí)期卵巢的表達(dá)特征。首先通過石蠟切片確定性腺或卵巢的發(fā)育時(shí)期, 結(jié)果表明: 出膜后45d, 長江鱘的性腺還未分化, 沒有出現(xiàn)典型雌性或雄性生殖表皮特征[27](圖 3A); 1.5齡長江鱘卵巢(圖 3B), 卵原細(xì)胞快速進(jìn)行有絲分裂, 大量增殖, 且少部分卵原細(xì)胞進(jìn)入減少分裂, 形成了初級卵母細(xì)胞(Ⅰ期); 2.5齡長江鱘卵巢(圖 3C), 主要由初級卵母細(xì)胞組成(Ⅱ期); 5齡長江鱘卵巢(圖 3D), 初級卵母細(xì)胞處于卵黃積累期(Ⅲ期), 卵徑達(dá)到約1.5 mm; 7齡長江鱘卵巢(圖 3E),初級卵母細(xì)胞進(jìn)一步生長(Ⅳ期), 卵徑接近2.0 mm。隨后, 定量PCR檢測結(jié)果表明:Adorg基因在未分化性腺中的表達(dá)量極低, 隨著卵母細(xì)胞的發(fā)育, 其mRNA表達(dá)水平急劇上升(圖 5,P＜0.05), 且維持在非常高的水平, 在Ⅱ期卵巢中的表達(dá)量最高(圖 5)。

圖5 長江鱘Adorg基因在卵子發(fā)生過程中的表達(dá)量變化Fig. 5 Expression variation of Adorg gene during oogenesis

2.4 長江鱘Adorg mRNA在性腺中的細(xì)胞定位

為了進(jìn)一步了解Adorg基因在性腺中的表達(dá)特征, 利用原位雜交分技術(shù)分析其在2.5齡卵巢和精巢組織中細(xì)胞的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:AdorgmRNA僅在生殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá), 而在體細(xì)胞中沒有表達(dá)。在卵巢中,AdorgmRNA在卵原細(xì)胞中微弱表達(dá), 隨著卵母細(xì)胞的生長, 其表達(dá)量增加(圖 6A)。該結(jié)果同qPCR結(jié)果相一致。在精巢中發(fā)現(xiàn)Adorg在A型和B型精原細(xì)胞中表達(dá), 而在初級和次級精母細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)陽性信號(圖 6B)。此外, 正義探針未發(fā)現(xiàn)信號(圖 6C和6D)。

圖6 Adorg基因在長江鱘卵巢和精巢的細(xì)胞定位Fig. 6 Cellular localization of Adorg gene in the ovary and testis of Yangtze sturgeon

3 討論

在本研究中, 我們從長江鱘卵巢組織克隆得到了Adorg基因全長cDNA序列, 編碼233個(gè)氨基酸; 通過與NCBI數(shù)據(jù)庫比對, 發(fā)現(xiàn)與已注釋的魚類卵子發(fā)生相關(guān)基因org的同源性不到50.0%。由于只有幾種魚類注釋了該基因, 導(dǎo)致無法進(jìn)一步分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。但是, 之前我們對中華鱘生殖細(xì)胞標(biāo)記基因boule和dead end的研究發(fā)現(xiàn)[26,28], 其氨基酸序列與其他魚類相應(yīng)的一致性也只有40%左右, 因此, 我們認(rèn)為長江鱘Adorg基因?yàn)槁炎影l(fā)生相關(guān)基因org的同源基因, 其與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,有待更多物種的該基因被鑒定后再進(jìn)行分析。

斑馬魚的相關(guān)研究表明,zorgmRNA為卵巢特異表達(dá)[12]。本研究通過定量PCR檢測發(fā)現(xiàn), 雖然長江鱘Adorg基因在卵巢大量表達(dá), 但在精巢也存在少量表達(dá)。這可能是由于定量PCR比RT-PCR更靈敏造成的, 但也有待在其他魚類中研究該基因的表達(dá)特征來進(jìn)行印證。在胚胎發(fā)育時(shí)期, 與斑馬魚zorg表達(dá)模式相似, 長江鱘Adorg也是母源表達(dá), 并在胚胎發(fā)育早期高表達(dá)。進(jìn)一步通過胚胎原位雜交發(fā)現(xiàn),斑馬魚zorg在原始生殖細(xì)胞也有表達(dá), 暗示著該基因可能也與早期生殖細(xì)胞的形成相關(guān)[12]。另外, 我們也研究了Adorg在卵子發(fā)生過程中的表達(dá)模式, 發(fā)現(xiàn)除了未分化性腺之外,AdorgmRNA在其他發(fā)育時(shí)期的卵巢都維持著非常高的表達(dá)量。斑馬魚中也有與之相似的結(jié)果, 該結(jié)果表明,Adorg基因在長江鱘卵子發(fā)生過程中可能起著非常重要的作用。

根據(jù)卵母細(xì)胞的生長發(fā)育特征, 鱘魚卵子生成的過程被劃分為7個(gè)發(fā)育期[29]。本研究在此基礎(chǔ)上,分析了長江鱘Adorg基因在Ⅱ期卵巢的表達(dá)及分布特征。通過原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AdorgmRNA在初級卵母細(xì)胞有很強(qiáng)的信號且均勻分布在其細(xì)胞質(zhì);隨著卵母細(xì)胞的生長發(fā)育,Adorg信號也逐漸增強(qiáng),而濾泡細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)信號。AdorgmRNA在初級卵母細(xì)胞的高表達(dá), 可能與原始卵泡中卵黃還未沉積, 而mRNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的積累相對較多相關(guān)[1]。同樣, 在斑馬魚中,zorgmRNA早期初級卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá); 但是, 隨著初級卵母細(xì)胞進(jìn)入次級生長(Ⅲ—Ⅳ期), 導(dǎo)致卵黃的沉積及周圍濾泡細(xì)胞層的發(fā)育完整,zorg表達(dá)于卵母細(xì)胞的皮層區(qū)域[12]。這與斑馬魚vasa基因在卵母細(xì)胞中的表達(dá)特征十分相似[30], 因此, 推測zorg在生殖細(xì)胞正常發(fā)育過程中起著重要作用。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展, 關(guān)于Adorg基因?qū)﹂L江鱘卵巢發(fā)育的調(diào)控作用, 可以借助模式動(dòng)物斑馬魚的功能研究來闡明。另外, 定量PCR及原位雜交結(jié)果均表明, 長江鱘Adorg基因除了在卵巢組織表達(dá)之外, 在精巢中也有低水平的表達(dá), 且分布于A型和B型精原細(xì)胞, 這一結(jié)果與斑馬魚的結(jié)果不相同?？傊? 本研究結(jié)果表明長江鱘Adorg基因不僅可能在卵子發(fā)生過程發(fā)揮重要作用, 而且對生殖細(xì)胞的發(fā)育和分化也可能起著作用, 有待通過基因敲降或敲除技術(shù)來進(jìn)一步闡明。