王 京, 何秉青, 華登科, 張 坤, 袁江江, 鄭曉斌,徐寶云, 張友軍, 吳青君,*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所, 北京 100081; 2. 北京市昌平區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站, 北京 102200)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)與位于突觸后膜的受體結(jié)合，使突觸后神經(jīng)元處于保護(hù)性抑制狀態(tài)(Bown and Shelp, 1997; Ashbyetal., 2012)。昆蟲(chóng)的GABA受體(GABA receptors, GABAR)按其結(jié)構(gòu)特征和藥理學(xué)性質(zhì)可分為離子型受體(GABAAR)和代謝型受體(GABABR)兩類(lèi)。GABAAR是一個(gè)由5個(gè)亞基組成的寡聚體蛋白(Chebib and Johnston, 2000)，昆蟲(chóng)的GABAAR是環(huán)戊二烯類(lèi)、苯基吡唑類(lèi)以及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的分子靶標(biāo)(Buckinghametal., 2005; Rahmanetal., 2012; Nakaoetal., 2015)，目前已知有3類(lèi)亞基：抗狄氏劑亞基(resistance to dieldrin, RDL)(Ffrench-Constantetal., 1991)、配體門(mén)控氯離子通道同系物3(ligand-gated chloride channel homologue 3, LCCH3)(Hendersonetal., 1993)和果蠅的GABA和甘氨酸類(lèi)似受體(GABA and glycine-like receptor ofDrosophila, GRD)(Harveyetal., 1994)。RDL亞基最初得名于黑腹果蠅Drosophilamelanogaster，因其與環(huán)戊二烯類(lèi)殺蟲(chóng)劑狄氏劑抗性形成相關(guān)(Ffrench-Constantetal., 1991)，隨后發(fā)現(xiàn)該亞基也在昆蟲(chóng)對(duì)阿維菌素和氟蟲(chóng)腈抗性中起重要作用(Guillemaudetal., 2003; Weietal., 2015; Mengetal., 2019)。GABABR屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor)家族，該受體通過(guò)G蛋白介導(dǎo)連接第二信使，調(diào)節(jié)控制神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)含量，通過(guò)cAMP與細(xì)胞內(nèi)的K+和Ca2+通道相偶聯(lián)，進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Kuriyamaetal., 2000; Labouèbeetal., 2007)。

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis是一種重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)(Kirk and Terry, 2003)，目前，使用殺蟲(chóng)劑是防治西花薊馬的主要手段，但其不合理使用導(dǎo)致西花薊馬的抗藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重(Demirozeretal., 2012; Gaoetal., 2012; 萬(wàn)巖然等, 2016)。 據(jù)Arthropod Pesticide Resistance Database(Sanches and Wise, 2021)最新統(tǒng)計(jì)，西花薊馬已對(duì)包括多殺霉素類(lèi)藥劑在內(nèi)的至少7類(lèi)藥劑產(chǎn)生了抗性。多殺霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)生物源農(nóng)藥(Williamsetal., 2003)，主要作用于昆蟲(chóng)的煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)(Salgado, 1997)，GABAAR可能是其次要靶標(biāo)(Watson, 2001)。已有研究表明西花薊馬等多種昆蟲(chóng)對(duì)多殺霉素的高水平抗性與nAChR的α6亞基變異密切相關(guān)(Puineanetal., 2013; Silvaetal., 2016; Wanetal., 2018)，但作為靶標(biāo)之一的GABAAR是否在西花薊馬對(duì)多殺霉素抗性形成中起作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究基于本實(shí)驗(yàn)室西花薊馬的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)，首先對(duì)西花薊馬GABAAR和GABABR基因進(jìn)行了鑒定、克隆驗(yàn)證以及生物信息學(xué)分析；為探究GABAAR是否參與西花薊馬對(duì)多殺霉素的抗性，進(jìn)一步比較了西花薊馬多殺霉素敏感和抗性品系中GABAAR亞基基因FoRDL,FoLCCH3和FoGRD的序列和表達(dá)差異，利用RNAi結(jié)合生物測(cè)定，研究FoRDL在西花薊馬對(duì)多殺霉素抗性中的作用。研究結(jié)果將有助于了解西花薊馬GABAR家族基因，為GABAR基因功能研究提供參考，為闡明西花薊馬對(duì)多殺霉素的抗性機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

西花薊馬多殺霉素敏感品系(Ivf03)和抗性近等基因系品系(NIL-R)是通過(guò)多世代回交法建立(Yuanetal., 2017)。NIL-R對(duì)多殺霉素的抗性倍數(shù)為36 000倍(Yuanetal., 2017)。Ivf03使用新鮮四季豆Phaseolusvulgaris飼喂，不接觸任何殺蟲(chóng)劑。養(yǎng)蟲(chóng)室溫度為27±1℃，相對(duì)濕度為65%，光周期為16L∶8D(Zhangetal., 2007)。NIL-R用2.5%多殺霉素懸浮劑(SC)(spinosad, 美國(guó)陶氏益農(nóng)公司)處理的四季豆飼喂(侯文杰等, 2013)，飼養(yǎng)條件與敏感品系一致。

1.2 GABAR家族基因的鑒定

從黑腹果蠅基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和GenBank中下載黑腹果蠅和意大利蜜蜂Apismelliferaligustica的GABAR家族基因蛋白序列，并以其為參照，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室西花薊馬基因組進(jìn)行GABAR家族基因檢索。然后以本實(shí)驗(yàn)室西花薊馬轉(zhuǎn)錄組序列為參照，對(duì)預(yù)測(cè)到的西花薊馬GABAR家族基因序列進(jìn)行校正，同時(shí)在NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLASTX的方法進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室西花薊馬基因組，查詢(xún)8個(gè)GABAR基因所在染色體及其位置，使用在線工具M(jìn)G2C(http:∥mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)對(duì)西花薊馬GABAR基因進(jìn)行染色體定位分析。

1.3 GABAR家族基因的克隆及測(cè)序

采用Trizol(Trizol?Reagent RNA Extraction Kit, Invitrogen)法分別提取Ivf03和NIL-R品系 3日齡成蟲(chóng)總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000對(duì)RNA的完整性、濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，使用cDNA合成試劑盒(PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit, TaKaRa)分別合成cDNA。根據(jù)1.2節(jié)獲得的GABAR家族基因序列信息設(shè)計(jì)引物(表1)，根據(jù)Q5超保真聚合酶(New England BioLabs)說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)體系(25 μL): 5×Q5 Reaction Buffer 5 μL, dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL, 5×Q5 High GC Enhancer(Optional)5 μL, Nuclease-Free Water 11.25 μL。PCR反應(yīng)程序: 98℃ 30 s; 98℃ 10 s, 60℃ 30 s, 72℃ 90 s～4 min, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 生物信息學(xué)分析

采用MEGA6.0軟件鄰接法(neighbor-joining method)(Tamuraetal., 2013)對(duì)1.3節(jié)克隆驗(yàn)證的西花薊馬GABAR基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，bootstrap值設(shè)為1 000。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載膜翅目、鞘翅目、雙翅目、鱗翅目、同翅目和纓翅目等其他物種的GABAR基因，選取黑腹果蠅、二化螟Chilosuppressalis和東亞飛蝗Locustamigratoria的nAChR基因作為外圍參照基因。利用Meme在線程序(http:∥meme-suite.org/tools/meme)對(duì)西花薊馬GABAR蛋白保守功能基序(motif)進(jìn)行分析。使用ExPASy(Gasteigeretal., 2003)和PSORT(Tamura and Akutsu, 2007)工具對(duì)西花薊馬的GABAR基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)、帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)、不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)、脂肪族氨基酸指數(shù)(aliphatic index)和親疏水性進(jìn)行分析以及對(duì)蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用DANMAN軟件對(duì)Ivf03和NIL-R品系克隆獲得的FoRDL, FoLCCH3和FoGRD基因序列進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)以已知黑腹果蠅、意大利蜜蜂和赤擬谷盜Triboliumcastaneum相應(yīng)基因序列為參照。利用軟件ClustalW2(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進(jìn)行基因序列相似性分析，使用在線軟件SignalP(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，采用TMHMM軟件(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)。

1.5 GABAAR亞基基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)

利用qPCR技術(shù)測(cè)定Ivf03品系不同發(fā)育階段(1-2齡若蟲(chóng)、蛹和3日齡成蟲(chóng))和NIL-R品系3日齡成蟲(chóng)的FoRDL,FoLCCH3和FoGRD相對(duì)表達(dá)量。在解剖鏡下用解剖針將若蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)分別挑至1.5 mL離心管中，樣品收集后立即置于液氮中冷凍，提取總RNA，cDNA合成方法同1.3節(jié)。FoRDL的定量引物參照Meng等(2018)，F(xiàn)oLCCH3和FoGRD的定量引物采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)(表1)。qPCR在 Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System上進(jìn)行，反應(yīng)體系(20 μL): 2×FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)10 μL, cDNA模板1 μL, 正反向引物(10 pmol/μL)各0.6 μL, 50×ROX Reference Dye 0.4 μL, RNase-Free ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。選擇琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDHA)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)基因作為內(nèi)參基因(Cifuentesetal., 2012)，以?xún)蓚€(gè)內(nèi)參基因Ct值的幾何平均值校正目的基因的表達(dá)水平(Vandesompeleetal., 2002)，采用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)蟲(chóng)態(tài)設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)1-2齡若蟲(chóng)和蛹約200頭，成蟲(chóng)約100頭；每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置4個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.6 FoRDL的RNAi

根據(jù)1.5節(jié)定量測(cè)定的結(jié)果，F(xiàn)oLCCH3和FoGRD的表達(dá)量在敏感和抗性品系中無(wú)顯著差異，而FoRDL在抗性品系中表達(dá)量顯著低于敏感品系，因此對(duì)FoRDL進(jìn)行了RNAi實(shí)驗(yàn)。使用 T7 RiboMAX Express RNAi試劑盒(Promega, Madison, WI美國(guó))，按照說(shuō)明書(shū)合成dsFoRDL(處理組)和dsEGFP(對(duì)照組)，引物序列見(jiàn)表1。取敏感品系西花薊馬3日齡成蟲(chóng)約50頭置于干擾裝置內(nèi)，采用飼喂法進(jìn)行干擾，具體操作方法參照袁江江等(2018)。分別在干擾12, 24, 36, 48和72 h后收集樣品，檢測(cè)沉默效率。處理組和對(duì)照組均設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)為50頭成蟲(chóng)；每個(gè)重復(fù)設(shè)置4個(gè)技術(shù)重復(fù)。FoRDL的表達(dá)量的檢測(cè)方法參照1.5節(jié)。采用葉管藥膜法(龔佑輝等, 2010; 王澤華等, 2011)收集處理組和對(duì)照組干擾24 h存活的成蟲(chóng)，使用含有0.1%曲拉通X-100的蒸餾水將2.5%多殺霉素分別配制成0.250和0.400 mg/L兩個(gè)濃度，藥劑處理48 h后分別統(tǒng)計(jì)并計(jì)算處理組和對(duì)照組的死亡率。處理組和對(duì)照組均設(shè)計(jì)10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理約20頭成蟲(chóng)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS Statistics 19軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)FoRDL,FoLCCH3和FoGRD在西花薊馬敏感和抗性品系中的表達(dá)量以及RNA干擾FoRDL后基因相對(duì)表達(dá)量和成蟲(chóng)死亡率差異進(jìn)行分析；采用單因素方差分析及最小顯著差法(LSD)分析FoRDL,FoLCCH3和FoRGD在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 西花薊馬GABAR家族基因鑒定及生物信息學(xué)特征

克隆獲得8個(gè)GABAR基因FoRDL,FoLCCH3,FoGRD,FoGRD-like1,FoGRD-like2,FoB1,FoB2和FoB-like(GenBank登錄號(hào): MH148151-MH148158)的全長(zhǎng)序列，ORF長(zhǎng)度介于1 080～3 720 bp之間，包括5個(gè)GABAAR亞基基因和3個(gè)GABABR基因，分布于6條染色體上，其中FoLCCH3,FoGRD和FoGRD-like2分布在3號(hào)染色體上，F(xiàn)oGRD-like1,FoB2,FoB-like,FoB1和FoRDL依次分布在6, 7, 10, 13和14號(hào)染色體上(圖1)。

圖1 西花薊馬GABAR基因在染色體上的分布Fig. 1 Distribution of GABAR genes on chromosomes of Frankliniella occidentalis

8個(gè)GABAR基因所編碼的氨基酸數(shù)目介于360～1 240之間，所編碼的蛋白分子量介于41.88～137.84 kD之間，等電點(diǎn)介于8.04～9.62之間，表明這8個(gè)蛋白呈堿性。此外，蛋白帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)范圍為33～138，帶正電荷的殘基總數(shù)范圍為44～141，不穩(wěn)定指數(shù)范圍為37.81～49.75，脂肪族氨基酸指數(shù)范圍為73.18～97.81；除FoRDL和FoB-like為疏水性蛋白質(zhì)，其余的均為親水性蛋白質(zhì)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明，所有GABAR蛋白均分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

2.2 西花薊馬GABAR基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

由系統(tǒng)進(jìn)化分析可知，西花薊馬8個(gè)GABAR基因與其他昆蟲(chóng)物種相對(duì)應(yīng)的GABAR基因聚類(lèi)，具有很高的保守性。西花薊馬GABAR不同基因的親緣關(guān)系不同：對(duì)于RDL亞基，西花薊馬所屬的纓翅目與膜翅目昆蟲(chóng)的親緣關(guān)系較近，而與鱗翅目昆蟲(chóng)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)；對(duì)于LCCH3亞基，西花薊馬與等翅目白蟻Cryptotermessecundus親緣關(guān)系較近，與膜翅目麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2)；對(duì)于GRD亞基，西花薊馬與雙翅目果蠅Drosophilanavojoa親緣關(guān)系較近，F(xiàn)oGRD-like1和FoGRD-like2與鱗翅目玉米螟Ostriniafurnacalis親緣關(guān)系較近(圖2)；對(duì)于B亞基，西花薊馬的B1和B2亞基均與同屬薊馬科的棕櫚薊馬Thripspalmi親緣關(guān)系最近(圖2)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的昆蟲(chóng)GABAR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of insect GABAR proteins based on amino acid sequences by neighbor-joining method (1 000 replicates)GABAR蛋白來(lái)源物種Origin species of GABAR proteins: Fo: 西花薊馬Frankliniella occidentalis; Dm: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster; Md: 家蠅Musca domestica; Cc: 實(shí)蠅Ceratitis capitata; Zc: 瓜實(shí)蠅Zeugodacus cucurbitae; Dn: Drosophila navojoa; Lc: 銅綠蠅 Lucilia cuprina; Tc: 赤擬谷盜Tribolium castaneum; Fa: 阿里山潛蠅繭蜂 Fopius arisanus; Am: 意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica; Nv: 麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asonia vitripennis; Ob: 雙角壁蜂Osmia bicornis; Bm: 家蠶Bombyx mori; Bma: 野桑蠶Bombyx mandarina; Px: 小菜蛾P(guān)lutella xylostella; Sl: 斜紋夜蛾Spodoptera litura; Aa: 黑斑蚊Aedes aegypti; Ld: 馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsa decemlineata; Cfe: 貓櫛頭蚤Ctenocephalides felis; Of: 亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis; Pp: 螢火蟲(chóng)Photinus pyralis; Dv: 西方玉米根蟲(chóng)Diabrotica virgifera; Sfl: 蔗黃偽毛蚜Sipha flava; Nf: 黃褐尼氏蟻Nylanderia fulva; Bl: 銹腹實(shí)蠅Bactrocera latifrons; Cs: 白蟻Cryptotermes secundus; Ac: 中華蜜蜂Apis cerana; Mp: 法老小家蟻Monomorium pharaonis; Da: 嗜鳳梨果蠅Drosophila ananassae; Tpr: 短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum; Sf: 草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda; Ha: 茄夜蛾Helicoverpa armigera; Dp: 黑脈金斑蝶Danaus plexippus; Tp: 棕櫚薊馬Thrips palmi; Pa: 美洲大蠊Periplaneta americana; Cf: 多胚跳小蜂Copidosoma floridanum; Cl: 溫帶臭蟲(chóng)Cimex lectularius; Dq: 方頭恐猛蟻Dinoponera quadriceps; Wa: 金刻沃氏蟻Wasmannia auropunctata; Obr: 鋸針蟻Odontomachus brunneus; Ve: 扁胸切葉蟻Vollenhovia emeryi; Si: 紅火蟻Solenopsis invicta; Tz: 皺切葉蟻Trachymyrmex zeteki; Cco: 駝切葉蟻Cyphomyrmex costatus; Ae: 頂切葉蟻Acromyrmex echinatior; Ace: 六刺芭切葉蟻Atta cephalotes; Ld: 馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsa decemlineata; At: 小蜂窩甲蟲(chóng)Aethina tumida; Nl: 稻褐飛虱Nilaparvata lugens; Dno: 汗蜂Dufourea novaeangliae; Ah: 小斑草眼蝶Aphantopus hyperantus; Cse: 白蟻Cryptotermes secundus; Obi: 畢氏卵角蟻Ooceraea biroi; Csu: 畢氏卵角蟻Ooceraea biroi; Lm: 飛蝗Locusta migratoria.

通過(guò)motif分析和進(jìn)化樹(shù)聚類(lèi)結(jié)果可知，西花薊馬GABAAR和GABABR氨基酸序列均存在高度一致性。西花薊馬GABAAR亞基FoGRD, FoGRD-like1和FoGRD-like2聚類(lèi)在一起，F(xiàn)oRDL和FoLCCH3聚類(lèi)在一起，這5個(gè)亞基氨基酸序列的保守基序類(lèi)型、排序均一致。GABABR亞基FoB1, FoB2和FoB-like氨基酸序列的保守基序一致，但是FoB2在其蛋白質(zhì)后端又分布4個(gè)Motif 8保守基序(圖3)。

圖3 西花薊馬GABAR基因保守功能基序分析Fig. 3 Analysis of conserved motifs of GABAR genes in Frankliniella occidentalis

2.3 FoRDL, FoLCCH3和FoGRD氨基酸序列比對(duì)與結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)比較Ivf03和NIL-R品系FoRDL, FoLCCH3和FoGRD的氨基酸序列，未發(fā)現(xiàn)序列差異。西花薊馬與其他昆蟲(chóng)的GABAR亞基RDL, LCCH3和GRD氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明，3個(gè)GABAAR亞基均屬于半胱氨酸環(huán)配體門(mén)控離子通道超家族，3個(gè)亞基之間具有典型的共同特征，每個(gè)亞基均具有6個(gè)N端胞外區(qū)環(huán)結(jié)構(gòu)(loop A-F)，以及4個(gè)跨膜區(qū)(TM 1-4)，在不同昆蟲(chóng)間結(jié)構(gòu)相似度高，且這些環(huán)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)的氨基酸序列具有很高的保守性(圖4-6)。此外，RDL在loop D結(jié)構(gòu)的上游存在可變剪切位點(diǎn)(圖4)，對(duì)Ivf03和NIL-R品系的FoRDL測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在兩個(gè)品系中均存在3種形式剪切體，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室基因組數(shù)據(jù)表明，此3種形式是由于FoRDL外顯子3的互斥剪切所致。

圖4 西花薊馬FoRDL與其他昆蟲(chóng)的RDL亞基的氨基酸序列比對(duì)Fig. 4 Amino acid sequence alignment of FoRDL of Frankliniella occidentalis and RDL subunits from other insectsRDL亞基來(lái)源物種和GenBank登錄號(hào)Origin species and GenBank accession numbers of RDL subunits: DmRDL: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster, NP_729461; TcRDL: 赤擬谷盜Tribolium castaneum, NP_001107808; AmRDL: 意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica, XP_006565167.1. ☆表示相同的氨基酸殘基Showing the identical amino acid residues; ■表示相似的氨基酸殘基Showing the similar amino acid residues.

圖5 西花薊馬FoLCCH3與其他昆蟲(chóng)的LCCH3亞基的氨基酸序列比對(duì)Fig. 5 Amino acid sequence alignment of FoLCCH3 of Frankliniella occidentalis and LCCH3 subunits from other insectsLCCH3亞基來(lái)源物種和GenBank登錄號(hào)Origin species and GenBank accession numbers of LCCH3 subunits: DmLCCH3: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster, NP_996469.1; TcLCCH3: 赤擬谷盜Tribolium castaneum, NP_001103251.1; AmLCCH3: 意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica, XP_026298398.1. ☆表示相同的氨基酸殘基Showing the identical amino acid residues; ■表示相似的氨基酸殘基Showing the similar amino acid residues.

圖6 西花薊馬FoGRD與其他昆蟲(chóng)的GRD亞基的氨基酸序列比對(duì)Fig. 6 Amino acid sequence alignment of FoGRD of Frankliniella occidentalis and GRD subunits from other insectsGRD亞基來(lái)源物種和GenBank登錄號(hào)Origin species and GenBank accession numbers of GRD subunits: DmGRD: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster, NP_524131.1; TcGRD: 赤擬谷盜Tribolium castaneum, NP_001107772.1; AmGRD: 意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica, NP_001292813.1. ☆表示相同的氨基酸殘基Showing the identical amino acid residues; ■表示相似的氨基酸殘基Showing the similar amino acid residues.

2.4 FoRDL, FoLCCH3和FoGRD在不同齡期的表達(dá)模式

FoRDL,FoLCCH3和FoGRD在西花薊馬敏感品系的1-2齡若蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)中均有表達(dá)，且均在成蟲(chóng)中表達(dá)量最高。其中FoRDL的表達(dá)量隨著西花薊馬的發(fā)育而顯著升高(P<0.05)(圖7: A)；FoLCCH3在1-2齡若蟲(chóng)和蛹中表達(dá)水平相近，都顯著低于成蟲(chóng)(P<0.05)(圖7: B)；FoGRD在成蟲(chóng)和蛹中表達(dá)水平較高且二者水平相近，在1-2齡若蟲(chóng)中表達(dá)水平相近且均顯著低于蛹或成蟲(chóng)(P<0.05)(圖7: C)。FoRDL在抗性品系中表達(dá)量顯著低于敏感品系(P<0.05)(圖7: D)，而FoLCCH3和FoGRD的表達(dá)量在兩品系間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖7: E, F)。

圖7 FoRDL, FoLCCH3和FoGRD在西花薊馬多殺霉素敏感品系Ivf03不同發(fā)育階段(A, B和C)及敏感品系Ivf03和抗性品系(NIL-R)成蟲(chóng)期(D, E和F)的相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 Relative expression levels of FoRDL, FoLCCH3 and FoGRD in the spinosad susceptible strain ofFrankliniella occidentalis (Ivf03) at different developmental stages (A, B and C) and in the Ivf03 strainand the spinosad resistant strain (NIL-R strain) at the adult stage (D, E and F)Ivf03: 西花薊馬多殺霉素敏感品系Spinosad susceptible strain of F. occidentalis; NIL-R: 西花薊馬多殺霉素抗性近等基因系品系Near-isogenic line of the spinosad resistant strain of F. occidentalis; N1: 1齡若蟲(chóng)1st instar nymph; N2: 2齡若蟲(chóng)2nd instar nymph; P: 蛹Pupa; A: 成蟲(chóng)Adult. 圖中柱表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同字母表示不同發(fā)育階段基因表達(dá)量顯著性差異(P<0.05, LSD)，柱上星號(hào)表示品系間差異顯著(P<0.05, 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))。Data in the figures are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level (P<0.05, LSD) among different developmental stages, and asterisk above bars indicates significant difference (P<0.05, independent samples t-test) between the strains.

2.5 FoRDL的RNAi及干擾后對(duì)多殺霉素的敏感性

西花薊馬敏感品系3日齡成蟲(chóng)飼喂dsFoRDL12和24 h后，F(xiàn)oRDL的表達(dá)量分別下調(diào)34.11%和45.16%，與對(duì)照組dsEGFP比較差異顯著(P<0.05)，在飼喂36, 48和72 h后，F(xiàn)oRDL的表達(dá)量無(wú)顯著種群差異(P>0.05)(圖8: A)。干擾24 h后，西花薊馬對(duì)多殺霉素的敏感性顯著降低，在0.250和0.400 mg/L處理濃度下，其死亡率分別從對(duì)照組的38.80%和50.12%顯著降低到17.15%和28.57%(P<0.05)，即分別比對(duì)照下降了55.80%和43.00%(圖8: B)。

圖8 西花薊馬3日齡成蟲(chóng)中FoRDL RNAi后FoRDL的相對(duì)表達(dá)量(A)和FoRDL RNAi后再進(jìn)行多殺霉素處理后的成蟲(chóng)死亡率(B)Fig. 8 Relative expression levels of FoRDL after RNAi of FoRDL in the 3-day-old adults of Frankliniella occidentalis (A)and the mortality rate of adults after treatment with spinosad following RNAi of FoRDL (B)dsEGFP: 對(duì)照組Control group; dsFoRDL: 處理組Treatment group. 圖中柱表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號(hào)表示差異顯著(P<0.05, 獨(dú)立樣本t檢驗(yàn))。Data in the figures are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference (P<0.05, independent samples t-test).

3 討論

本研究通過(guò)檢索西花薊馬基因組GABAR家族基因，鑒定到5個(gè)GABAAR亞基基因和3個(gè)GABABR基因；西花薊馬FoRDL,FoLCCH3和FoGRD編碼的氨基酸序列具有昆蟲(chóng)GABAAR亞基的典型結(jié)構(gòu)；FoRDL外顯子3存在著3種互斥剪切，它們可以形成3種不同的剪接體。RDL亞基的選擇性剪切存在于多種昆蟲(chóng)中，黑腹果蠅體內(nèi)的RDL亞基，外顯子3和外顯子6可通過(guò)選擇性剪接編碼形成4個(gè)不同的多態(tài)片段(Ffrench-Constant and Rocheleau, 1993)。在家蠶、意大利蜜蜂、赤擬谷盜和麗蠅蛹集金小蜂等昆蟲(chóng)中都存在RDL亞基外顯子3和外顯子6的不同的剪接形式(Jones and Sattelle, 2008; Jonesetal., 2010; Yuetal., 2010)。mRNA選擇性剪切豐富了生物進(jìn)化的方式，是形成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能多樣性的重要機(jī)制，然而對(duì)昆蟲(chóng)RDL亞基不同剪接體的功能有待進(jìn)一步研究。

昆蟲(chóng)的GABAAR作為殺蟲(chóng)劑的重要作用靶標(biāo)，與乙酰膽堿酯酶、鈉離子通道類(lèi)似，一直是毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)。昆蟲(chóng)的GABAR主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉連接處(Bloomquist, 2001)，介導(dǎo)神經(jīng)和肌肉細(xì)胞中快速的抑制性突觸傳遞。西花薊馬GABAAR亞基基因FoRDL,FoLCCH3和FoGRD在敏感品系的各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)。雖然3個(gè)基因的表達(dá)模式有所不同，但是隨著齡期的增長(zhǎng)，表達(dá)量均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)(圖7)。Wei等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，灰飛虱Laodelphaxstriatellus的RDL,GRD和LCCH3在其整個(gè)發(fā)育階段均有存在且隨著齡期的增長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)量有著先降低后升高的趨勢(shì)，表明GABAAR亞基基因在不同昆蟲(chóng)中表達(dá)模式有所不同。此外，GABAAR亞基基因在昆蟲(chóng)不同組織部位表達(dá)量也存在較大差異。小菜蛾和甜菜夜蛾兩種昆蟲(chóng)頭部的GABAAR亞基基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于胸部和腹部(周小毛等, 2006; Shangetal., 2009)，灰飛虱頭部GABAAR亞基基因的表達(dá)量也顯著高于胸部、腹部和足部(Weietal., 2015)。這可能與昆蟲(chóng)GABAAR主要存在于昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)。

對(duì)于昆蟲(chóng)GABAR在抗藥性形成中的作用研究表明，黑腹果蠅對(duì)狄氏劑產(chǎn)生抗性與GABAR的RDL亞基A2′S和A2′G突變有關(guān)(Leeetal., 1993)。且在抗狄氏劑等環(huán)戊二烯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的德國(guó)小蠊Blattellagermanica、赤擬谷盜、小菜蛾等昆蟲(chóng)的RDL亞基中均發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似黑腹果蠅的A2′S和A2′G突變(Miyazakietal., 1995; Yuanetal., 2010; Gondhalekar and Scharf, 2012)。灰飛虱對(duì)氟蟲(chóng)腈產(chǎn)生抗性與GABAAR RDL高頻率的A2′N(xiāo)突變有關(guān)(Nakaoetal., 2011)。Wei等(2015)對(duì)灰飛虱氟蟲(chóng)腈敏感品系和抗性品系的GABAAR的RDL亞基進(jìn)行基因沉默后，使其對(duì)氟蟲(chóng)腈的敏感性分別降低了30%和27%，驗(yàn)證了RDL亞基作為氟蟲(chóng)腈靶標(biāo)受體的功能。本研究比較了西花薊馬多殺霉素敏感和抗性品系的GABAAR亞基(FoRDL, FoLCCH3和FoGRD)氨基酸序列，未發(fā)現(xiàn)這些亞基在敏感和抗性品系中存在序列差異，但FoRDL的表達(dá)量在抗性品系中顯著低于敏感品系(圖7)。同時(shí)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾西花薊馬敏感品系FoRDL后進(jìn)行生物測(cè)定，其成蟲(chóng)死亡率顯著降低(圖8)，由此推測(cè)西花薊馬GABAAR 的RDL 亞基可能與多殺霉素抗性有關(guān)。

目前昆蟲(chóng)對(duì)多殺霉素的抗性機(jī)制主要包括細(xì)胞色素P450s、多功能氧化酶(MFO)介導(dǎo)的代謝增強(qiáng)(Wangetal., 2006; Reyesetal., 2012; Rehan and Freed, 2014)和nAChR α6亞基的變異(Puineanetal., 2013; Silvaetal., 2016; Wanetal., 2018)。GABAR是多殺霉素的作用靶標(biāo)之一，本研究表明西花薊馬GABAAR的RDL亞基基因可能參與了其對(duì)多殺霉素的抗性形成。這為我們深入了解西花薊馬對(duì)多殺霉素的抗性機(jī)制，及為西花薊馬的抗性治理和科學(xué)防控提供了理論依據(jù)。