陳雅茹, 楊洪佳, 李 澤, 車進(jìn)明,2, 王澤群, 樊 東,*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 哈爾濱 150030; 2. 桂應(yīng)祥沙里院農(nóng)業(yè)大學(xué), 朝鮮平壤 95003)

在節(jié)肢動(dòng)物中，絲氨酸蛋白酶(serine protease)及其同源蛋白是蛋白酶中的一個(gè)超家族，其成員包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶，數(shù)量占全部蛋白酶的2/3，這些蛋白酶都是維持生物體正常生命活動(dòng)不可或缺的，且受絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteinase inhibitor, SPI)的嚴(yán)格調(diào)控(趙麗芳等, 2016)。Kazal型SPI(Kazal-type serine proteinase inhibitor, KaSPI)是最為保守的一類，其廣泛的生物學(xué)功能使其成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)(van Hoefetal., 2013)。在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Niimietal., 1999)、大錐蝽Panstrongylusmegistus(Meiseretal., 2010)、東方蜜蜂Apiscerana(Kimetal., 2013)、埃及伊蚊Aedesaegypti(Torquatoetal., 2017)等30余種昆蟲中發(fā)現(xiàn)了KaSPI，主要作用于對(duì)絲氨酸蛋白酶的調(diào)節(jié)，從而影響昆蟲正常的生長(zhǎng)發(fā)育(Gubbetal., 2010)。如在家蠶Bombyxmori絲腺中的包含3個(gè)Kazal結(jié)構(gòu)域的BmKaSPI能有效抑制枯草桿菌蛋白酶，推測(cè)其在家蠶抵抗病原體入侵方面發(fā)揮著重要作用(Zhengetal., 2007)；從麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis毒液中克隆獲得兩個(gè)Kazal類絲氨酸蛋白酶抑制劑基因NvKSPI-1和NvKSPI-2。NvkSPI-1能抑制胰蛋白酶的活性，而NvKSPI-2對(duì)胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K 3種絲氨酸酶的活性均無影響(Qianetal., 2015)。來自蜜蜂毒液的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑不僅抑制枯草桿菌蛋白酶A和枯草桿菌蛋白酶K，而且還表現(xiàn)出對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和真菌的抗菌活性(Yangetal., 2017)。在其他昆蟲中，KaSPIs還有助于保護(hù)昆蟲免受微生物蛋白酶或宿主消化蛋白酶的侵害，同時(shí)還參與食物消化、凝血、抑菌作用以及先天免疫反應(yīng)(Soaresetal., 2015; Gonellaetal., 2019)。

大豆蚜Aphisglycines隸屬于半翅目蚜科(Aphididae)，與其他昆蟲不同，蚜蟲基因組缺失大量的免疫相關(guān)基因(Gerardoetal., 2010)。盡管如此，蚜蟲的免疫系統(tǒng)仍能夠有效地對(duì)抗病原菌的入侵(Parkeretal., 2017)。為深入揭示絲氨酸蛋白酶抑制劑KaSPI在病原真菌侵染大豆蚜過程中的作用，本研究克隆了大豆蚜KaSPI基因cDNA的序列，對(duì)該基因進(jìn)行RNAi后利用蠟蚧刺束梗孢菌Akanthomyceslecanii(簡(jiǎn)稱蠟蚧菌)侵染大豆蚜，以探究KaSPI在昆蟲病原真菌侵染大豆蚜中的作用，為進(jìn)一步利用KaSPI通過生物技術(shù)手段防治害蟲奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試?yán)ハx：本實(shí)驗(yàn)所用大豆蚜來源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)實(shí)驗(yàn)示范基地。以盆栽大豆苗(黑農(nóng)54)為寄主，在無任何殺蟲劑接觸的條件下置于人工氣候箱中培養(yǎng)，溫度為25±2℃，相對(duì)濕度為70%±5%，光周期為14L∶10D。每隔一周接到新的大豆葉片上。

供試菌株：蠟蚧刺束梗孢菌(菌種編號(hào)BNCC336750)購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。購(gòu)買的凍干菌粉經(jīng)復(fù)蘇，在PDA培養(yǎng)基上活化1～2代，接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d，待菌株充分產(chǎn)孢后保存于4℃冰箱中，備用。

1.2 Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆及氨基酸序列分析

在無菌操作臺(tái)中分別收集未接觸任何藥劑的1-4齡大豆蚜若蟲和成蟲于1.5 mL EP管中，提取RNA，按ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，由安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出大豆蚜Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因AgKaSPI，在NCBI(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進(jìn)行同源性比對(duì)后，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)全長(zhǎng)序列引物AgKaSPI-Full-F/AgKaSPI-Full-R(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(25 μL): 10×Easy Taq Buffer 2.5 μL, 大豆蚜成蟲cDNA 0.5 μL, 上下游引物(10 umol/L)各1 μL, High Pure dNTPs 2.5 μL, Easy Taq DNA Polymerase 0.5 μL, ddH2O 17 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸4 min, 35個(gè)循環(huán)；最后72℃保存10 min。將產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，由哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司測(cè)序后與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的基因進(jìn)行對(duì)比，對(duì)克隆得到的AgKaSPI基因序列進(jìn)行準(zhǔn)確性校對(duì)。利用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)AgKaSPI開放閱讀框并翻譯成氨基酸序列。利用ExPASy網(wǎng)站(http:∥ca.expasy.org/tools/)的compute pI/Mw工具軟件預(yù)測(cè)氨基酸的等電點(diǎn)和分子量，利用Signal P 4.1Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽。利用SMART在線網(wǎng)站(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域；在NCBI網(wǎng)站搜索昆蟲KaSPI氨基酸序列，利用MEGA 5.1軟件中鄰接(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 AgKaSPI基因在大豆蚜不同齡期的表達(dá)模式分析

分別選取大豆蚜1-4齡若蟲和成蟲，30頭個(gè)體為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用TRIzol法提取大豆蚜總RNA，每100 mg組織加入1 mL TRIzol?Reagent。提取的總RNA用紫外分光光度檢測(cè)，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度和濃度，檢測(cè)合格后放入-80℃冰箱備用。取4 μg總RNA，按照ReverTra Ace qPCR RT Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈，-20℃保存。

根據(jù)1.2節(jié)克隆的AgKaSPIcDNA序列和內(nèi)參基因18S rRNA基因(Bansaletal., 2012)設(shè)計(jì)qRT-PCR引物AgKaSPI-qPCR-F/AgKaSPI-qPCR-R和18SrRNA-qPCR-F/18SrRNA-qPCR-R(表1)，大豆蚜不同發(fā)育階段的cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR，用熒光染料SYBR Primer Script RT-PCR Kit Mix(TOYOBO，日本)在Bio-Rad熒光定量PCR儀通過三步法進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系(20 μL): SYBR qPCR Mix 10 μL, 上下游引物(10 pmol/μL)各0.6 μL, cDNA 2 μL, ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序: 94℃ 1 min; 95℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40個(gè)循環(huán)。每發(fā)育階段3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.4 蠟蚧刺束梗孢菌侵染及AgKaSPI表達(dá)響應(yīng)測(cè)定

供試孢子液的配制：收集1.1節(jié)已經(jīng)在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)好的蠟蚧刺束梗孢菌分生孢子，經(jīng)過濾后，用含0.1%吐溫80的無菌水分別配成1×108, 1×107, 1×106, 1×105和1×104孢子/mL的孢子懸浮液各50 mL備用，含0.1%吐溫80的無菌水作空白對(duì)照，采用浸漬法(Feng and Johnson, 1991)處理大豆蚜成蟲。連續(xù)觀察7 d，計(jì)算LC50，以此濃度浸漬法處理大豆蚜成蟲3, 6, 12, 24, 48和72 h，以含0.1%吐溫80的水溶液處理為對(duì)照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取30頭大豆蚜為一個(gè)生生物學(xué)重復(fù)，設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在液氮中快速冷凍并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。qRT-PCR(反應(yīng)體系與條件同1.3節(jié)，下同)檢測(cè)大豆蚜經(jīng)蠟蚧刺束梗孢菌侵染大豆蚜處理不同時(shí)間點(diǎn)AgKaSPI的表達(dá)，引物序列見表1。

1.5 AgKaSPI的RNAi

使用的AgKaSPI的siRNA(siAgKaSPI)和陰性對(duì)照(negative control, NC)siRNA(siNC)均是長(zhǎng)度為21～23 bp的一段序列，由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成，均稀釋成濃度為20 μmol/L備用，陰性對(duì)照是與靶基因無同源性且在大豆蚜體內(nèi)沒有生物學(xué)效應(yīng)的基因序列，引物序列見表1。基于預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將納米載體SPc(由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲學(xué)系沈杰教授課題組提供)和siRNA以1∶1的體積比混合，然后加入總體積10%的洗滌劑(購(gòu)自立白集團(tuán), 廣州)到混合液中，渦旋震蕩2～3次，室溫孵育30 min，使其充分結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合體；取健康大豆蚜成蟲置于光學(xué)顯微鏡下，用顯微注射器吸取0.1 μL siRNA/SPc/洗滌劑復(fù)合體溶液，緩緩?fù)瞥鲆旱?，靠近大豆蚜背部，使液滴在表面活性劑作用下貼附于大豆蚜體壁表面，靜置10 min，對(duì)照組滴加等量的siNC。分別在處理3, 6, 12, 24和48 h時(shí)收集30頭大豆蚜成蟲置于1.5 mL EP管中，每處理3次重復(fù)，液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。通過qRT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間的RNAi干擾效率，并記錄RNAi 12, 24, 48和96 h后的大豆蚜成蟲死亡數(shù)和產(chǎn)蚜量。

1.6 AgKaSPI蛋白含量測(cè)定

取1.4節(jié)蠟蚧刺束梗孢菌處理3, 6, 12, 24, 48和72 h及相應(yīng)對(duì)照的大豆蚜成蟲，以及1.5節(jié)siAgKaSPI及siNC陰性對(duì)照處理3, 6, 12, 24和48 h的大豆蚜成蟲置于玻璃勻漿器中研磨5 min，在4℃條件下4 500 r/min離心15 min，收集上清液，即為待測(cè)酶液，備用。利用昆蟲Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)，采用雙抗體夾心法測(cè)定蠟蚧刺束梗孢菌侵染和RNAi后大豆蚜體內(nèi)AgKaSPI蛋白含量的變化，具體操作見說明書。每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每樣品測(cè)定3次技術(shù)重復(fù)。

1.7 絲氨酸蛋白酶活性的測(cè)定

取1.4節(jié)蠟蚧刺束梗孢菌和對(duì)照處理3, 6, 12, 24, 48和72 h的大豆蚜成蟲，以及1.5節(jié)siAgKaSPI和siNC陰性對(duì)照處理 3, 6, 12, 24和48 h的大豆蚜成蟲，利用昆蟲絲氨酸蛋白酶(serine protease)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)，采用雙抗體夾心法分別測(cè)定絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性變化，具體操作見說明書，每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每樣品測(cè)定3次技術(shù)重復(fù)。待測(cè)樣品的總蛋白質(zhì)含量參照Bradford(1976)描述的考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定。樣品折算酶活力=樣品實(shí)際酶活力/樣品的總蛋白質(zhì)含量，以樣品折算酶活力作為結(jié)果中樣品的酶活性。

1.8 RNAi后大豆蚜對(duì)蠟蚧刺束梗孢菌的敏感性變化測(cè)定

取1.5節(jié)siAgKaSPI處理6 h的30頭大豆蚜成蟲，用LC50濃度的蠟蚧刺束梗孢菌的孢子懸浮液，通過浸漬法處理存活的蚜蟲，方法同1.4節(jié)，12, 24, 48和96 h后觀察并記錄死亡情況。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。利用SAS 9.0軟件單因素方差分析Duncan氏多重比較法進(jìn)行各處理下不同時(shí)間點(diǎn)基因的相對(duì)表達(dá)量以及酶活性差異顯著性分析，死亡率的差異顯著性采用t檢驗(yàn)法來分析，顯著性水平設(shè)置為P<0.05。數(shù)值計(jì)算及圖表制作利用Excel 2010進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 AgKaSPI基因序列特征

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)在大豆蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索、NCBI比對(duì)、保守結(jié)構(gòu)域的查找及序列準(zhǔn)確性校正，篩選出1條Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因AgKaSPI的cDNA序列(GenBank登錄號(hào): MK440557)，長(zhǎng)1 019 bp，開放閱讀框?yàn)?24 bp，編碼107個(gè)氨基酸，含有197 bp的5′非編碼區(qū)和498 bp的3′非編碼區(qū)，N端含有21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。ExPASy分析所得氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子量為11.43 kD，等電點(diǎn)為9.24。通過SMART在線軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)AgKaSPI蛋白含有一個(gè)典型的Kazal結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有6個(gè)半胱氨酸殘基(圖1)以特定模式(CysI-CysV, CysII-CysIV和CysIII-CysVI)形成3個(gè)二硫鍵，從而形成緊密的三維構(gòu)象。

圖1 大豆蚜AgKaSPI基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 cDNA and deduced amino acid sequences of AgKaSPI of Aphis glycines起始密碼子ATG和終止密碼子TAA用方框標(biāo)注，信號(hào)肽序列用雙下劃線標(biāo)注，保守半胱氨酸殘基加方框用灰色陰影標(biāo)注。The start codon (ATG) and stop codon (TAA) are boxed. The signal peptides are double underlined. Conserved cysteine residues are indicated by gray shade.

2.2 AgKaSPI與其他昆蟲KaSPI氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

將AgKaSPI的氨基酸序列在NCBI中搜索，與獲得的其他昆蟲的KaSPI氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，AgKaSPI與同屬半翅目蚜科的昆蟲棉蚜Aphisgossypii的ApKaSPI (GenBank登錄號(hào): XP_027843052)、苜蓿蚜Aphiscraccivora的AcKaSPI (GenBank登錄號(hào): KAF0767270)、豌豆蚜Acyrthosiphonpisum的ApKaSPI (GenBank登錄號(hào): NP_001156573)和高粱蚜Melanaphissacchari的MsKaSPI (GenBank登錄號(hào): XP_025194394)等親緣關(guān)系較近，與其他目昆蟲如柞蠶Antheraeapernyi的ApKaSPI (GenBank登錄號(hào): AHZ90949)、家蠶Bombyxmori的BmKaSPI (GenBank登錄號(hào): NP_001040250)和埃及伊蚊Aedesaegypti的AaKaSPI (GenBank登錄號(hào): XP_001658905)等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，昆蟲Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與形態(tài)特征的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系具有一定的相關(guān)性。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的大豆蚜與其他昆蟲KaSPI的系統(tǒng)進(jìn)化樹(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of KaSPI proteins from Aphis glycines and other insectsby neighbor-joining method based on amino acid sequence (1 000 replicates)KaSPI蛋白來源物種Origin species of KaSPI proteins: MpKaSPI: 桃蚜Myzus persicae; DnKaSPI-1: 麥雙尾蚜Diuraphis noxia; SfKaSPI-1: 甘蔗黃蚜Sipha flava; ApKaSPI: 豌豆蚜Acyrthosiphon pisum; AcKaSPI: 苜蓿蚜Aphis craccivora; AgKaSPI: 大豆蚜Aphis glycines; ApKaSPI: 棉蚜Aphis gossypii; MsKaSPI: 高粱蚜Melanaphis sacchari; CcKaSPI: 雪松長(zhǎng)足大蚜Cinara cedri; OsKaSPI: 牛頭嗡蜣螂Onthophagus taurus; DpKaSPI-1, DpKaSPI-2: 中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae; CmKaSPI: 四紋豆象Callosobruchus maculatus; AaKaSPI: 埃及伊蚊Aedes aegypti; PpKaSPI: 靜食白蛉Phlebotomus papatasi; ApKaSPI: 柞蠶Antheraea pernyi; BmKaSPI: 家蠶Bombyx mori.

2.3 AgKaSPI在大豆蚜不同發(fā)育階段的表達(dá)

利用qRT-PCR檢測(cè)大豆蚜1-4齡若蟲以及成蟲體內(nèi)AgKaSPI的表達(dá)水平，結(jié)果表明該基因在大豆蚜不同發(fā)育階段皆有表達(dá)，在1齡若蟲體內(nèi)的表達(dá)量最高，分別為其在2-4齡若蟲體內(nèi)表達(dá)量的1.90, 2.37和2.12倍(P<0.05)，但與在成蟲體內(nèi)的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

圖3 AgKaSPI在大豆蚜不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of AgKaSPI at differentdevelopmental stages of Aphis glycinesN1-N4: 分別為1-4齡若蟲1st-4th instar nymphs, respectively; AD: 成蟲Adult. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示基因表達(dá)量在不同發(fā)育階段間差異顯著(P<0.05, Duncan氏多重比較法)。Data in the figure are means±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the gene expression level at different developmental stages (P<0.05, Duncan’s multiple range test).

2.4 蠟蚧刺束梗孢菌侵染大豆蚜對(duì)AgKaSPI表達(dá)的影響

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)蠟蚧刺束梗孢菌對(duì)大豆蚜室內(nèi)毒力測(cè)定得到的LC50(4.05×106孢子/mL)的孢子懸浮液侵染大豆蚜成蟲，qRT-PCR檢測(cè)大豆蚜感染72 h內(nèi)AgKaSPI的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，侵染12, 24和48 h時(shí)，AgKaSPI表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，分別為對(duì)照組的2.23, 4.31和2.38倍(圖4)，說明蠟蚧刺束梗孢菌侵染誘導(dǎo)了AgKaSPI的表達(dá)。

圖4 蠟蚧刺束梗孢菌侵染大豆蚜成蟲后AgKaSPI的表達(dá)量Fig. 4 Expression levels of AgKaSPI in Aphis glycines adults after infection by Akanthomyces lecanii用對(duì)大豆蚜成蟲LC50為4.05×106孢子/mL的孢子懸浮液進(jìn)行侵染，含0.1%吐溫80的無菌水作空白對(duì)照(CK)。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母表示基因表達(dá)量在不同處理時(shí)間點(diǎn)間差異顯著(P<0.05, Duncan氏多重比較法)。下圖同。The spore suspension with the LC50 value of 4.05×106 spores/mL against A. glycines adults was used for infection, and sterile water containing 0.1% Tween 80 was used as the blank control (CK). Data in the figure are means±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different treatment time points (P<0.05, Duncan’s multiple range test). The same for the following figures.

如圖5所示，經(jīng)蠟蚧刺束梗孢菌侵染12, 24和48 h時(shí)大豆蚜AgKaSPI蛋白含量與對(duì)照組差異均顯著(P<0.05)，分別為對(duì)照組的2.20, 1.69和1.98倍，但經(jīng)蠟蚧刺束梗孢菌侵染72 h時(shí)與對(duì)照組蛋白含量差異不顯著(P>0.05)?？梢娫摶蚩赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶抑制劑的含量來參與大豆蚜對(duì)蠟蚧刺束梗孢菌的免疫應(yīng)答。

2.5 蠟蚧刺束梗孢菌侵染對(duì)大豆蚜成蟲體內(nèi)絲氨酸蛋白酶活性的影響

蠟蚧刺束梗孢菌侵染后大豆蚜成蟲體內(nèi)絲氨酸蛋白酶(圖6: A)、胰蛋白酶(圖6: B)和胰凝乳蛋白酶(圖6: C)活性總體均呈先降低再升高的趨勢(shì)。侵染12, 24和48 h時(shí)，絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性顯著下降(P<0.05);侵染72 h時(shí)酶活力增強(qiáng)，但與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)。結(jié)合圖5和圖6可知，蠟蚧菌可能通過短期誘導(dǎo)AgKaSPI蛋白的過表達(dá)抑制了大豆蚜體內(nèi)絲氨酸蛋白酶的活性。

圖5 蠟蚧刺束梗孢菌侵染對(duì)大豆蚜成蟲體內(nèi)AgKaSPI蛋白含量的影響Fig. 5 Effects of Akanthomyces lecanii infection on the AgKaSPI content in Aphis glycines adults

圖6 蠟蚧刺束梗孢菌侵染對(duì)大豆蚜成蟲絲氨酸蛋白酶(A)、胰蛋白酶(B)和胰凝乳蛋白酶(C)活性的影響Fig. 6 Effects of Akanthomyces lecanii infection on the activities of serine proteinase (A),trypsin (B) and chymotrypsin (C) in Aphis glycines adults

2.6 AgKaSPI的RNAi效果

RNAi后，AgKaSPI基因被成功沉默，AgKaSPI表達(dá)量在干擾6, 12和48 h時(shí)均有不同程度的下降，表達(dá)量分別下降了71.05%, 36.22%和21.05%，且6和12 h時(shí)與對(duì)照組相比差異均顯著(P<0.05)(圖7)。

圖7 RNAi對(duì)大豆蚜成蟲體內(nèi)AgKaSPI表達(dá)的影響Fig. 7 Effects of RNAi on the expression of AgKaSPI in Aphis glycines adultsNC: 陰性對(duì)照Negative control. 下同The same below.

RNAi干擾AgKaSPI24, 48和96 h時(shí)大豆蚜成蟲死亡率處理組與陰性對(duì)照組相比差異均顯著(P<0.05)(表2)，分別增加了5.11%, 8.02%和10.12%。表明AgKaSPI干擾對(duì)大豆蚜具有一定的致死效應(yīng)。

表2 RNAi干擾AgKaSPI后不同時(shí)間大豆蚜成蟲的校正死亡率Table 2 Corrected mortality of Aphis glycines adults at different time after RNAi of AgKaSPI

RNAi干擾AgKaSPI24, 48和96 h時(shí)對(duì)照組大豆蚜每百頭產(chǎn)蚜量分別為449±38, 505±48和749±74頭，處理組分別為400±45, 476±60,和708±78頭，24和96 h時(shí)處理組均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，說明AgKaSPI沉默對(duì)大豆蚜的繁殖具有一定的影響(圖8)。

圖8 AgKaSPI的RNAi對(duì)大豆蚜產(chǎn)蚜量的影響Fig. 8 Effects of RNAi of AgKaSPI on the fecundity of Aphis glycines

為進(jìn)一步研究AgKaSPI在大豆蚜相應(yīng)蠟蚧刺束梗孢菌侵染的代謝中的作用，用雙抗體夾心法檢測(cè)了RNAi干擾AgKaSPI3, 6, 12, 24和48 h時(shí)大豆蚜成蟲體內(nèi)AgKaSPI蛋白含量的變化。如圖9所示，RNAi干擾不同時(shí)間點(diǎn)，AgKaSPI蛋白含量均有不同程度的減少，12和24 h時(shí)AgKaSPI蛋白含量與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，AgKaSPI蛋白含量分別下降了51.11%和44.52%。

圖9 RNAi干擾AgKaSPI對(duì)大豆蚜成蟲體內(nèi)AgKaSPI蛋白含量的影響Fig. 9 Effects of RNAi of AgKaSPI on the AgKaSPI content in Aphis glycines adults

2.7 干擾AgKaSPI對(duì)大豆蚜成蟲體內(nèi)絲氨酸蛋白酶活性的影響

干擾AgKaSPI后絲氨酸蛋白酶(圖10: A)、胰蛋白酶(圖10: B)和胰凝乳蛋白酶(圖10: C)活性總體呈先升高再降低趨勢(shì)。干擾12 h時(shí)，絲氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性開始增加，干擾24 h時(shí)，絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性顯著增強(qiáng)。通過AgKaSPI沉默減少絲氨酸蛋白酶抑制劑的含量可增強(qiáng)大豆蚜絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性，說明AgKaSPI可能通過調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶抑制劑的含量對(duì)絲氨酸蛋白酶進(jìn)行有效的調(diào)控。

圖10 RNAi干擾AgKaSPI對(duì)大豆蚜成蟲體內(nèi)絲氨酸蛋白酶(A)、胰蛋白酶(B)和胰凝乳蛋白酶(C)活性的影響Fig. 10 Effects of RNAi of AgKaSPI on the activities of serine proteinase (A),trypsin (B) and chymotrypsin (C) in Aphis glycines adults

2.8 AgKaSPI沉默對(duì)大豆蚜對(duì)蠟蚧刺束梗孢菌敏感性的影響

AgKaSPI沉默后(RNAi 6 h)的大豆蚜成蟲經(jīng)蠟蚧刺束梗孢菌侵染24, 48和96 h后，大豆蚜成蟲死亡率與對(duì)照組相比差異均顯著(P<0.05)，分別提高了8.90%, 20.88%和21.48%(表3)，證明AgKaSPI沉默后蠟蚧刺束梗孢菌對(duì)大豆蚜的侵染率顯著提高。

表3 RNAi干擾AgKaSPI后蠟蚧刺束梗孢菌侵染大豆蚜成蟲的校正死亡率Table 3 Corrected mortality of Aphis glycines adults after infection by Akanthomyces lecanii following RNAi of AgKaSPI

3 討論

本研究獲得一條大豆蚜的具Kazal結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的cDNA序列，命名為AgKaSPI(GenBank登錄: MK440557)。根據(jù)Aymara最新分類方式(Cabrera-Muozetal., 2019)，AgKaSPI屬于經(jīng)典型KaSPI，其推導(dǎo)的氨基酸序列含有一個(gè)保守的Kazal結(jié)構(gòu)域。

AgKaSPI在大豆蚜不同發(fā)育階段均有表達(dá)(圖3)。昆蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑基因表達(dá)受病原菌正調(diào)控，大豆蚜經(jīng)蠟蚧刺束梗孢菌孢子懸浮液處理后，AgKaSPI基因表達(dá)量顯著上調(diào)(圖4)，AgKaSPI蛋白含量增加(圖5)，絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性受到抑制(圖6)，說明AgKaSPI可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)絲氨酸蛋白酶的活性來參與大豆蚜抵制病原菌的侵入；有研究表明，KaSPI不僅可以調(diào)節(jié)內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶，也可調(diào)控外源性絲氨酸蛋白酶(Wangetal., 2009)，故也可能是AgKaSPI抑制了在蠟蚧刺束梗孢菌感染時(shí)分泌的真菌來源的絲氨酸蛋白酶的活性，使測(cè)得的絲氨酸蛋白酶的活性下降。柞蠶ApKTSPI基因在核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus, NPV)、大腸桿菌Escherichiacoli和白僵菌免疫刺激后表達(dá)量都能上調(diào)(王磊等, 2014)。埃及伊蚊KaSPI在病毒的免疫刺激后表達(dá)量上調(diào)(Soaresetal., 2018)。這些研究結(jié)果均說明昆蟲蛋白酶抑制劑參與了昆蟲的免疫反應(yīng)。

為進(jìn)一步研究AgKaSPI在蠟蚧刺束梗孢菌誘導(dǎo)代謝中的作用，利用RNAi技術(shù)對(duì)AgKaSPI進(jìn)行功能研究。Yan等(2020)采用dsRNA/納米載體/洗滌劑配方，通過體壁滲透法可有效地抑制大豆蚜靶基因(dsATPD+dsATPE)的表達(dá)，沉默效率可達(dá)86.86%，死亡率高達(dá)81.67%。本研究通過將體外合成的siRNA/納米載體/洗滌劑復(fù)合液滴至大豆蚜成蟲的背部進(jìn)行RNAi。qRT-PCR結(jié)果表明AgKaSPI表達(dá)量(圖7)和KaSPI蛋白含量(圖9)均明顯下降，同時(shí)絲氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性顯著增強(qiáng)(圖10)，產(chǎn)蚜量明顯降低(圖8)，說明AgKaSPI沉默會(huì)引起相關(guān)蛋白和酶活性的變化，甚至對(duì)大豆蚜的繁殖產(chǎn)生影響。在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis中也發(fā)現(xiàn)了一種與生殖有關(guān)的Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因Greglin，通過降低蝗蟲雌蟲中Greglin的含量，導(dǎo)致東亞飛蝗卵母細(xì)胞成熟受阻，卵巢生長(zhǎng)停滯和卵泡上皮細(xì)胞萎縮，以及產(chǎn)卵量和孵化率下降，表明該基因參與了蝗蟲的生殖過程(Guoetal., 2019)。本研究中AgKaSPI沉默后進(jìn)行蠟蚧刺束梗孢菌侵染，大豆蚜成蟲的死亡率明顯提高(表3)，推斷AgKaSPI對(duì)蠟蚧刺束梗孢菌具有抑制作用。在其他昆蟲中也報(bào)道了KaSPI的抑菌作用，如在家蠶中發(fā)現(xiàn)包含3個(gè)Kazal結(jié)構(gòu)域的BmSPI能有效抑制枯草桿菌蛋白酶，推測(cè)其在家蠶抵抗病原體入侵方面發(fā)揮著重要作用(Zhengetal., 2007)；蜜蜂AcVSPI可與細(xì)菌和真菌表面結(jié)合，并表現(xiàn)出對(duì)真菌以及革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的抗微生物活性(Kimetal., 2013)，可見昆蟲中KaSPI在抵抗病原菌入侵方面起著重要作用。

本研究測(cè)定分析了蠟蚧刺束梗孢菌處理對(duì)大豆蚜AgKaSPI基因表達(dá)水平以及AgKaSPI酶活性的影響，結(jié)果說明AgKaSPI能夠作為負(fù)調(diào)控因子控制病原真菌對(duì)大豆蚜侵染引起的免疫反應(yīng)。利用體壁滲透法進(jìn)行的RNAi將在病蟲害防治領(lǐng)域顯示出了很大的潛力，將推動(dòng)基于RNAi的害蟲防治的實(shí)踐與發(fā)展。