查荒源 于光晴 陳小云 肖武漢* 劉 興*

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072)

低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor, HIF)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控是細(xì)胞感受氧氣變化和應(yīng)答低氧脅迫的最為關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[1,2]。低氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常保守, 從線蟲到人類, 低氧信號(hào)都啟動(dòng)相同或相似的同源基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控, 從而調(diào)控類似的生理和生化反應(yīng)[3]。HIF由HIF-α(包括HIF-1α和HIF-2α)和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成, 每個(gè)亞單位都包含基本的bHLH-PAS (helix-loop-helix-PAS)結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)異源二聚體的形成及與DNA的結(jié)合。HIF-1β的蛋白水平穩(wěn)定, 因而HIF的活性主要由HIF-α來決定[4,5]。在常氧條件下, HIF-α能夠被一類依賴于氧氣的脯氨酸羥化酶(Prolyl hydroxylase domain enzymes, PHDs, 包括PHD1, PHD2 和PHD3)所識(shí)別, 進(jìn)而對(duì)HIF-α(包括HIF-1α和HIF-2α)上特定的脯氨酸殘基進(jìn)行羥基化修飾, 其中,PHD2是起主要作用的脯氨酸羥化酶[6]。被羥基化修飾的HIF-α能被pVHL(Von Hippel-Lindau)識(shí)別,pVHL能夠與ElonginB、ElonginC結(jié)合形成E3泛素連接酶復(fù)合體, 介導(dǎo)HIF-α通過蛋白酶體降解[7]。在低氧條件下, 由于氧氣的缺乏, 使得脯氨酸羥化酶的活性受到抑制, HIF-α的羥基化修飾受到抑制, 進(jìn)而導(dǎo)致HIF-α的蛋白酶體降解途徑受到抑制, 從而導(dǎo)致HIF-α的蛋白水平得以積累, 積累的HIF-α進(jìn)入細(xì)胞核, 與HIF-1β形成異源二聚體, 該二聚體與下游基因啟動(dòng)子上的低氧應(yīng)答元件(Hypoxia response element, HRE)結(jié)合, 從而激活下游基因的表達(dá), 發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[1,4]。

蛋白質(zhì)賴氨酸殘基上的甲基化修飾主要是由一類含有SET 保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)完成的, 目前在哺乳動(dòng)物中已鑒定到50多種蛋白質(zhì)可以歸入這一家族, 組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SET9就是該家族的成員[8,9]。SET9可以甲基化修飾組蛋白H3上第4位的賴氨酸殘基, 也可以對(duì)多種非組蛋白進(jìn)行甲基化修飾[10—12]。SET9可以甲基化修飾p53上第372位的賴氨酸殘基,從而激活p53的轉(zhuǎn)錄活性[13]。SET9可以甲基化RelA第37位的賴氨酸殘基, 在腫瘤壞死因子TNFα的刺激下增強(qiáng)RelA與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合[14]; SET9也可以甲基化RelA第314和315位的賴氨酸殘基, 從而促進(jìn)與下游基因啟動(dòng)子結(jié)合的RelA的降解, 抑制NF-κB信號(hào)通路的激活[15]。

前期的研究工作發(fā)現(xiàn)SET9可以甲基化HIF-1α上第32位的賴氨酸殘基, 抑制HIF-1α與下游基因啟動(dòng)子的結(jié)合, 從而抑制低氧信號(hào)通路下游基因的表達(dá)[16]。但是, SET9在體內(nèi)調(diào)控低氧信號(hào)通路和在低氧脅迫中的生物學(xué)功能及其機(jī)制還并不清楚。

研究基因在體生物學(xué)功能最好的手段是建立該基因敲除的動(dòng)物模型。斑馬魚(Danio rerio)是重要的模式生物, 建立目的基因敲除的斑馬魚品系有助于研究該基因的在體生物學(xué)功能。前期的研究工作以斑馬魚為模式生物, 建立了foxo3b、tet1及fih敲除的斑馬魚品系, 用以研究這些基因在低氧耐受中的生物學(xué)功能。foxo3b可以誘導(dǎo)vhl的表達(dá), 從而促進(jìn)hif-α的降解, foxo3b的敲除會(huì)導(dǎo)致斑馬魚低氧耐受能力的下降[17]; tet1可以穩(wěn)定hif-α的蛋白水平,tet1的敲除會(huì)降低斑馬魚的低氧耐受能力[18]; fih可以抑制hif-α的轉(zhuǎn)錄激活活性, fih的敲除可以增強(qiáng)斑馬魚的低氧耐受能力[19]。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù), 獲得了甲基轉(zhuǎn)移酶set9敲除的斑馬魚品系, 初步分析了set9基因的敲除對(duì)斑馬魚低氧耐受能力的影響, 為研究魚類甲基轉(zhuǎn)移酶set9在低氧耐受中的生物學(xué)功能及耐低氧魚類新品種的培育提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑 DNA膠回收試劑盒購自Bioflux公司, 質(zhì)粒小提試劑盒購自天根公司, 限制性內(nèi)切酶、RNAiso plus購自TaKaRa, All-in-One cDNA Synthesis SuperMix kit試劑盒、SYBR Green Fast quantitative PCR master mix試劑盒購自Biotool公司, T4 DNA連接酶、DNase Ⅰ購自Fermentas公司,T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Ambion公司, Agarose、2×Sosoo Mix重組酶購自Tsingke公司, DNA Marker、Trans10感受態(tài)細(xì)胞購自TransGen公司, 多聚甲醛、DEPC購自Amresco公司。

主要儀器 顯微注射儀PLI-100(Harvard Aparatus), 斑馬魚生化培養(yǎng)箱SHP-150(上海精宏),低氧工作站Invivo2(Ruskinn), 凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司), 離心機(jī)5702、5430、5425D、5415R(Eppendorf), 熒光定量PCR儀Step One Real-Time PCR System(ABI), 恒溫水浴鍋(上海精宏),Nanodrop 2000濃度定量儀(Thermo), -80℃超低溫冰箱(Thermo)。

1.2 斑馬魚品系

AB品系的斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心。

1.3 序列分析

使用ClustalX2軟件對(duì)人SET9、小鼠Set9和斑馬魚set9的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì), 并根據(jù)已知的人SET9的結(jié)構(gòu)域標(biāo)注3個(gè)物種的SET結(jié)構(gòu)域及其甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活性位點(diǎn)。

1.4 斑馬魚set9基因的敲除與鑒定

利用在線設(shè)計(jì)工具 (http://crispr.mit.edu) 設(shè)計(jì)Cas9作用的靶位點(diǎn); 將體外合成的Cas9 mRNA和gRNA(guide RNA)按照400 ng/μL﹕60 ng/μL混合后,注射到一細(xì)胞期胚胎動(dòng)物極; 24h后, 利用異雙鏈遷移率測定法(Heteroduplex mobility assay, HMA)篩選有敲除效果的F0代嵌合體; F0代性成熟后與AB品系斑馬魚交配, 篩選到能穩(wěn)定遺傳的F1代雜合子;F1代性成熟后自交可獲得對(duì)應(yīng)的野生型和純合子突變體, 利用PCR擴(kuò)增基因組中包含Cas9作用靶位點(diǎn)的DNA片段, 經(jīng)測序確定突變的堿基信息。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

取受精后3d的野生型及set9基因敲除的斑馬魚幼魚, 使用TaKaRa公司的RNAiso plus進(jìn)行RNA的提取, 使用Biotool公司的All-in-One cDNA Synthesis SuperMix kit試劑盒進(jìn)行cDNA的合成, 使用Biotool公司的SYBR Green Fast quantitative PCR master mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測, 使用5′-GCATGT GCTGGGTCTACTATC-3′和5′-GGCCATCAGGG TACACATAAG-3′擴(kuò)增set9的mRNA,β-actin作為內(nèi)參, 其擴(kuò)展引物為5′-TACAATGAGCTCCGTGTT GC-3′和5′-ACATACAATGGCAGGGGTGTT-3′。

1.6 斑馬魚低氧處理

使用Ruskinn Invivo2 I-400低氧工作站進(jìn)行斑馬魚的低氧脅迫處理。對(duì)于受精后3d的斑馬魚幼魚, 低氧脅迫時(shí)氧氣濃度調(diào)整到2%, 將出膜且發(fā)育程度一致的野生型及基因敲除的斑馬魚置于6 cm培養(yǎng)皿中, 每皿50條, 加入5 mL的胚胎培養(yǎng)液（Egg water）, 放置于低氧工作站中, 每12h統(tǒng)計(jì)1次魚的存活情況, 利用GraphPad 7.0繪制存活曲線; 對(duì)于3月齡的斑馬魚成魚, 低氧脅迫時(shí)氧氣濃度調(diào)整到5%, 將個(gè)體大小相近(個(gè)體重量±0.02 g)的野生型及基因敲除的斑馬魚放置于250 mL錐形瓶中, 加入200 mL的曝氣水, 放置于低氧工作站中, 并進(jìn)行跟蹤拍照, 記錄魚的運(yùn)動(dòng)及存活情況。

1.7 TUNEL染色

將個(gè)體大小相近(個(gè)體重量±0.02 g)的3月齡野生型及基因敲除的斑馬魚放置于低氧工作站, 并在低氧脅迫6h后將對(duì)應(yīng)的野生型及敲除品系的斑馬魚進(jìn)行腦部的取材和固定, 利用TUNEL染色試劑盒進(jìn)行染色并進(jìn)行拍照, 比較斑馬魚腦部細(xì)胞凋亡的情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有相關(guān)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。使用GraphPad 7.0軟件展示統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù), 結(jié)果表示為平均值±SEM。對(duì)于所有比對(duì),P＜0.05被視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚甲基轉(zhuǎn)移酶set9的序列特征

斑馬魚set9基因的全長CDS長度為1977 bp, 編碼373個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。利用ClustalX2軟件對(duì)人SET9、小鼠Set9和斑馬魚set9的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì), 發(fā)現(xiàn)序列的保守性很高。作為一個(gè)含SET結(jié)構(gòu)域的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶, 斑馬魚set9也含有一個(gè)保守的SET結(jié)構(gòu)域(圖 1中虛線框標(biāo)注)并且其發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶活性的酶活性位點(diǎn)在三個(gè)物種間都是保守的(圖 1中實(shí)線框標(biāo)注)。

圖1 人SET9、小鼠Set9、斑馬魚set9的氨基酸序列對(duì)比Fig. 1 Alignment of amino acid sequences of human SET9, mouse Set9 and zebrafish set9

2.2 建立set9基因敲除的斑馬魚品系

根據(jù)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的原理, 在斑馬魚set9基因的第一個(gè)外顯子上, 設(shè)計(jì)了基因編輯的靶位點(diǎn), 其序列為5′-GGACAGCGATGATGAC AACA-3′(圖 2A)。提取基因編輯品系魚尾基因組,使用引物5′-AGTGCAGGGCTGATGATG-3′和引物5′-CTAATCCTCGACGGAATGAGAC-3′擴(kuò)增包含靶位點(diǎn)的DNA片段, 經(jīng)異雙鏈遷移率測定法篩選獲得有效果的F0代(圖 2B)。

F0發(fā)育至性成熟后與AB品系交配, 篩選到能穩(wěn)定遺傳的F1代, 獲得一個(gè)缺失8個(gè)堿基的品系。由于在翻譯起始密碼子之后, 缺失8個(gè)堿基, 造成移碼突變, 終止密碼子提前出現(xiàn), 使得突變的品系只表達(dá)不包含SET結(jié)構(gòu)域的14個(gè)氨基酸的多肽(圖 2A)。由于翻譯的提前終止, 會(huì)導(dǎo)致mRNA的不穩(wěn)定性,進(jìn)而導(dǎo)致mRNA的快速降解, 因此, 進(jìn)一步利用qRT-PCR技術(shù)分析野生型和突變品系中set9的mRNA水平, 結(jié)果顯示突變品系中set9的mRNA水平顯著下降(圖 2C)。

圖2 利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚set9基因Fig. 2 Targeting strategy for generating zebrafish set9 mutant by CRISPR/Cas9

以上結(jié)果表明, 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù), 獲得了set9基因敲除的斑馬魚品系。在實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)條件下,set9基因敲除的斑馬魚與其同胞野生型相比, 發(fā)育、生長和繁殖等并無肉眼可見的差異。

2.3 set9的敲除能增強(qiáng)斑馬魚低氧耐受能力

利用獲得的set9基因敲除的斑馬魚品系, 分析set9基因在斑馬魚低氧耐受中的功能。首先, 選取出生后3d的斑馬魚幼魚進(jìn)行低氧處理。該時(shí)期的斑馬魚幼魚剛孵化出膜, 可以方便地獲取足夠數(shù)量的樣本, 且個(gè)體差異較小, 因而可以很好地評(píng)估斑馬魚低氧耐受能力的差異。將野生型及set9基因敲除的斑馬魚幼魚放置于氧氣含量為2%的低氧工作站中, 隨著時(shí)間的推移, 記錄斑馬魚幼魚的存活時(shí)間, 制作存活曲線。結(jié)果顯示, 在低氧脅迫處理24h后, 野生型的斑馬魚已經(jīng)開始死亡, 而set9基因敲除的斑馬魚在處理36h后才出現(xiàn)明顯的死亡; 在低氧脅迫處理60h后, 野生型的斑馬魚均已死亡, 而set9敲除的斑馬魚還有部分存活(圖 3)。由此可見,set9基因的敲除可以增強(qiáng)斑馬魚幼魚的低氧耐受能力。

圖3 set9基因的敲除能增強(qiáng)斑馬魚幼魚的低氧耐受能力Fig. 3 Deletion of set9 enhances hypoxia tolerance in zebrafish larvae

進(jìn)一步, 選取3月齡的斑馬魚成魚進(jìn)行低氧耐受能力的比較。將野生型及set9基因敲除的斑馬魚成魚放置于氧氣含量為5%的低氧工作站中, 錄制視頻記錄斑馬魚的存活及運(yùn)動(dòng)的情況。結(jié)果顯示,在低氧脅迫處理4h后, 野生型的斑馬魚即開始出現(xiàn)死亡; 在低氧脅迫處理8h后, 野生型的斑馬魚均已死亡, 而set9敲除的斑馬魚則剛開始有魚出現(xiàn)瀕死的跡象(圖 4)。以上結(jié)果顯示,set9基因的敲除可以增強(qiáng)斑馬魚成魚的低氧耐受能力。

圖4 set9基因的敲除能增強(qiáng)斑馬魚成魚的低氧耐受能力Fig. 4 Deletion of set9 enhances hypoxia tolerance in zebrafish larvae

2.4 set9的敲除減輕低氧導(dǎo)致的腦細(xì)胞凋亡

為闡明set9敲除的斑馬魚高低氧耐受力的機(jī)制, 利用TUNEL染色檢測低氧脅迫處理后野生型及set9敲除的斑馬魚腦中細(xì)胞凋亡的情況。5%O2處理6h后, 選擇存活的野生型及set9敲除的斑馬魚, 對(duì)其腦組織取材、固定、切片并進(jìn)行TUNEL染色。結(jié)果表明, 野生型斑馬魚腦中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯高于突變體(圖 5)。

圖5 set9基因的敲除能減少低氧脅迫下的斑馬魚腦部的細(xì)胞凋亡Fig. 5 Deletion of set9 diminishes hypoxia-induced apoptosis in adult zebrafish brains

3 討論

SET9是一種重要的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶, SET9最開始報(bào)道為通過甲基化組蛋白H3的第4位賴氨酸殘基來實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[11]。此外, 多種非組蛋白也被發(fā)現(xiàn)是SET9的底物, 包括p53、TAF10、E2F1、AR、RelA和FOXO3a等[12]。SET9通過調(diào)控這些非組蛋白的甲基化修飾參與了細(xì)胞對(duì)多種環(huán)境脅迫的響應(yīng): SET9對(duì)FOXO3a的甲基化修飾可以調(diào)控氧化損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡[20,21]; SET9通過甲基化修飾p53和E2F1等轉(zhuǎn)錄因子的活性來響應(yīng)DNA損傷等[13,22,23]。最近, 首次在細(xì)胞水平報(bào)道了SET9通過直接甲基化低氧信號(hào)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α第32位的賴氨酸殘基, 進(jìn)而調(diào)控HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性, 從而在低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞低氧脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[16]。然而, 對(duì)于SET9在體內(nèi)的生物學(xué)功能還并不清楚。

水體溶氧量隨季節(jié)、地理位置、水流狀態(tài)和水體環(huán)境等變化而發(fā)生很大的變化, 魚類在長期演化歷程中發(fā)展出適應(yīng)不同溶氧水環(huán)境的策略[3]。而另一方面, 隨著“工廠化”養(yǎng)殖等集約化養(yǎng)殖模式的發(fā)展, 單位水體養(yǎng)殖密度和產(chǎn)量的提高, 也迫切地要求養(yǎng)殖品種的耐低氧能力有相應(yīng)的提高。對(duì)于魚類低氧適應(yīng)機(jī)制的研究, 不僅對(duì)于認(rèn)識(shí)魚類物種的分化及低氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑的系統(tǒng)演化等方面具有十分重要的理論意義, 而且對(duì)于培育耐低氧魚類新品種具有十分重要的實(shí)踐意義。低氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常保守, 近年來的研究表明其在魚類低氧適應(yīng)及低氧耐受中具有重要功能[24—26]。鑒于低氧誘導(dǎo)因子及其調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)在低氧信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵作用, 挖掘低氧誘導(dǎo)因子的調(diào)控因子并解析其調(diào)控模式的分子機(jī)制是闡明魚類低氧耐受分子機(jī)制的主要手段, 可以為培育耐低氧魚類新品種提供候選靶標(biāo)。

在哺乳動(dòng)物中, SET9通過甲基化HIF-1α第32位的賴氨酸殘基, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)低氧信號(hào)通路的調(diào)控。SET9在不同物種間具有極高的保守性, 其發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶活性的SET結(jié)構(gòu)域和酶活性位點(diǎn), 在不同物種間都是非常保守的。然而, 斑馬魚中HIF-1α第32位的賴氨酸殘基并不保守, 并不具備SET9作用的經(jīng)典底物所具備的“R/K S K”3個(gè)氨基酸組成的基序[13,16]。因此, 斑馬魚set9調(diào)控低氧信號(hào)傳導(dǎo)途徑及影響魚類低氧耐受的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的探討, 很可能與哺乳類SET9調(diào)控低氧信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制有所不同。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù), 獲得了甲基轉(zhuǎn)移酶set9敲除的斑馬魚品系。斑馬魚set9基因的敲除可以增強(qiáng)斑馬魚的低氧耐受能力,減少低氧脅迫導(dǎo)致腦組織中的細(xì)胞凋亡水平, 且在正常飼養(yǎng)條件下, 其發(fā)育、生長和繁殖與野生型斑馬魚相比, 并無差異。本研究為深入了解甲基轉(zhuǎn)移酶set9的在體生物學(xué)功能及其機(jī)制提供了線索, 也為魚類耐低氧新品種的培育提供了候選的靶標(biāo)。