胡曉漢, 田素芬, 林 碩, 陳藝欣, 魏 輝, 顧曉軍,*, 黃勁飛,*

(1．福建農林大學植物保護學院, 福州 350002; 2. 福建省農業(yè)科學研究院, 福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室,福州 350013; 3. 福建省農業(yè)科學研究院, 農業(yè)農村部福州作物有害生物科學觀測試驗站, 福州 350013)

活化蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase 1, RACK1)是一種胞漿內游離的WD-重復蛋白(WD-repeat protein)，廣泛存在于各類原核生物和真核生物中(段紅英等, 2007; Adamsetal., 2011)。WD-重復蛋白通常由4～10個重復的WD基元組成，WD基元得名于其C端含有色氨酸-天冬氨酸(WD)保守序列(Huetal., 2017)。在生物體內，WD-重復蛋白具有組裝細胞骨架、轉運蛋白質、運輸囊泡、調控細胞周期等功能(Huetal., 2017)。

RACK1作為支架型蛋白，在生物體中參與了多種信號通路(代靜等, 2017)。在昆蟲中也是如此，如在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中，RACK1作為折疊蛋白參與了自噬體的形成(érdietal., 2012)，并在p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)/RACK1通路中調節(jié)蛋白質平衡從而影響細胞衰老和肌肉應激反應等(Belozerovetal., 2014)。近年來，RACK1在調控昆蟲生長發(fā)育方面的功能越來越受到關注。在果蠅(Kadrmasetal., 2007; Wangetal., 2012)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(侯元春等, 2012)、云杉卷葉蛾Choristoneurafumiferana(Quanetal., 2006)中均發(fā)現RACK1能夠響應蛻皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)的誘導，參與蛋白磷酸化并激活下游轉錄因子。此外，RACK1還能與家蠶Bombyxmori蛹期特異因子Broad Complex(Br)相互作用(王永虎, 2013; Chengetal., 2014)。

BroadComplex(Br)是全變態(tài)昆蟲蛹期蛻皮激素20E通路的初級響應基因，對成功化蛹具有關鍵作用(Chengetal., 2014)。小菜蛾Plutellaxylostella中發(fā)現了Br-Z2/3(PxyBr-Z2/3)和Br-Z7(PxyBr-Z7)兩種異構體，其中PxyBr-Z2/3是小菜蛾化蛹變態(tài)的主要調控基因(Huangetal., 2019; 胡曉漢等, 2021)。目前，RACK1在小菜蛾蛹期發(fā)育的功能及其對PxyBr-Z2/3的調控機制尚未見報道。本研究基于小菜蛾基因組信息(Youetal., 2013)，克隆并測序了小菜蛾RACK1基因PxyRACK1完整開放閱讀框，測定了PxyRACK1在不同發(fā)育階段的表達動態(tài)，構建了PxyRACK1的dsRNA原核表達體系，并利用顯微注射法探究了該基因的沉默對PxyBr-Z2/3基因表達及試蟲化蛹的影響，以期為完整理解昆蟲RACK1的功能及Br表達的影響因素提供資料，進而為新型昆蟲生長調節(jié)劑的開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蟲源為本實驗室長期室內飼養(yǎng)的小菜蛾敏感種群，具體飼養(yǎng)方法參考韓藝欣等(2019)：幼蟲寄主植物為蘿卜苗；幼蟲化蛹后，收集蛹置于養(yǎng)蟲籠中待羽化；成蟲羽化后以10%(w/v)蜜糖水補充營養(yǎng)；取鮮嫩蘿卜苗(6 cm長)榨汁后，均勻涂于鋁箔錫紙(10 cm×10 cm)(購自鄭州鴻富源工貿有限公司)供成蟲產卵。飼養(yǎng)溫度為25±1℃，相對濕度為70%±5%，光周期為14L∶10D。

1.2 小菜蛾RACK1基因全長克隆

參考天根生化科技(北京)有限公司總RNA提取試劑盒說明書提取供試小菜蛾的總RNA，參考Clontech公司SMART RACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書，合成5′RACE-ready和3′RACE-ready cDNA第1鏈。RACE擴增采用Nested-RACE方法，以5′/3′ RACE-ready cDNA為模板，由NCBI登錄的RACK1基因(GenBank登錄號: NP_001292436.1)設計特異引物，使用特異性引物和通用引物(UPM Mix和NUP)進行PCR擴增，引物序列見表1。反應體系(20 μL): cDNA(約1 000 ng/μL)1 μL, 正反向引物終濃度為10 μmol/L, dNTPs終濃度為0.25 μmol/L, Taq DNA Polymerase 2.5 U, 10×PCR Buffer(含2.5 mmol/L MgCl2) 2 μL。PCR反應條件: 94℃ 2 min; 98℃ 10 s, 60℃ 1 min, 68℃ 2 min, 35個循環(huán)；最后68℃ 10 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收并純化目的條帶，連接到pEAST-blunt質粒，轉化挑取陽性克隆，送樣上海生工進行測序。

1.3 生物信息學分析

測序后用DNAMAN軟件拼接核苷酸序列，獲得RACK1的基因序列全長，并上傳至NCBI的GenBank數據庫。登錄NCBI網站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)，采用Blast程序與GenBank公布的生物序列進行比較，并根據氨基酸序列分析其保守區(qū)域。同時，利用Lasergene軟件中的MegAlign程序以及MEGA 7.0軟件，與已知RACK1氨基酸序列進行Cluster W法比對，鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 小菜蛾RACK1基因表達動態(tài)測定

收集小菜蛾卵和1齡幼蟲各100 mg，2齡幼蟲20頭，3齡第1-2天幼蟲、4齡第1-4天幼蟲、預蛹、1-4日齡蛹和成蟲各5頭，每齡期樣品重復收集3次，分別提取總RNA。利用全式金生物技術有限公司的反轉錄試劑盒利用檢測合格的小菜蛾總RNA合成cDNA第1鏈。根據1.2節(jié)中克隆的序列分別設計特異性引物RACK1-QF/RACK1-QR(表1)，并選擇小菜蛾看家基因EF-1α為參照基因進行qPCR反應，內參基因定量引物參考符偉等(2012)(表1)。qPCR反應參考NovoStart? SYBR qPCR SuperMix Plus (近岸蛋白質科技有限公司)的說明書，反應體系(20 μL): cDNA(約1 000 ng/μL)1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各 0.4 μL, 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL, ddH2O 8.2 μL。反應程序: 95℃ 3 min; 95℃ 6 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)。每樣品重復測定3次，記錄相關數據。

1.5 dsRNA合成

根據1.2節(jié)中克隆的小菜蛾PxyRACK1基因序列(GenBank登錄號: MW160739)，并以pIZT/v5-his載體中GFP基因序列為陰性對照，利用Primer Premier 5.0軟件設計PxyRACK1 dsRNA擴增引物RACK1-dsRNA-F/RACK1-dsRNA-R(5′端加上SacⅠ和KpnⅠ酶切位點)和GFPdsRNA擴增引物GFP-dsRNA-F/GFP-dsRNA-R(5′端加上SacⅠ和SalⅠ酶切位點)(表1)，引物由福州尚亞生物技術有限公司合成。

分別以預蛹期小菜蛾cDNA和pIZT/v5-his質粒為模板，使用采購自南京諾唯贊公司的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase進行PCR反應?；靹蚋鹘M分并短暫離心后，進行PCR反應: 95℃ 3 min; 95℃ 15 s, 59℃ 15 s, 72 ℃ 30 s, 35個循環(huán)；72℃最后延伸5 min。利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]回收并純化PCR產物后，取4 μL連接pEASY-Blunt Cloning載體以構建pEASY-Blunt-PxyRACK1與pEASY-Blunt-GFP質粒。

使用內切酶SacⅠ和KpnⅠ雙酶切構建好的pEASY-Blunt-PxyRACK1質粒和L4440空載體(由福建農林大學應用生態(tài)研究所饋贈)及使用內切酶SacⅠ和SalⅠ雙酶切 pEASY-Blunt-GFP質粒及L4440空載體(酶切時間均為1 h)。酶切后將PxyRACK1和GFP片段分別與L4440載體片段用T4連接酶過夜連接。連接產物再轉化至大腸桿菌EscherichiacoliHT115感受態(tài)細胞誘導表達dsRNA，并將所表達的dsRNA純化，表達與純化方法參考王雪慶等(2018)。

1.6 RNA干擾實驗

挑取相同日齡、體型一致的4齡第2天小菜蛾幼蟲用于RNA干擾實驗，形態(tài)鑒定參考陳藝欣等(2011)。其中dsPxyRACK1處理組與dsGFP對照組各設置6個重復，每個重復10頭試蟲放入直徑15 cm玻璃培養(yǎng)皿中，注射劑量為100 nL(約1 000 ng/μL)。注射dsRNA 24 h 后，處理組與對照組各隨機選取5頭試蟲并重復3次，提取總RNA，反轉錄成cDNA；利用Primer Premier 5.0軟件設計引物Br-Z2/3-QF/Br-Z2/3-QR(表1)，以EF-1α為內參基因，利用qPCR檢測PxyRACK1和PxyBr-Z2/3的表達。qPCR反應體系參照1.4節(jié)。反應程序: 94℃ 2 min; 94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)。每樣品重復測定3次。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.7 RNAi的生物學效應觀測

RNAi后，處理組和陰性對照組各取3個重復用于小菜蛾生物學觀測，每8 h觀察記錄試蟲死亡數和化蛹數，計算死亡率、化蛹率和平均化蛹時間。 待小菜蛾化蛹后稱取蛹重。 死亡率=(死亡蟲數/總試蟲數)×100%；化蛹率=(化蛹數/總試蟲數)×100%。

1.8 數據分析

基因相對表達量的計算采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)。利用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0對基因表達動態(tài)進行單因素方差分析(ANOVA)，并用Tukey氏檢驗檢驗基因相對表達量差異顯著性。RNAi的生物學效應觀測實驗中，采用獨立樣本T檢驗檢測RNAi效果。差異顯著性水平均設定為P<0.05。

2 結果

2.1 PxyRACK1的克隆和序列

凝膠電泳檢測發(fā)現5′端片段條帶約為5 00 bp(圖1: A)，3′端片段條帶約為1 100 bp(圖1: B)，而中間片段PCR擴增獲得大小約為1 000 bp的單一條帶(圖1: C)。上述電泳條帶經回收純化并測序后，拼接得到1 148 bp基因片段。將測序的結果與已登錄的小菜蛾RACK1基因(GenBank登錄號: NP_001292436.1)比對，結果顯示克隆基因序列全長與目的基因序列一致性為98.40%，而其推導氨基酸序列一致性為100%，表明成功克隆小菜蛾PxyRACK1基因序列全長(GenBank登錄號: MW160739)，ORF長960 bp，5′端非編碼區(qū)長63 bp，3′端非編碼區(qū)長125 bp。編碼區(qū)共編碼319個氨基酸，預測蛋白大小為35.88 kD，等電點為7.677。預測的氨基酸序列中含有7個WD40重復序列，每個WD40重復序列含39～42個氨基酸(圖2)。

圖1 小菜蛾PxyRACK1的全長cDNA擴增Fig. 1 Full-length cDNA amplification of PxyRACK1 of Plutella xylostellaM: 2000 DNA分子標準量 2k Plus DNA Marker; A: PxyRACK1的5′端片段的擴增Amplification of the 5′end of PxyRACK1; B: PxyRACK1的3′端片段的擴增Amplification of the 3′end of PxyRACK1; C: PxyRACK1基因編碼區(qū)的擴增Amplification of the encoding region of PxyRACK1. 1: PxyRACK1的5′端片段的擴增產物Amplification product of the 5′end of PxyRACK1; 2: PxyRACK1的3′端片段的擴增產物Amplification product of the 3′end of PxyRACK1; 3: PxyRACK1基因編碼區(qū)的擴增產物Amplification product of the encoding region of PxyRACK1.

圖2 小菜蛾PxyRACK1的核苷酸序列和推導的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PxyRACK1 of Plutella xylostella圖中陰影標示GH-WD基元，下劃線部分為7個WD40重復序列。The conserved GH-WD residues are marked in shade. Underlined amino acids are seven WD40 repeats.

2.2 小菜蛾PxyRACK1的同源比對和系統(tǒng)進化分析

比較分析不同生物的RACK1氨基酸序列發(fā)現，小菜蛾PxyRACK1與其他物種的同源蛋白具有高度相似性，且所有物種的7個WD40重復序列的同源性均極高(圖3)。小菜蛾PxyRACK1氨基酸序列與同為鱗翅目昆蟲的甜菜夜蛾Spodopteraexigua、煙芽夜蛾Heliothisvirescens、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的RACK1序列一致性分別為98.70%, 98.10%和 98.10%，與同為昆蟲綱但不同目的德國小蠊Blattellagermanica和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的RACK1序列一致性較低，分別為92.70%和86.80%， 而與親緣關系較遠的智人Homosapiens的RACK1序列一致性也達到78.20%(數據未顯示)。基于氨基酸序列鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，結果表明，鱗翅目昆蟲的RACK1蛋白首先聚在一起，盡管RACK1蛋白在不同目昆蟲之間存在一定差異，但總體而言昆蟲RACK1蛋白進化較為保守。

圖3 小菜蛾與其他物種RACK1蛋白的WD40重復序列比對Fig. 3 Sequence alignment of WD40 repeats of RACK1 proteins from Plutella xylostella and other speciesRACK1蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species and GenBank accession numbers of RACK1 proteins: Bbe: 白樺尺蛾Biston betularia (ADO33039.1); Bge: 德國小蠊Blattella germanica (ABI63548.1); Bmo: 家蠶Bombyx mori (NP_001041703.1); Cfu: 云杉色卷蛾Choristoneura fumiferana (AAZ29605.1); Dme: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_001260218.1); Gga: 原雞Gallus gallus (NP_001004378.1); Har: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera (AEI84399.1); Hsa: 智人Homo sapiens (NP_006089.1); Mmy: 大鼠耳蝠Myotis myotis (KAF6349892.1); Obr: 冬尺蠖蛾Operophtera brumata (KOB78365.1); Ppo: 玉帶鳳蝶Papilio polytes (BAM18977.1); Pxu: 柑橘鳳蝶Papilio xuthus (BAM17717.1); Pja: 日本對蝦Penaeus japonicus (AHF21001.1); Pxy: 小菜蛾Plutella xylostella (NP_001292436.1); Rno: 褐家鼠Rattus norvegicus (NP_570090.2); Rph: 菲律賓簾蛤Ruditapes philippinarum (AWV55265.1); Sex: 甜菜夜蛾Spodoptera exigua (ABX55886.1); Hvi: 煙芽夜蛾Heliothis virescens (AAK51552.1); Vko: 科莫多巨蜥Varanus komodoensis (KAF7250119.1).

圖4 鄰接法構建的基于氨基酸序列的小菜蛾與其他物種的RACK1系統(tǒng)進化樹(1 000次重復)Fig. 4 Phylogenetic tree of RACK1 of Plutella xylostella and other species constructed with neighbor-joining methodbased on the amino acid sequence (1 000 replicates)

2.3 小菜蛾PxyRACK1的表達動態(tài)

qPCR結果表明，PxyRACK1在小菜蛾各個生長發(fā)育階段均可表達。以卵期表達量為參比，4齡第2天幼蟲中的相對表達量最高(相對表達量1.32)，2日齡蛹中的相對表達量最低(相對表達量0.87)，但二者也僅相差1.5倍左右(P<0.05)；而4齡第4天幼蟲(相對表達量0.96)、預蛹(相對表達量1.00)和4日齡蛹(相對表達量0.99)中的表達量則與卵期表達量相近(圖5)。

圖5 PxyRACK1在小菜蛾不同發(fā)育階段的表達譜Fig. 5 Expression profiles of PxyRACK1 at different developmental stages of Plutella xylostellaE: 卵Egg; L1-1: 1齡第1天幼蟲Day-1 1st instar larva; L2-1: 2齡第1天幼蟲 Day-1 2nd instar larva; L3-1-2: 分別為3齡第1-2天幼蟲 Day-1-2 3rd instar larvae, respectively; L4-1-4: 分別為4齡第1-4天幼蟲 Day-1-4 4th instar larvae, respectively; PP: 預蛹Prepupa; P-1-4: 分別為1-4日齡蛹1-4 d-old pupae, respectively; A: 成蟲Adult. 圖中數據為平均值±標準誤；柱上不同字母表示基因表達量在不同發(fā)育階段之間差異顯著(P<0.05, Tukey氏檢驗)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05, Tukey’s test).

2.4 RNAi后PxyRACK1的表達量變化

注射dsPxyRACK1 24 h后，小菜蛾4齡幼蟲中PxyRACK1表達量顯著下降了36.26%(P<0.05)(圖6: A),而PxyBr-Z2/3表達量下降了83.46%(P<0.05)(圖6: B)。

圖6 RNAi干擾PxyRACK1 24 h后小菜蛾4齡幼蟲中PxyRACK1(A)和PxyBr-Z2/3(B)的表達量Fig. 6 Expression levels of PxyRACK1 (A) and PxyBr-Z2/3 (B) in the 4th instar larvaeof Plutella xylostella at 24 h after RNAi of PxyRACK1圖中數據為平均值±標準誤；柱上星號表示處理組與對照組(dsGFP注射組)之間差異顯著(P<0.05, 獨立樣本T檢驗)。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the treatment group and the control group (dsGFP injected group) (P<0.05, independent samples T-test). 下同The same below.

PxyRACK1基因沉默后部分試蟲停止取食，處理48 h后蟲體逐漸變黑(圖7)，最終死亡。處理組化蛹高峰期推遲(圖8: A)，處理后64 h后處理組試蟲死亡率達到最高并穩(wěn)定為46.66%，而注射GFPdsRNA的對照組試蟲死亡率僅為6.67%(P<0.05) (圖8: B)。同時，64 h后對照組試蟲平均化蛹率為93.33%，而處理組僅為43.33%(P<0.05) (圖8: C)；對照組平均化蛹時間為40.36 h，處理組則延長至47.07 h(P<0.05)(圖8: D)；72 h后統(tǒng)計處理組和對照組平均蛹重，分別為4.727和5.327 mg(P<0.05)(圖8: E)。

圖7 分別注射dsGFP(A)和dsPxyRACK1(B)48 h后的小菜蛾4齡幼蟲Fig. 7 The 4th instar larvae of Plutella xylostellaat 48 h after injection of dsGFP (A) anddsPxyRACK1 (B), respectively

3 討論

RACK1結構的最大特點是含有7個由40個氨基酸殘基組成的WD40重復序列(WD1-WD7)基元，且多數基元的N端有一個甘基酸-組氨酸(GH)結構，而C端有一個色氨酸-天冬氨酸(WD)結構(段紅英等, 2007)。PxyRACK1的編碼區(qū)中也存在7個WD40重復序列，并且每個WD40重復序列均與其他物種的WD40重復序列高度相似(圖3)，證明了本研究所克隆的PxyRACK1編碼區(qū)的可靠性。重復的WD基元是RACK1與其他互作蛋白形成同源或異源二聚體的關鍵位點(Sklanetal., 2006)。RACK1正是通過其不同的 WD40位點與活化的蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)結合后將其轉運到細胞內相應位置，進而調控特定生理生化過程(McCahilletal., 2002)。由于RACK1參與多個基本生物過程，涉及細胞生長和蛋白合成等(Chang, 2002; Chenetal., 2006)，所以RACK1在小菜蛾生長、發(fā)育過程中呈“看家基因式”表達。各測定時間表達水平雖然存在一定差異，但是總體差異不大(圖5)。也正因為該蛋白在生物體內的重要性，其沉默后導致試蟲死亡率顯著升高(圖8: B)。

圖8 注射PxyRACK1 dsRNA對小菜蛾的化蛹動態(tài)(A)、死亡率(B)、平均化蛹率(C)、平均化蛹時間(D)以及平均蛹重(E)的影響Fig. 8 Effect of dsPxyRACK1 injection on the pupation dynamics (A), mortality (B), average pupation rate(C),average pupation time (D) and average pupal weight (E) of Plutella xylostella死亡率、化蛹時間和化蛹率均在顯微注射后64 h后測定，蛹重在顯微注射后72 h后測定。The mortality, pupation time and pupation rate were detected at 64 h after microinjection, and the pupal weight was measured at 72 h after microinjection.

在昆蟲中，保幼激素(juvenile hormone, JH)通路和20E通路聯合調控其生長發(fā)育進程(Dubrovsky, 2005)。以往研究證實RACK1和這兩個通路之間存在關聯性。因為20E能夠提高棉鈴蟲6齡幼蟲體內RACK1的表達，而保幼激素類似物烯蟲酯則能降低其表達(侯元春等, 2012)；利用RNAi技術和RACK1/PKC的專性抑制劑地喹碘銨(6CI,7CI)處理云杉卷葉蛾的CF-003細胞系均能抑制蛻皮激素通路轉錄因子CHR3的表達以及減少蛻皮激素受體(ecdysone receptor, EcR)在細胞核中的積累(Quanetal., 2006)。Br是全變態(tài)昆蟲蛹期20E通路的早期響應基因，研究也發(fā)現RACK1與Br存在相互作用。如在家蠶中不僅利用酵母雙雜交技術證實了相互作用的存在，而且還發(fā)現Br蛋白的磷酸化及其進入細胞核并發(fā)揮轉錄因子功能也都離不開RACK1的作用(王永虎, 2013; Chengetal., 2014)。在果蠅唾液腺中，RACK1沉默后，Br表達也降低(Wangetal., 2012)。類似地，本研究中也發(fā)現PxyRACK1基因沉默后，PxyBr-Z2/3基因表達水平顯著下降(圖6: B)。Br表達受阻后癥狀與過量JH影響相似(Spokony and Restifo, 2007; Duanetal., 2016)，表現為試蟲死亡率升高、化蛹推遲、化蛹率下降以及蛹重減輕(圖8)。

綜合國內外研究結果，除20E外，全變態(tài)昆蟲蛹期特異基因Br表達的影響因子至少包括JH、RACK1及全變態(tài)昆蟲卵和低齡幼蟲中的異時性通路(heterochronic pathway)關鍵基因hunchback和高齡幼蟲的CREB結合蛋白(CREB-binding protein, CBP)基因cbp(陳冀陽, 2020)。不過，有關各因素對Br表達的影響機制尚未完全明確。開展這方面研究能夠為提高基于Br表達調控改變害蟲生長發(fā)育進程達到控制害蟲的目的提供有益借鑒，并能豐富新型昆蟲生長調節(jié)劑的開發(fā)路徑。